李玉博， 張健， 張?jiān)冁拢?李城明， 龍盤， 肖雯婧， 呼永河△

龍膽苦苷對(duì)大鼠腹膜纖維化的抑制作用及其機(jī)制研究*

李玉博1，2， 張健3， 張?jiān)冁?， 李城明4， 龍盤5， 肖雯婧6， 呼永河1，2△

（1西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川 瀘州 646000；2中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610083；3西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610031；4成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；5中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院眼科，四川 成都 610083；6中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，四川 成都 610083）

觀察龍膽苦苷對(duì)腹膜透析大鼠腹膜纖維化組織氧化應(yīng)激反應(yīng)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）/Smads信號(hào)通路的影響，探討龍膽苦苷防治腹膜纖維化的作用機(jī)制。通過4.25%高糖腹膜透析液（100 mL/kg；每天1次）聯(lián)合脂多糖（0.6 mg/kg；第1、3、5、7天注射）構(gòu)建大鼠腹膜纖維化模型。將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：生理鹽水組、模型組及低、中、高劑量（30、60和120 mg/kg）龍膽苦苷組，每組6只。透析28 d后行1 h腹膜功能試驗(yàn)：測(cè)定超濾量、初始腹透液與透出液葡萄糖比值、透析液與血漿尿素氮比值及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量。取大鼠壁層腹膜進(jìn)行腹膜病理形態(tài)學(xué)觀察，計(jì)算腹膜厚度。取腹主動(dòng)脈血檢測(cè)血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平。免疫組化檢測(cè)各組大鼠腹膜組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、上皮鈣黏素（E-cadherin）和I型膠原（COL I）的表達(dá)情況。Western blot檢測(cè)各組大鼠腹膜組織中TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白的表達(dá)。透析28 d后，經(jīng)腹腔注射4.25%高糖腹膜透析液及脂多糖建立的腹膜纖維化大鼠模型腹膜功能顯著降低（0.05），腹膜厚度顯著增加（0.01），并可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維細(xì)胞及血管增生明顯增多；大鼠血清中MDA含量顯著增多，SOD和GSH-Px活性顯著降低（0.01）；免疫組化顯示，α-SMA和COL I蛋白表達(dá)顯著增加，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低（0.01）；Western blot顯示，TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)顯著增加，Smad7蛋白表達(dá)顯著降低（0.01）。龍膽苦苷干預(yù)能夠顯著降低氧化應(yīng)激水平，抑制TGF-β1和Smad3蛋白的表達(dá)，提高Smad7蛋白表達(dá)水平，且呈劑量依賴性（0.05）。龍膽苦苷可減輕高糖腹透液聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的腹膜纖維化模型大鼠的腹膜纖維化病變程度，其機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及腹膜間皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程有關(guān)。

龍膽苦苷；腹膜纖維化；氧化應(yīng)激；間皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

腹膜纖維化（peritoneal fibrosis， PF）是腹膜透析治療過程中一種常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，其主要病理改變?yōu)榧?xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）堆積及間皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（mesothelial-mesenchymal transition， MMT），同時(shí)既往研究顯示氧化應(yīng)激反應(yīng)在PF發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用［1-3］。

PF可導(dǎo)致腹膜超濾功能和轉(zhuǎn)運(yùn)功能衰竭。由PF導(dǎo)致的腹膜超濾衰竭是PF患者退出腹膜透析治療的主要原因［4］，給腹膜透析患者后續(xù)的治療與生存帶來極大威脅，但目前臨床上仍缺乏有效治療PF的藥物。既往研究證實(shí)，龍膽苦苷（gentiopicroside， GPS）具有抗氧化和清除自由基等作用［5］，在肺纖維化［6］、肝纖維化［7］、糖尿病腎纖維化［8］等纖維化疾病中發(fā)揮治療作用，但尚未見其在PF中有相關(guān)研究。我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察到GPS可有效減少PF大鼠腹膜厚度，基于此，本研究采用4.25%高糖腹膜透析液聯(lián)合脂多糖建立PF大鼠模型，從腹膜功能、結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)水平系統(tǒng)探討GPS對(duì)大鼠PF的影響。

材料和方法

1　動(dòng)物

30只清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，6～8周齡，體重170～250 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK（川）2020-030。飼養(yǎng)環(huán)境：12 h光照/12 h黑暗循環(huán)；環(huán)境溫度（23±2） ℃；濕度（55±5）%；通風(fēng)良好；無噪音環(huán)境；供給充足食物和水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，并獲得醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2　主要試劑

