柯 野，屈奇奇，李昊然

（韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

生物防治是利用生物物種間的相互作用，以一種或一類生物抑制另一種或另一類生物.生物防治不會(huì)污染環(huán)境，可避免大量使用化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的一系列環(huán)境、植保和能源方面的問(wèn)題［1］.木霉（Trichoderma）作為生物防治菌劑，廣泛地應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中.最早對(duì)木霉菌的研究報(bào)道可追溯到1794年.隨著深入地研究，目前已發(fā)現(xiàn)木霉屬有150多種［2］，并且其很多種都應(yīng)用于生物防治生產(chǎn)之中.木霉菌能應(yīng)用于生物防治主要是由于重寄生和產(chǎn)生抗生素的作用.重寄生利用木霉的酶系統(tǒng)識(shí)別、滲透、酶解病原菌寄主的細(xì)胞壁以此獲得營(yíng)養(yǎng)［3］，從而致死病原菌.為了掌握木霉重寄生過(guò)程的酶學(xué)機(jī)理，研究者對(duì)其產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和幾丁質(zhì)脫乙?；傅确矫孀隽溯^多的研究，并且將這些酶的基因序列、酶學(xué)特性、構(gòu)效關(guān)系和應(yīng)用也進(jìn)行了系統(tǒng)性研究［4］，但是對(duì)木霉產(chǎn)生的胞外蛋白酶研究未引起重視.

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)木霉產(chǎn)生的蛋白酶系對(duì)其重寄生具有重要的作用，但對(duì)其作用機(jī)理尚未見(jiàn)深入的研究報(bào)道.2005 年，Suárez M B 等人在對(duì)T.harzianumCECT 2413 胞外蛋白組學(xué)研究過(guò)程中，分離到一個(gè)天冬氨酸內(nèi)肽蛋白酶P6281，并獲得了其結(jié)構(gòu)基因序列［5］.2009年Samolski利用芯片（microarray）技術(shù)發(fā)現(xiàn)在添加幾丁質(zhì)的培養(yǎng)基中，哈茨木霉有大量基因表達(dá)上調(diào)，其中包括P6281蛋白的基因［6］.2013年Szabo發(fā)現(xiàn)在線蟲(chóng)卵上寄生的哈茨木霉中該基因進(jìn)行表達(dá)［7］.由此可見(jiàn)P6281可能是哈茨木霉寄生其他真菌和線蟲(chóng)卵過(guò)程中的一個(gè)重要蛋白酶.在此基礎(chǔ)上，筆者克隆了編碼P6281的cDNA序列，并在畢赤酵母中成功表達(dá)該酶，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和抑菌作用進(jìn)行了相關(guān)的研究.本文對(duì)該重組P6281蛋白酶的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以此來(lái)探究其酶學(xué)性質(zhì)與結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源

哈茨木霉（Trichoderma harzianum）購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心.

1.1.2 試劑

Trizol試劑購(gòu)自 Invitrogen 公司；PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自 TaKaRa 公司；GS115菌株和表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 哈茨木霉菌株的培養(yǎng)及其RNA的提取、P6281基因的克隆表達(dá)

將哈茨木霉菌株的菌絲塊接種于PDA瓊脂平板上，28 ℃、培養(yǎng)2~3 d后；用鑷子挑取平板表面的菌絲體，迅速采用液氮浸泡研磨后，將菌絲體粉末轉(zhuǎn)至Trizol試劑中，按照該試劑的要求提取并鑒定菌體總 RNA；采用 PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（TaKaRa 公司，中國(guó)北京）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA，根據(jù)美國(guó)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道P6281序列（accession：AWV82459），比對(duì)T.harzianum全基因組測(cè)序的相應(yīng)基因序列（accession：NQLC01000310.1），對(duì)其進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（Oligo 6軟件），以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，然后將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)到畢赤酵母GS115中進(jìn)行異源表達(dá).

1.2.2 P6281蛋白酶的序列分析

運(yùn)用Bio-Edit 7.0軟件對(duì)P6281的序列組成、比對(duì)等的分析，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的SignalP 5.0軟件對(duì)酶定位分析，https://swissmodel.expasy.org/網(wǎng)站進(jìn)行同源建模以及模型評(píng)估，VMD 1.9、DeepView等軟件對(duì)其序列的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析.

