姚怡帆 代卓毅 江智敏 徐 敏 李芳芳張 希 黨 偉 武兆云 丁永樂 楊鐵釗

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，450002，河南鄭州；2浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，310008，浙江杭州；3中國煙草總公司河南省公司，450002，河南鄭州；4陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，721013，陜西寶雞）

植物多酚氧化酶（PPO）是一種含銅的氧化還原酶[1]，有多種功能，能增強(qiáng)植物的抗逆性，也會催化產(chǎn)生深褐色的醌類物質(zhì)。PPO基因在不同植物中的存在形式有較大的差異，在大部分植物中以多基因家族的形式存在[2]。目前在煙草中利用生物信息學(xué)方法從普通煙草基因組中鑒定出10個(gè)PPO基因家族成員[3]。近年來，對PPO的研究主要集中在其分布、特性、功能和酶活抑制等方面，對PPO基因的染色體定位、克隆、表達(dá)分析及基因轉(zhuǎn)化的研究也屢見報(bào)道[4]。目前，關(guān)于PPO基因功能的研究主要集中在酶促褐變中的作用。褐變問題一直是很多果蔬收獲后貯藏、加工等過程導(dǎo)致質(zhì)量下降、經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低的一個(gè)重要因素。PPO介導(dǎo)的酶促棕色化反應(yīng)會對煙草等作物的質(zhì)量造成負(fù)面影響[5-7]。在煙葉烘烤過程中，過高的PPO活性會使煙葉變褐，不僅影響烤煙的外觀質(zhì)量，還會影響煙葉內(nèi)化學(xué)物質(zhì)以及香氣成分的含量，進(jìn)而影響其感官質(zhì)量[8-9]。煙草多酚氧化酶基因NtPPOE的表達(dá)影響了煙葉PPO活性，且煙葉的烘烤特性與PPO活性存在極為密切的聯(lián)系，煙葉PPO活性與烤后雜色煙葉比例呈顯著正相關(guān)[10]。降低PPO活性能使其不同程度地顯示出不易褐變和耐貯藏的特性[11]。伴隨PPO酶活調(diào)控范疇的發(fā)展，使用分子技術(shù)調(diào)節(jié)PPO的表達(dá)已經(jīng)成為PPO研究的嶄新領(lǐng)域[12-13]?；虺聊╲irus induced gene silencing，VIGS）技術(shù)作為RNA干擾技術(shù)的一種手段，是近20年發(fā)展起來的、能夠快速鑒定基因功能的反向遺傳學(xué)重要方法之一。煙草脆裂病毒（TRV）是一種雙分體、正鏈RNA病毒，攜帶目的基因的TRV衍生載體可以穩(wěn)定迅速地侵染植物，且不產(chǎn)生TRV病毒癥狀[14]。在VIGS病毒基因組中插入的基因片段與mRNA的轉(zhuǎn)錄方向相反時(shí)可以獲得更高的沉默效率[15]，且用400～500bp基因片段重組的病毒沉默載體侵染植株，沉默效果更顯著[16]。VIGS技術(shù)可以使攜帶目標(biāo)基因片段的TRV侵染植物，導(dǎo)致后續(xù)侵入病毒的靶向同源基因降解，達(dá)到抑制靶基因病毒侵染的目的[17-20]。劉天波等[13]研究表明，在煙草中利用此方法沉默了馬鈴薯Y病毒基因，有效防治煙草馬鈴薯Y病毒病。武明珠等[21]研究表明，在煙草中利用VIGS方法沉默了NtbHLH93基因后發(fā)現(xiàn)總甾醇、豆甾醇、膽固醇和β-谷甾醇的含量顯著降低。因此推斷利用VIGS技術(shù)沉默NtPPO8基因會使NtPPO8基因表達(dá)量下調(diào)，從而導(dǎo)致PPO活性降低。國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于降低PPO活性方面開展了大量研究，但是目前以VIGS技術(shù)來調(diào)控PPO表達(dá)的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以NtPPO8基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，從10個(gè)PPO家族中選取在葉中優(yōu)勢表達(dá)的NtPPO8基因。通過試驗(yàn)構(gòu)建靶向NtPPO8基因片段的煙草脆裂病毒TRV載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后處理煙苗，利用RT-qPCR檢測NtPPO8基因表達(dá)量及PPO活性，評價(jià)VIGS處理煙株的效果，旨在建立TRV介導(dǎo)的VIGS體系調(diào)控NtPPO8基因，為煙草烘烤與調(diào)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草品種為中煙100和K326，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實(shí)驗(yàn)室提供。根癌農(nóng)桿菌GV3101、TRV1和TRV2載體均購自上海凱益生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已測定NtPPO8（基因登錄號：Ntab0594570）基因的特異性區(qū)段，使用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物。引物為VI NtPPO8-XbaI-F：GC TCTAGATGCTCTTGGTTACGTCTTGG，VINtPPO8-BamHI-R：CGGGATCC ACAAGTTTCCAACAGGG TCC。引物序列中的劃線部分表示酶切位點(diǎn)。