GPS單體（提取自中藥龍膽草，屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物，分子式C16H20O9，分子量356.32）購自南京道斯夫生物有限公司；4.25%高糖腹膜透析液（廣州百特醫(yī)療器械有限公司）；丙二醛（molondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）和葡萄糖檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）、HE染色試劑盒、改良Masson三色染色試劑盒及尿素氮試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；全蛋白提取試劑盒和BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；兔抗TGF-β1單克隆抗體、兔抗Smad3單克隆抗體及兔抗Smad7多克隆抗體購自Abcam；兔抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）、上皮鈣黏素（E-cadherin）和I型膠原（collagen type I， COL I）多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；小鼠抗GAPDH單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

3　主要方法

3.1藥品配制（1）脂多糖溶液的配制：每瓶脂多糖為10 mg，加入生理鹽水10 mL充分溶解配成1 g/L的脂多糖原液；取其中0.6 mL，加入4.25％腹膜透析液99.4 mL混勻，即配制成0.006 g/L的脂多糖溶液。（2）GPS溶液的配制：取GPS固體粉末210 mg，加入生理鹽水3.5 mL配制成60 g/L的GPS原液；取其中0.5、1和2 mL分別加入至99.5、99和98 mL的4.25％腹膜透析液中混勻，即配制成0.3、0.6和1.2 g/L GPS溶液。（3）GPS與脂多糖混合溶液的配制：將用生理鹽水配制的脂多糖原液0.6 mL與GPS原液3.5 mL充分混合，取其中的1.1、1.6和2.6 mL分別加入到98.9、98.4和97.4 mL的腹膜透析液中混勻。

3.2動(dòng)物模型建立及給藥項(xiàng)協(xié)隆等［9］的研究顯示使用4.25%腹膜透析液+脂多糖建立的PF大鼠模型，接近臨床觀察到的腹膜透析相關(guān)的PF，我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)采用上述方法也成功建立了PF大鼠模型。30只SD大鼠隨機(jī)分為5組：生理鹽水（normal saline， NS）組、模型組（model組）、低劑量（30 mg/kg）GPS組（GPS 30組）、中劑量（60 mg/kg）GPS組（GPS 60組）和高劑量（120 mg/kg）GPS組（GPS 120組），每組各6只。NS組腹腔注射無菌生理鹽水（100 mL·kg-1·d-1），model組注射4.25％腹膜透析液（100 mL·kg-1·d-1），GPS組腹腔注射GPS溶液（100 mL·kg-1·d-1），model組和GPS組在給藥的第1、3、5、7天聯(lián)合注射脂多糖溶液（0.6 mg/kg），均采用左下腹注射，建立PF大鼠模型。

3.3動(dòng)物取材于實(shí)驗(yàn)第28天注射上述藥物1 h后腹腔注射4％水合氯醛（10 mL/kg）麻醉大鼠，先用20 mL注射器自大鼠左下腹抽取腹腔內(nèi)腹液體，量取體積，然后沿腹白線打開腹腔用干燥棉球充分吸取殘余液體，稱取重量，最后出水量=［引流量+（棉球吸水后的重量-干燥棉球的重量）］×1 mL/g，計(jì)算透出液總量后將其以111.8×離心5 min，取上清液保存于-20 ℃；暴露腹主動(dòng)脈采血針取腹主動(dòng)脈血以1 006.2×離心10 min，收集血清保存于-20 ℃；連同腹壁肌肉取1 cm×1 cm腹正中壁層腹膜組織，PBS洗去殘留血液及毛發(fā)后立即置于4％多聚甲醛中，并取臟層腹膜（腸系膜）組織保存于-80 ℃中以備后續(xù)做相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

3.4腹膜功能評(píng)估取所收集的血清及腹腔透出液，使用尿素氮及葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清、初始腹透液及1 h后腹腔透出液，測(cè)定腹腔透出液尿素氮濃度（D）、血清尿素氮濃度（P）、腹腔透出液葡萄糖濃度（D1）及初始腹透液葡萄糖濃度（D0）。（1）1 h腹膜超濾量（ultrafiltration， UF）=最后出水量-初始注射量；（2）葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量（mass transfer of glucose， MTG）=透析液初始葡萄糖濃度×注入透析液體積-透析末葡萄糖濃度×終末透析液出量；（3）腹膜平衡試驗(yàn)（peritoneal equilibration test， PET）的測(cè)定：計(jì)算D/P urea（透出液尿素氮/血清尿素氮）和D1/D0。