2 結(jié)果分析

2.1 P6281基因的克隆表達(dá)結(jié)果

通過(guò)提取哈茨木霉總RNA，進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄獲得了cDNA，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增克隆獲得了P6281基因，經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定，然后將其基因亞克隆到表達(dá)載體上，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株中，獲得高效異源表達(dá).

2.2 P6281的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

P6281氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列由386個(gè)氨基酸殘基組成，該序列與NCBI的報(bào)道相比，僅152位點(diǎn)的R殘基突變?yōu)镾殘基.在一級(jí)結(jié)構(gòu)序列中，1~17位序列為信號(hào)肽序列，該序列中富含7個(gè)A殘基，占信號(hào)肽氨基酸殘基總數(shù)41.7%，其切割位點(diǎn)序列為AALA，屬于常見(jiàn)的信號(hào)肽切割X-A-X-A類型［8］，這表明P6281的信號(hào)肽與絕大多數(shù)胞外分泌蛋白的信號(hào)肽切割位點(diǎn)一致.

18~386 位序列為酶原序列，其中18~65位序列為前導(dǎo)肽，該序列輔助蛋白酶適當(dāng)折疊，阻礙蛋白底物與酶的底物結(jié)合區(qū)域結(jié)合，抑制酶原表現(xiàn)出蛋白酶的活性，以此維持酶原的穩(wěn)定性［9］.P6281酶原在加工分泌過(guò)程中，其K32-R33殘基序列，被高爾基體中Kex2蛋白酶識(shí)別，促使其在高爾基體中加工折疊［10］.并且該前導(dǎo)肽在酸性環(huán)境下自動(dòng)地被切除掉，形成有活性的成熟肽［11］.在前導(dǎo)肽序列中，堿性氨基酸殘基高達(dá)11個(gè)，占氨基酸總數(shù)的22.9%，其中K殘基8個(gè)，R殘基3個(gè)，這與其他該類型的天冬氨酸蛋白酶中前導(dǎo)肽富含堿性氨基酸殘基一致［12］；這些堿性氨基酸殘基中，K殘基較為保守，可能與酶原催化位點(diǎn)的天冬氨酸殘基相互作用，以此有助于酶的正確折疊；如Aspergillus niger var.macrosporus產(chǎn)生的aspergillopepsin I中的 K56 殘基對(duì) aspergillopepsin I的正常折疊至關(guān)重要［13］，而在 P6281 中，序列保守的K53殘基可能同樣對(duì)其正常折疊具有重要作用.

P6281成熟肽為66~386位序列，該序列共由321個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，推測(cè)其分子量為32.8 KDa，等電點(diǎn)pI為4.05，該序列中S殘基數(shù)量最多（57個(gè)，占氨基酸總數(shù)的17.76%），T殘基含量較多（40個(gè)，占總數(shù)的12.46%），這兩種氨基酸殘基總量高達(dá)30%，為其他該類酶平均數(shù)量的兩倍［14］；但是這一特性似乎沒(méi)有太大影響其酶學(xué)性質(zhì).M殘基和H殘基數(shù)量最少為0個(gè)，G、S、T、C、Y、N和Q極性氨基酸為179個(gè)，占氨基酸總數(shù)的55.77%；A、V、L、I、F、W、M和P非極性氨基酸殘基數(shù)為105個(gè)，占氨基酸總數(shù)的32.71%.由此可見(jiàn)，P6281的疏水性氨基酸殘基占整個(gè)氨基酸總數(shù)85%以上，這與蛋白酶中疏水性氨基酸殘基數(shù)量所占比例較高相一致，為蛋白酶具有疏水性核心提供了前提保障［11］.一般A1家族的活性位點(diǎn)為保守Asp-Thr-Gly（I）Motif結(jié)構(gòu)，利用http：//www.ebi.ac.uk/interpro/網(wǎng)站的InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)成熟肽序列進(jìn)行分析可知，P6281中具有該Motif結(jié)構(gòu)，分別位于D91-T92-G93和D271-T272-G273，這表明其活性位點(diǎn)殘基分別為D91和D271.一般距活性位點(diǎn)較近，與其相伴的“Gly-疏水殘基-疏水殘基-Gly”Motif結(jié)構(gòu)形成第一個(gè)psi環(huán)，即P6281的第一個(gè)psi（Ⅰ）環(huán)為G162-I163-I164-G165；“Ile-疏水殘基-Gly-Asp/Gln/Asn”Motif結(jié)構(gòu)形成第二個(gè)psi環(huán)，即P6281中的I360-I361-G362-Q363形成的第二個(gè)psi環(huán)（Ⅱ）（見(jiàn)圖1）.該psi環(huán)在A1家族中較為保守，該結(jié)構(gòu)對(duì)于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，特別是維持活性中心的穩(wěn)定具有重要的作用［15］.