1.2.2 VIGS載體的構(gòu)建方法 選取烤煙K326的煙葉1片，經(jīng)液氮速凍后研磨并提取RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明方法，26S rRNA為內(nèi)參基因，上游引物為 5′-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3′，下游引物 5′-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3′為反轉(zhuǎn)錄引物，以保存的K326煙草cDNA為模板，采用VI NtPPO8-XbaI-F、VI NtPPO8-BamHI-R引物，在高保真酶的作用下擴(kuò)增基因干擾片段。電泳檢測條帶單一，為防止目的基因片段中出現(xiàn)雜帶，將擴(kuò)增后的目的片段切膠回收。經(jīng)過Xba I/Bam HI雙酶切基因片段和pTRV2載體，純化回收基因片段和載體骨架，酶連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布Kana抗性平板，對長出的抗性菌落進(jìn)行PCR檢測目的基因片段，并從中挑取PCR陽性的菌樣提取質(zhì)粒，采用載體上通用引物TRV-CeXu（5′CATTAGCGAC ATCTAAATAGG3′）進(jìn)行測序。提取測序正確的大腸桿菌質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。限制性內(nèi)切酶消化、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的操作方法參考劉曉彬等[22]的研究。

1.2.3 VIGS病毒發(fā)酵液的配制 將攜帶目標(biāo)基因的病毒載體pTRV1、pTRV2和pTRV2-NtPPO8質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株分別在帶有卡那霉素（濃度為50μg/mL）和利福平（濃度為50μg/mL）的LB培養(yǎng)基中在28℃、180轉(zhuǎn)/min恒溫培養(yǎng)24h，調(diào)整OD600≈0.6～1.0，將帶有載體 pTRV1、pTRV2 和pTRV2-NtPPO8的農(nóng)桿菌分別等體積混合，將農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)移至50mL塑料離心管中，離心2min，棄上清液，使用侵染緩沖液（NaCl 50mmol/L、MES 50mmol/L、乙酰丁香酮0.1mmol/L）重懸洗滌后的菌體至 OD600≈0.6～1.0。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)地土質(zhì)為黃壤土，肥力中等，2020年3月15日播種，5月10日移栽，8月24日打頂，其他栽培措施按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。在中煙100移栽后50d進(jìn)行注射接種。設(shè)置3個(gè)處理，空載體發(fā)酵液注射10株（P0）、使用含NtPPO8基因的重組載體發(fā)酵液注射10株（P1），并設(shè)5株野生型煙株為空白對照（CK）。平均每株煙株菌液接種5mL。每個(gè)處理重復(fù)3次，共75株。在每個(gè)處理中隨機(jī)選取3株單株分別設(shè)為Z1、Z2和Z3。

在接種后10、20、30、40d分別在Z1、Z2、Z3煙株的S1（第8葉位）、S5（第12葉位）、S9（第17葉位）、S13（第22葉位）處進(jìn)行取樣，每次取煙葉樣本5g，同時(shí)檢測NtPPO8基因的表達(dá)量以及PPO活性。