3.5大鼠腹膜組織病理學(xué)觀察將經(jīng)4％多聚甲醛固定48 h以上的壁層腹膜組織取出，流水沖洗后進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、固定、連續(xù)切片，制作為4 μm厚的石蠟切片，烤片機(jī)上烘干1 h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、染色、分化、脫水、透明、封片后行HE及Masson染色，光鏡下觀察病理改變。Masson染色切片行壁層腹膜厚度測(cè)量，每組隨機(jī)測(cè)量6個(gè)高倍視野，每個(gè)視野下取四個(gè)值，最后以平均值作為判定厚度的標(biāo)準(zhǔn)。

3.6大鼠血清MDA含量及SOD和GSH-Px活性的測(cè)量取所收集血清，按照MDA、SOD和GSH-Px生化試劑盒說明書加入樣本及試劑，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（），最后計(jì)算出血清中MDA含量及SOD和GSH-Px活性。血清中丙二醛含量（μmol/L）=（測(cè)定值-對(duì)照值）/（標(biāo)準(zhǔn)值-空白值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 μmol/L）×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)；血清中SOD活性（U/mL）=SOD抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（0.24 mL/0.02 mL）×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)，SOD抑制率（%）=［（對(duì)照-對(duì)照空白）-（測(cè)定-測(cè)定空白）］÷（對(duì)照-對(duì)照空白）×100%；血清中GSH-Px活性（U/mL）=（非酶管值-酶管值）/（標(biāo)準(zhǔn)管值-空白管值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（20 μmol/L）×稀釋倍數(shù)×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

3.7免疫組化觀察PF相關(guān)蛋白表達(dá)將制作的壁層腹膜組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，流水沖洗后置于枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中微波爐高火3 min，中火8～10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液孵育20～30 min滅活辣根過氧化物酶，于磷酸鹽緩沖液中洗滌3次，每次5 min，5％山羊血清封閉30 min，然后分別加入α-SMA、E-cadherin和COL I抗體（按1∶100比例稀釋），4 ℃孵育過夜，次日37 ℃復(fù)溫0.5～1 h，用PBS洗滌，滴加山羊抗兔Ⅱ抗（按1∶2 000比例稀釋）后37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，滴加DAB（二氨基聯(lián)苯胺）進(jìn)行顯色3～5 min，流水沖洗后復(fù)染、分化、脫水、透明、封片。切片置于顯微鏡下觀察并拍照，應(yīng)用ImageJ軟件分析，每組隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算陽性表達(dá)面積占整個(gè)視野百分比，取每組平均值作為該組最終值。

3.8Western blot法檢測(cè)TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白表達(dá)水平（1）配制蛋白裂解液：按照每100 mg加1 mL的用量計(jì)算所需裂解液總量，每1 mL裂解緩沖液加入10 μL磷酸酶抑制劑，1 μL蛋白酶抑制劑和10 μL PMSF混勻，冰上保存。（2）提取總蛋白并定量：將存于-80 ℃的臟層腹膜組織取出，稱取（100±5） mg大鼠腹膜組織，加入1 mL配置好的裂解液迅速研磨勻漿，取組織勻漿液到1.5 mL預(yù)冷的離心管，于4 ℃、1 609.92×離心5 min后取上清液，BCA法蛋白定量，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min使蛋白變性，分裝置于-80 ℃保存。（3）電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)及顯影配膠：上樣，電泳（80 V 0.5 h， 120 V 1 h），切膠，轉(zhuǎn)膜（300 mA， 2 h），5%脫脂牛奶室溫封閉膜1.5 h，Ⅰ抗室溫孵育膜1 h，4 ℃過夜；次日取出膜并用TBST洗3次，每次10 min，加入山羊抗兔Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗，顯色液顯色并利用UVP成像儀成像后拍照。以GAPDH為內(nèi)參照，ImageJ軟件計(jì)算各條帶的灰度值，半定量分析后比較各組差異。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。方差齊，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）；方差不齊，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　大鼠體重變化情況

大鼠實(shí)驗(yàn)期間腹腔注射更換注射部位，無明顯硬結(jié)、皮下血腫，腹膜透析耐受性良好，各組無大鼠死亡。各組大鼠分別于第1、8、15、22天清晨空腹稱重。結(jié)果顯示，第1天各組大鼠體重?zé)o顯著差異（0.05）；第2～8天model組和GPS組由于注射脂多糖精神不佳，體重增長(zhǎng)減慢；第9～28天各組大鼠體重持續(xù)增長(zhǎng)；第28天，與NS組及GPS組比較，model組體重整體上偏高，但未見顯著差異（0.05），見表1。