圖1 P6281與Irpex lacteus天冬氨酸蛋白酶（PDB code：1wkr.1.A）的序列及其二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.3 P6281的同源建模、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列一致性大于30%情況下可進(jìn)行同源建模的理論，將P6281成熟肽序列提交至https：//swissmodel.expasy.org/網(wǎng)站Modelling Project中進(jìn)行同源性比對(duì)建模；比對(duì)結(jié)果表明，P6281與來(lái)自于 Irpex lacteus的天冬氨酸蛋白酶（PDB code：1wkr.1.A）的序列同源性高達(dá) 49.69%［14］（見(jiàn)圖1），這完全符合同源建模要求；因此，以此建模并對(duì)其評(píng)估檢測(cè)，所建模型中肽鏈主鏈的φ角、ψ角和側(cè)鏈都基本合理，這表明該模型合理（見(jiàn)圖2）.為了便于對(duì)該結(jié)構(gòu)的敘述，本文將成熟肽第一個(gè)氨基酸殘基（G）編號(hào)定為1，其他殘基以此類推編號(hào).據(jù)圖1和圖2可見(jiàn)，P6281同該家族的天冬氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)一樣，由兩個(gè)大小相似的類二重對(duì)稱的N結(jié)構(gòu)域（N-lobe）和C結(jié)構(gòu)域（C-lobe）構(gòu)成，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域主要由反平行的β折疊片層結(jié)構(gòu)和簡(jiǎn)短α 螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成；N-lobe和C-lobe兩者之間的縫隙（即為cleft）成為了底物結(jié)合區(qū)域，兩個(gè)催化殘基（D26和D206）也位于該區(qū)域中，該區(qū)域可以容納7~8個(gè)底物氨基酸殘基，這些氨基酸殘基平均分布在催化殘基的兩旁［16］.P6281和模板1wkr.1.A相比，兩者之間的氨基酸殘基序列存在插入或刪除的短序列或殘基，雖然這些序列或殘基未位于底物結(jié)合區(qū)域，但是對(duì)其酶的穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)具有一定的影響，這也是導(dǎo)致酶學(xué)性質(zhì)差異的原因之一［17］.

2.4 脯氨酸、二硫鍵、氫鍵和Zn離子結(jié)合的分析

脯氨酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中l(wèi)oop環(huán)具有穩(wěn)定作用［18］，由圖1和圖2可知，在模板1wkr的柔性區(qū)域中不僅具有脯氨酸殘基，而且進(jìn)一步形成了3個(gè)絲氨酸和脯氨酸形成的順式肽鍵，該類順式肽鍵對(duì)酶結(jié)構(gòu)具有特殊的功能作用［19］；然而P6281的loop環(huán)的空間結(jié)構(gòu)中未有脯氨酸殘基，更未有順式肽鍵；由此可見(jiàn)，P6281的loop環(huán)穩(wěn)定性和酶學(xué)性質(zhì)與其他該類酶存在差異.

圖2 P6281的帶狀結(jié)構(gòu)模型

二硫鍵、氫鍵以及Zn離子結(jié)合情況是影響天冬氨酸蛋白酶穩(wěn)定性和催化活性的重要因素［20］.在大多數(shù)胃蛋白酶型天冬氨酸蛋白酶中二硫鍵的位置比較保守，如豬胃蛋白酶中有3個(gè)二硫鍵［21］；而P6281具有相對(duì)保守的C34和C40殘基，該兩個(gè)殘基之間的巰基（-SH）相距37.67 nm（一般二硫鍵長(zhǎng)度約為20.5 nm）.因此，P6281很可能在C34和C40之間形成了一個(gè)二硫鍵，而模板1wkr沒(méi)有二硫鍵.根據(jù)軟件DS預(yù)測(cè)P6281的氫鍵數(shù)量為270個(gè)，與其他該類型蛋白酶相比，氫鍵數(shù)量差異不顯著，并且P6281和模板1wkr均未與Zn離子結(jié)合.由此可見(jiàn)P6281的脯氨酸、二硫鍵、氫鍵數(shù)量和Zn結(jié)合情況而言，都直接影響了P6281的熱穩(wěn)定性，與其熱穩(wěn)定性不強(qiáng)具有直接的相關(guān)性.