1.2.5 測定指標(biāo)及方法 將待檢測的煙葉樣本用液氮研磨，提取總RNA，參照Trans Gen Biotech公司Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板，煙草NtPPO8的Real time-PCR檢測按照 Quant qRT-PCR kit（S Y B RGreen）（TIANGEN公司）使用說明在Quant Studio Tnl 6 Flex熒光定量PCR儀器（ABI公司）上進(jìn)行qRT-PCR檢測。3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)，利用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析NtPPO8的相對表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)?8S。引物如表1。以CK作為對照組，以P0、P1為試驗(yàn)組，NtPPO8基因沉默效率（%）=（對照組基因相對表達(dá)量-試驗(yàn)組基因相對表達(dá)量）/對照組基因相對表達(dá)量×100。沉默PPO活性效率（%）=（對照組PPO活性-試驗(yàn)組PPO活性）/對照組PPO活性×100。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

采用鄰苯二酚分光光度法測定煙葉中PPO活性[23]。PPO的提取：稱取煙葉樣品1.0g于研缽中，加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）少量和磷酸緩沖溶液（pH=6.8）8mL，冰浴下研磨至勻漿，4℃下12 000轉(zhuǎn)/min離心20min，取上清液，待測。PPO的測定：于試管中依次加入鄰苯二酚溶液（0.2mol/L）1.5mL和磷酸緩沖溶液（pH=6.8）1.5mL、待測液50μL，參比溶液中不加待測液。420nm波長下測定吸光度，1min后再次測定吸光度。PPO活性以每克煙葉樣品中每分鐘內(nèi)A420變化0.01個(gè)單位表示，記為ΔOD/(g·min)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VIGS載體的構(gòu)建

從煙草基因組數(shù)據(jù)庫中選擇1個(gè)轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)PPO的NtPPO8基因。使用NCBI Blast和NCBI Primer Blast選擇基因的特異性區(qū)段作為VIGS載體的靶向區(qū)域，并設(shè)計(jì)用于檢測基因相對表達(dá)量的qRT-PCR引物。本試驗(yàn)以保存的K326 cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到412bpNtPPO8基因片段，連接到T載體，再使用BamHI/KpnI酶切后連接到pTRV2，獲得pTRV2-NtPPO8表達(dá)載體。酶連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布Kana抗性平板，對長出的抗性菌落進(jìn)行PCR檢測目的基因片段（圖1），并從中挑取PCR陽性的菌樣提取質(zhì)粒，采用載體上通用引物：TRV-CeXu（5′CATTAGCGACATCTAAATA GG3′）進(jìn)行測序。圖2第1行為TRV2-NtPPO8載體6號克隆測序結(jié)果，第2行為參考序列。測序結(jié)果（圖2）顯示TRV2-NtPPO8序列和參考序列一致。

圖1 載體構(gòu)建菌落PCR電泳圖Fig.1 Vector construction colonyPCRelectrophoresisdiagram

圖2 TRV2-NtPPO8載體測序比對結(jié)果Fig.2 Results of TRV2-NtPPO8 vector sequencing vector sequencing comparison

2.2 RNA干擾對煙草NtPPO8基因表達(dá)量及酶活性的影響

根據(jù)圖3a可知，在Z1、Z2、Z3中CK與P1處理差異呈顯著，其他均不顯著。P1與CK和P0處理相比，P1處理的基因表達(dá)量大幅下調(diào)。P1處理沉默NtPPO8基因表達(dá)量效率最高的植株達(dá)78.89%（植株Z2），最低的為76.35%（植株Z1），平均沉默效率為77.90%。P0處理沉默NtPPO8基因表達(dá)量最高的植株達(dá)14.28%（植株Z2），最低的為3.31%（植株Z3），平均沉默效率為8.51%。在CK和P0處理中，Z3與Z1和Z2有顯著差異，其他均不顯著。

根據(jù)圖3b可知，在Z1、Z2、Z3的PPO活性中CK與P1呈極顯著差異，其他均不顯著。P1處理降低PPO活性的效率最高的植株達(dá)59.09%（植株Z3），最低的為55.82%（植株Z1），平均效率為57.35%；P0處理降低PPO活性最高的植株達(dá)5.61%（植株Z2），最低的為2.47%（植株Z3），平均效率為4.36%。在Z1、Z2、Z3單株中，CK中的Z1與Z3單株呈顯著差異，P0處理中Z1與Z2、Z3呈顯著差異，其他均不顯著。

圖3 不同處理對PPO活性及NtPPO8基因相對表達(dá)量的影響Fig.3 The effects of different treatments on PPO activity and NtPPO8 gene expression