表1　各組大鼠每周體重變化情況

2　大鼠腹膜功能變化結(jié)果

大鼠腹膜功能于實(shí)驗(yàn)第28天進(jìn)行評(píng)估，向所有大鼠腹腔內(nèi)注射4.25％腹膜透析液，透析液在腹腔內(nèi)停留1 h后，收集腹腔透出液，計(jì)算并分析UF、MTG及腹膜平衡試驗(yàn)指標(biāo)（D/P urea和D1/D0）。結(jié)果顯示，與NS組相比，model組UF顯著下降，MTG顯著升高，腹膜平衡試驗(yàn)model組D/P urea顯著上升，D1/D0顯著下降（0.05）；與model組相比，GPS各組UF上升，MTG下降，腹膜平衡試驗(yàn)顯示GPS各組D/P urea顯著下降，D1/D0顯著上升（0.05），見表2。

表2　各組大鼠腹膜功能測(cè)定結(jié)果

*<0.05NS group；#<0.05model group.

3　大鼠腹膜組織HE及Masson染色結(jié)果

大鼠正中壁層腹膜經(jīng)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察可見，NS組大鼠壁層腹膜間皮下基質(zhì)較薄，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及血管生成少，間皮下無明顯膠原纖維沉積；model組可見腹膜基質(zhì)明顯增多、膠原纖維大量沉積，有核細(xì)胞浸潤(rùn)及新生血管增多；而GPS各組上述改變較PF組明顯減輕，見圖1。

Figure 1.　HE staining of peritoneal tissue of the rats in each group. The scale bar=100 μm （upper） or 20 μm （lower）. Black arrow： neovascularization； red arrow： inflammatory cell infiltration.

Masson染色可見，NS組大鼠平均腹膜厚度為（26.61±5.02） μm，而model組大鼠平均腹膜厚度為（160.31±15.35） μm，較NS組顯著增加（0.01），且纖維增多，結(jié)構(gòu)紊亂；GPS各組腹膜厚度較model組顯著降低（0.01），見圖2及表3。

Figure 2.　Masson staining of peritoneal tissue of the rats in each group. The scale bar=100 μm. Black arrow： neovascularization； red arrow： loose and disordered arrangement of peritoneal fibers.

表3　各組大鼠腹膜Masson染色后厚度測(cè)量結(jié)果

**<0.01NS group；##<0.01model group.

4　大鼠腹膜組織免疫組化染色結(jié)果

大鼠正中壁層腹膜組織免疫組化染色結(jié)果顯示，α-SMA主要表達(dá)于腹膜組織中血管的管壁，COL I主要集中于間皮ECM，E-cadherin主要表達(dá)在腹膜間皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。model組在4.25％腹膜透析液刺激與脂多糖誘導(dǎo)下α-SMA和COL I表達(dá)水平顯著增高，而E-cadherin表達(dá)水平則顯著下降（0.01），在GPS干預(yù)后可見α-SMA和COL I表達(dá)水平顯著下降（0.01），E-cadherin表達(dá)水平顯著上升（0.05），見圖3。

Figure 3.　Immunohistochemical staining and semi-quantitative analysis of α-SMA， E-cadherin and COL I in peritoneal tissues of the rats in each group. Black arrow： the expression of α-SMA in the vascular wall of peritoneal tissue is obviously increased； red arrow： the expression of E-cadherin in peritoneal mesothelial cell membrane and intercellular decreased， cells lost connection， and peritoneal structure was destroyed； green arrow： COL I deposition of extracellular matrix in peritoneal mesothelium. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs NS group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group.

5　大鼠血清MDA含量及GSH-Px和SOD活性

大鼠血清檢測(cè)結(jié)果顯示，NS組中MDA含量較低，model組MDA含量顯著增加（0.01），GPS 60和GPS 120組MDA含量相較M組顯著減少（0.01），GPS 30組MDA含量同model組比較無顯著差異（0.05）；NS組中SOD和GSH-Px活性較高，model組SOD和GSH-Px活性顯著下降（0.01），GPS 60和GPS 120組GSH-Px和SOD活性均較model組顯著上升（0.01），GPS 30組GSH-Px活性較model組顯著上升（0.05），而SOD活性同model組比較無顯著差異（0.05），見圖4。

Figure 4.　The content of MDA and the activity of GSH-Px and SOD in rat serum. Mean±SD. n=4. *P<0.05，**P<0.01 vs NS group； ##P<0.01 vs model group.