2.5 底物結(jié)合區(qū)域的分析

酶對(duì)其底物的水解過(guò)程是酶與底物之間通過(guò)氫鍵、鹽鍵、疏水鍵等的作用，酶底物結(jié)合區(qū)域與底物相結(jié)合，然后通過(guò)酸堿催化或共價(jià)催化等作用，將其底物切割斷裂.因此，酶底物結(jié)合區(qū)域的空間結(jié)構(gòu)特征、氨基酸殘基組成和性質(zhì)等方面對(duì)酶的水解特性具有關(guān)鍵性作用.根據(jù)P6281對(duì)酪蛋白、BSA、明膠和大豆分離蛋白等底物的水解結(jié)果可知，P6281對(duì)酪蛋白的水解效果最佳，這與其他該類酶對(duì)疏水性底物具有偏好性的結(jié)果一致，當(dāng)然也存在具體水解效果的差異，這主要體現(xiàn)在底物結(jié)合區(qū)域結(jié)構(gòu)的差異上.對(duì)于P6281蛋白酶的底物結(jié)合區(qū)域，如圖3所示，具體結(jié)構(gòu)特征分析如下.

圖3 P6281的底物結(jié)合區(qū)域

S1底物結(jié)合區(qū)域，是由I24、I98、V55、S56、Y57和G58構(gòu)成的疏水性口袋，其中催化活性殘基D26和D206也在該區(qū)域與底物通過(guò)氫鍵結(jié)合.在S1底物結(jié)合區(qū)域中，底物與這些殘基之間采用氫鍵結(jié)合，同時(shí)活性催化殘基D26和D206也采用氫鍵方式與底物結(jié)合.為了進(jìn)一步穩(wěn)定催化殘基D26和D206與底物結(jié)合體的穩(wěn)定性，催化殘基D26分別與S29和I99之間形成“底物-催化殘基（D26）-S29/I99”的氫鍵聯(lián)合體；同時(shí)催化殘基D206分別與T209和I296之間形成這種氫鍵聯(lián)合體.flap環(huán)是構(gòu)成S1底物結(jié)合區(qū)域的重要組成部分，該環(huán)結(jié)構(gòu)為天冬氨酸蛋白酶的切斷底物提供了一個(gè)疏水的環(huán)境［11］，這對(duì)酶的催化功能具有獨(dú)特的作用.在P6281的flap環(huán)主要由Y57、G58、S59、G60殘基組成，這4個(gè)殘基均為疏水性殘基，這也就為P6281的S1底物結(jié)合區(qū)提供了疏水環(huán)境.一般而言，在霉菌天冬氨酸蛋白酶中的flap環(huán)頂端的D殘基高度保守，該D殘基對(duì)裂解Lys6-Ile7鍵激活胰蛋白酶原，以及與賴氨酸殘基的相互作用中發(fā)揮重要作用（預(yù)測(cè)識(shí)別賴氨酸殘基的殘基并不保守）［14］.在P6281中，flap環(huán)的S59代替了其他酶中高度保守的D殘基，因而P6281似乎不具有激活胰蛋白酶原的潛力.

S1’底物結(jié)合區(qū)域，位于cleft裂縫的另一側(cè)，是由保守的T27、G28和S29殘基構(gòu)成的一個(gè)內(nèi)陷型空腔，該空腔可以容納底物P1’側(cè)鏈分子，并且其部分氨基酸殘基與底物之間形成氫鍵，以此穩(wěn)定底物P1’分子.S2’底物結(jié)合區(qū)域，位于C-lobe，是由A180、T202、I204、V292和N293形成的疏水口袋；與模板相比較只有I204為保守氨基酸殘基，其余殘基均發(fā)生了突變，與其他來(lái)源的同類天冬氨酸蛋白酶相比較，該位點(diǎn)殘基也不保守；進(jìn)一步對(duì)同模板和其他來(lái)源天冬氨酸蛋白酶相比較，P6281形成該底物結(jié)合區(qū)域的氨基酸殘基均不帶電荷，這表明P6281更趨向于疏水性氨基酸殘基的底物，這也體現(xiàn)了P6281對(duì)底物水解的肽鍵選擇性.