2.3 RNA干擾的傳導(dǎo)效應(yīng)分析

根據(jù)圖4a可知，在葉位S1、S5、S9時(shí)，CK與P1相比呈顯著差異，在S13葉位時(shí)CK與P1處理呈極顯著差異，其他均不顯著。P1處理沉默NtPPO8基因表達(dá)量的效率在S1葉位為78.46%，S5葉位為78.10%，S9葉位為77.37%，S13葉位為68.88%。P0處理沉默NtPPO8基因表達(dá)量的效率在S1葉位為4.29%，S5葉位為2.86%，S9葉位為3.89%，S13葉位為3.31%。NtPPO8基因表達(dá)量隨著接種部位的增加而增加，沉默NtPPO8基因表達(dá)量效率都隨著接種部位的增加而降低。在P1處理中S13與其他葉位間呈顯著差異，其他均不顯著。

根據(jù)圖4b可知，所有葉位的CK與P1均呈極顯著性差異，其他均不顯著。PPO活性都隨著接種葉位的增加而增加。P1處理降低PPO活性的效率在S1葉位為59.09%，S5葉位為54.15%，S9葉位為54.30%，S13葉位為52.36%。P0處理降低PPO活性的效率在S1葉位為2.92%，S5葉位為3.26%，S9葉位為3.79%，S13葉位為1.78%。P1處理中，S1與S13有顯著差異，其他處理間均不顯著。

圖4 表達(dá)載體處理不同部位煙草中的PPO活性以及NtPPO8基因的相對表達(dá)量Fig.4 PPO activity and NtPPO8 gene expression in different parts of tobacco treated by expression vector

2.4 RNA干擾基因沉默的持續(xù)效應(yīng)分析

根據(jù)圖5a可知，CK與P1處理呈顯著差異，其他均不顯著。P1處理沉默NtPPO8基因表達(dá)量的效率在10d為78.18%，20d為 78.46%，30d為75.70%，40d為74.46%。P0處理沉默NtPPO8基因表達(dá)量的效率在10d為1.57%，20d為4.65%，30d為3.77%，40d為2.91%。NtPPO8基因表達(dá)量隨著時(shí)間的增加而增加，沉默NtPPO8基因表達(dá)量效率也隨著接種時(shí)間的增加而降低。CK、P0和P1處理的NtPPO8基因表達(dá)量都在10d時(shí)最低，在40d時(shí)最高。

根據(jù)圖5b可知，CK與P1處理相比呈極顯著差異，其他均不顯著。P1處理降低PPO活性的效率在10d為59.09%，20d為63.25%，30d為53.44%，40d為49.08%。P0處理降低PPO活性的效率在10d為2.63%，20d為2.84%，30d為2.19%，40d為8.09%。PPO活性隨著時(shí)間的增加先降后增，降低PPO活性的效率隨接種時(shí)間的增加呈先增后降趨勢?？傮w看來，在接種20d時(shí)降低PPO活性的效果最好。

圖5 表達(dá)載體處理不同時(shí)間煙草中的PPO活性及NtPPO8基因的相對表達(dá)量Fig.5 PPO activity and NtPPO8 gene expression in tobacco treated with expression vector at different times

3 討論

褐變問題一直是很多果蔬收獲后貯藏、加工等過程導(dǎo)致質(zhì)量下降和經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低的一個(gè)重要因素。煙草中的PPO活性對煙草的調(diào)制、烤后煙葉的顏色以及卷煙的加工、貯藏都有重要影響[24]。降低PPO活性能使其不同程度地顯示出不易褐變和耐貯藏的特性[11]。調(diào)制過程中降低PPO活性能使煙葉難以變褐，煙葉的烘烤特性與PPO活性高低存在極為密切的聯(lián)系，煙葉PPO活性與烤后雜色煙葉比例呈顯著正相關(guān)[8]。