6　大鼠臟層腹膜組織MMT進(jìn)程相關(guān)分子的表達(dá)

大鼠臟層腹膜組織Western blot結(jié)果顯示，使用4.25％腹膜透析液透析后，在MMT發(fā)生發(fā)展起重要作用的因子TGF-β1及其下游分子Smad3和Smad7表達(dá)水平都產(chǎn)生了明顯的變化，具體表現(xiàn)為TGF-β1和Smad3表達(dá)水平均顯著上升（0.01），Smad7表達(dá)水平則顯著下降（0.01）；GPS各組TGF-β1和Smad3表達(dá)水平較model組顯著下降（0.05），GPS 120組Smad7表達(dá)水平較model組顯著上升（0.05），GPS 30和GPS 60組Smad7表達(dá)水平同model組比較無顯著差異（0.05），見圖5。

Figure 5.　The protein levels of TGF-β1， Smad3 and Smad7 were determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs NS group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group.

討論

本實(shí)驗(yàn)使用4.25%腹膜透析液聯(lián)合脂多糖腹腔注射成功建立PF大鼠模型，探究GPS對(duì)大鼠PF的作用。結(jié)果顯示GPS可改善PF大鼠腹膜功能，減輕腹膜病理結(jié)構(gòu)改變，增加抗氧化應(yīng)激損傷能力。同時(shí)從分子生物學(xué)層面也表明GPS可減輕大鼠腹膜MMT程度。以上研究表明，GPS可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及腹膜MMT進(jìn)程，從而減輕高糖腹透液聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的大鼠PF損傷。

GPS是一種中藥單體，屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物，源自中藥龍膽草；大量研究證實(shí)GPS在纖維化疾病中有較好的治療效果［10-11］。有研究表明，GPS可通過調(diào)控TLR-4/NF-κB和AMPK/Nrf2信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善大鼠肝纖維化損傷［12］。近期有研究顯示GPS能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，進(jìn)而抑制組織中的膠原生成和基質(zhì)堆積，從而改善肺部組織維化病變程度［13］，但目前尚未見其在PF中有相關(guān)研究。

PF以ECM過度沉積和組織結(jié)構(gòu)重塑為主要特征，是導(dǎo)致臟器功能喪失的主要原因之一［14］。由于腹膜透析溶液的組成（高葡萄糖含量、低pH值、滲透壓升高、乳酸濃度升高和葡萄糖降解產(chǎn)物）導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)貫穿了PF的全過程，機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平可通過MDA含量及GSH-Px和SOD活性來體現(xiàn)。本研究中，GPS各組MDA含量較模型組顯著減少，GSH-Px和SOD活性顯著上升，說明機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕。MMT被認(rèn)為發(fā)生于PF的早期階段并在PF中起到了關(guān)鍵性的作用［15］，α-SMA、COL I和E-cadherin都是MMT的標(biāo)志物。TGF-β是MMT發(fā)生的關(guān)鍵性因子，TGF-β1通過Smad2和Smad3信號(hào)途徑促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞以及ECM的沉積，最終形成纖維化病變；而Smads7作為內(nèi)源性TGF-β拮抗劑，產(chǎn)生抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路的作用，以延緩纖維化的發(fā)展［16-17］。本研究結(jié)果顯示，GPS各組α-SMA和COL I表達(dá)量下降，而E-cadherin表達(dá)量上升，同時(shí)TGF-β1和Smad3表達(dá)水平下降，Smad7表達(dá)水平上升，表明TGF-β1通過Smads信號(hào)途徑誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的作用減弱，ECM和膠原沉積減少，MMT進(jìn)程受到抑制，腹膜的正常結(jié)構(gòu)得以維持。但本研究所建立的PF大鼠模型的腹膜厚度顯著高于其他研究中單純用高糖腹透液所建立的PF大鼠模型的腹膜厚度，但與黃海燕等［18］建立的5/6腎切除尿毒癥大鼠模型腹膜纖維化的腹膜厚度接近，其原因可能是脂多糖引起腹腔內(nèi)明顯的炎癥，使腹膜組織受到高糖和炎癥的雙重刺激，以致厚度顯著增加。然而，隨著腹膜透析插管技術(shù)的進(jìn)步，腹膜透析相關(guān)的細(xì)菌性腹膜炎的發(fā)生率逐年下降，非細(xì)菌因素所致的無菌性腹膜透析PF在腹膜透析患者中的發(fā)生率正呈上升趨勢(shì)，因此下一步我們可以嘗試構(gòu)建無菌性腹膜透析PF大鼠模型進(jìn)一步了解無菌性PF的特征及GPS在這類PF中的治療效果。