S2底物結(jié)合區(qū)域，是指由高度保守G208和T209殘基與flap結(jié)構(gòu)之間相互夾住的空間，該空間容納底物的側(cè)鏈分子，而底物分子自身向外旋轉(zhuǎn)；并且flap環(huán)的G58和S59與底物之間能形成氫鍵以穩(wěn)定底物分子.該結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基保守，這可能與flap環(huán)和緊挨D206活性殘基有關(guān)，只有這種穩(wěn)定保守的Motif結(jié)構(gòu)，才能保證催化位點(diǎn)正確的空間構(gòu)象，確保P6281具有活性.

S3底物結(jié)合區(qū)域，是指由不保守、帶負(fù)電荷的E6和D7殘基與flag環(huán)之間相夾的空間，并且其底部由較為保守疏水殘基I24、G91和Y57包圍而成的小空腔，該小空腔容納底物P3基團(tuán)的側(cè)鏈?zhǔn)杷鶊F(tuán)，這致使底物P3的側(cè)鏈基團(tuán)面向clef裂縫內(nèi)部；為了P6281與底物之間的穩(wěn)定性，底物能與T209等基團(tuán)形成氫鍵.由于E6D7殘基帶負(fù)電荷，不同于一般由疏水性殘基構(gòu)成的其他同類型酶，這導(dǎo)致底物P3位點(diǎn)的候選基團(tuán)中，比其他該類蛋白酶可能更偏向帶正電荷的Arg/Lys/His殘基.

S4底物結(jié)合區(qū)域，是由G208、T209、T210、L211、S232、S233、S234、Y270和S271形成的一個(gè)強(qiáng)疏水性口袋.底物P4殘基的側(cè)鏈能部分或者完全的埋入疏水囊中；由于疏水性是促使底物與酶之間相互結(jié)合的重要因素之一，這就更利于帶有較長(zhǎng)或較大的疏水側(cè)鏈殘基的P4殘基結(jié)合該區(qū)域，并且組成該區(qū)域的疏水性氨基酸殘基不保守；這表明P6281對(duì)底物P4位點(diǎn)更偏向于疏水性氨基酸殘基，以及不保守的殘基組成決定了P6281對(duì)底物肽鍵選擇的獨(dú)特性.

3 結(jié)論

本論文利用幾種生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站，對(duì)哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬和分析.在P6281一級(jí)結(jié)構(gòu)中，1~17位為信號(hào)肽序列，其切割位點(diǎn)為常見(jiàn)的X-A-X-A類型；18~65位為前導(dǎo)肽，含有高爾基體中Kex2蛋白酶識(shí)別的K32-R33殘基序列，促使其加工折疊；66~386為成熟肽，疏水性氨基酸殘基量占整個(gè)氨基酸總數(shù)85%以上，并且含有高度保守的活性殘基Motif結(jié)構(gòu)，這對(duì)維持活性中心的穩(wěn)定具有重要的作用.在二級(jí)結(jié)構(gòu)中，P6281富含β折疊和少量短鏈的螺旋結(jié)構(gòu).對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)分析可見(jiàn)，P6281是N-lobe和C-lobe類二重對(duì)稱形成的球狀結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中無(wú)Zn2+、loop結(jié)構(gòu)無(wú)Pro、僅1個(gè)二硫鍵，這是P6281熱穩(wěn)定性弱的重要原因.在兩個(gè)lobe結(jié)合縫隙的底物結(jié)合區(qū)域中主要以疏水性殘基組成為主，以及部分殘基的不保守性，這就決定了P6281對(duì)疏水性底物殘基的偏好性和肽鍵選擇的獨(dú)特性.綜上可知，通過(guò)對(duì)P6281各級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，解析了該酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為該酶的擴(kuò)大生產(chǎn)應(yīng)用、酶學(xué)性質(zhì)的改造奠定了基礎(chǔ).