本研究結(jié)果表明，利用VIGS體系對煙草NtPPO8基因的沉默是有效的，且NtPPO8基因表達(dá)量與PPO活性呈正比。當(dāng)NtPPO8基因表達(dá)量下降時(shí)，PPO活性也隨之下降。李建平等[25]研究表明，含有GhCPK基因的TRV載體對棉花進(jìn)行侵染后，可使棉花抗黃蔞病基因沉默。陳坤梅等[26]研究表明，含有BSMV基因的TRV載體對小麥進(jìn)行侵染后，可使小麥抗光氧化基因沉默。這與本試驗(yàn)結(jié)果相似，證明了使用VIGS方法接種的同一處理組中全部檢測的植株都具有較為理想的VIGS效率，且P1較CK處理也有極顯著差異，這表明本方法可以用于大規(guī)?；虺聊参锊牧系闹苽?。但研究中煙株的PPO活性高低與NtPPO8基因表達(dá)量變化并不完全一致，推測是因?yàn)闊熑~中的PPO活性同時(shí)受到復(fù)數(shù)基因的調(diào)控，且每個(gè)基因?qū)PO活性的影響有所差異，導(dǎo)致煙葉的酶活性變化與基因表達(dá)量變化不完全一致，要研究煙草不同PPO基因?qū)肿兊呢暙I(xiàn)率，還需獲得沉默單個(gè)或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)化體。

同時(shí)，本研究結(jié)果表明，VIGS接種后的載體會隨著煙株的生長在植物體內(nèi)運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)對植物內(nèi)源基因的系統(tǒng)性沉默。孫天杰等[27]研究表明，TRV病毒在侵染的細(xì)胞內(nèi)完成組裝，并進(jìn)入韌皮部進(jìn)行長距離運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)侵染。王心宇等[28]研究發(fā)現(xiàn)，利用VIGS體系，病毒可高效擴(kuò)散到棉花受體的根、莖和葉等器官，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，將攜帶TRV-NtPPO8載體的農(nóng)桿菌對煙株進(jìn)行侵染后，對處理植株不同位置的葉片進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)接種S1至S13均有較為理想的沉默效果，其中接種S1的沉默效率最高，達(dá)到78.46%，在到達(dá)S13葉位時(shí)，沉默效率為68.88%。證明了病毒載體會隨著煙株的生長而向上傳導(dǎo)，從而使整株發(fā)生系統(tǒng)性侵染。

本研究結(jié)果表明，VIGS的沉默效果具有持久性。VIGS有效的沉默期是該技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵影響因素，VIGS有效的沉默期一般為3周左右，之后將出現(xiàn)基因沉默衰減和表型恢復(fù)等現(xiàn)象[29-30]。在馬鈴薯Y病毒的研究中發(fā)現(xiàn)對煙株進(jìn)行TRV-CP病毒載體的侵染，在45d左右時(shí)不同處理煙株中TRV的含量仍能檢測出[13]。Senthil等[29]研究發(fā)現(xiàn)，VIGS在番茄上有效期可達(dá)2年以上。而有報(bào)道[29]顯示，VIGS的持續(xù)時(shí)間可延長至3個(gè)月。本研究在接種約40d時(shí)不同處理煙株的PPO活性的沉默效率仍顯著表達(dá)，表明構(gòu)建的VIGS體系能夠較長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，且沉默效果還可以持續(xù)。根據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)，VIGS的持續(xù)時(shí)間不是一個(gè)確定的值，因此，猜測VIGS的持久效果受別的因素影響。Rui等[31]研究表明，采用低溫和低濕的方法可適當(dāng)延長基因沉默的時(shí)間，在合適的條件下，VIGS的作用能夠持續(xù)幾年甚至一生。因此，VIGS的持久性以及干擾因素還需要進(jìn)一步探究。

本試驗(yàn)為后續(xù)進(jìn)一步研究病毒長距離運(yùn)輸及植物性狀長期觀察的試驗(yàn)以及VIGS的持久性及影響因素提供了良好的試驗(yàn)操作體系。并為提高改善煙葉耐烤性及降低煙葉褐變比例提供了新的思路和方法，具有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

利用VIGS載體建立了基于病毒誘導(dǎo)的煙草PPO沉默體系。基于該體系能夠有效沉默NtPPO8基因的表達(dá)且降低PPO活性。VIGS接種后的載體會隨著煙株的生長在植物體內(nèi)運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)對植物內(nèi)源基因的系統(tǒng)性沉默，且VIGS的沉默效果具有持久性，在40d時(shí)仍能有效表達(dá)。