本研究通過4.25%高糖腹膜透析液聯(lián)合脂多糖建立PF大鼠模型，并從腹膜功能、結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)水平系統(tǒng)研究GPS對(duì)PF大鼠的保護(hù)作用，證明GPS可有效減輕大鼠腹膜纖維化的病變程度，并通過檢測(cè)機(jī)體氧化應(yīng)激水平及MMT核心分子TGF-β通路相關(guān)信號(hào)蛋白的表達(dá)證實(shí)GPS減輕大鼠PF病變程度可能是通過緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)及MMT而發(fā)揮作用。但是本實(shí)驗(yàn)對(duì)于GPS具體是通過哪些途徑調(diào)控TGF-β1信號(hào)分子及氧化應(yīng)激水平來治療腹膜組織的纖維化病變尚不清楚，后續(xù)可根據(jù)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步研究，同時(shí)還可探索TGF-β和氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的纖維化的其他途徑，例如磷脂酰肌醇3-激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等［16］，并可結(jié)合細(xì)胞學(xué)層面的研究以相互佐證。

綜上所述，本研究證實(shí)GPS可通過抑制慢性氧化應(yīng)激反應(yīng)及腹膜MMT進(jìn)程，從而對(duì)高糖腹透液聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的腹膜透析大鼠PF具有潛在的治療作用。

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Inhibitory effect of gentiopicroside on peritoneal fibrosis in rats and its mechanism

LI Yu-bo1，2， ZHANG Jian3， ZHANG Zai-yuan3， LI Cheng-ming4， LONG Pan5， XIAO Wen-jing6， HU Yong-he1，2△

（1，，646000，；2，，610083，；3，，610031，；4，610075，；5，，610083，；6，，610083，）

To observe the effect of gentiopicroside on oxidative stress and transforming growth factor-β （TGF-β）/Smads signaling pathway in peritoneal fibrosis tissue of rats undergoing peritoneal dialysis， and to explore the mechanism of gentiopicroside in preventing and treating peritoneal fibrosis.The rat model of peritoneal fibrosis was established by 4.25% high glucose peritoneal dialysate （100 mL/kg， once a day）combined with lipopolysaccharide （0.6 mg/kg） injection on the 1st， 3rd， 5th and 7th days. Male SD rats were randomly divided into 5 groups： saline group， model group， and low-， middle- and high-dose （30， 60 and 120 mg/kg） gentiopicroside groups， with 6 rats in each group. Peritoneal function test was performed after 28 d of dialysis， and ultrafiltration volume， initial dialysate/final dialysate glucose ratio， dialysate/plasma urea nitrogen ratio and glucose transport volume were measured. The parietal peritoneum was taken for peritoneal pathomorphological observation， and peritoneal thickness was calculated. The blood of abdominal aorta was taken for detecting serum levels of malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD） and glutathione peroxidase （GSH-Px）. The expression of α-smooth muscle actin （α-SMA）， E-cadherin and collagen type I （COL I） in peritoneal tissues was detected by immunohistochemistry. Western blot was used to detect the expression of TGF-β1， Smad3 and Smad7 in peritoneal tissues.After 28 d of dialysis， the peritoneal function of the rat model of peritoneal fibrosis was significantly decreased （0.05）， while the peritoneal thickness， inflammatory cell infiltration， fibrous cells and vascular proliferation were significantly increased. The serum MDA increased significantly， while SOD and GSH-Px decreased significantly （0.01）. Immunohistochemistry showed that the protein expression of α-SMA and COL I increased significantly， while the protein expression of E-cadherin decreased significantly （0.01）. Western blot showed that the expression of TGF-β1 protein and Smad3 protein increased significantly， while the expression of Smad7 protein decreased significantly （0.01）. Gentiopicroside reduced the level of oxidative stress and the protein expression of TGF-β1 and Smad3， but increased the protein expression of Smad7 in a dose-dependent manner.Gentiopicroside attenuates peritoneal fibrosis in rats， and its mechanism is involved in the inhibition of oxidative stress and the process of peritoneal mesothelial-mesenchymal transition.

Gentiopicroside； Peritoneal fibrosis； Oxidative stress； Mesothelial-mesenchymal transition

R285.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.06.015

1000-4718（2022）06-1075-08

2021-11-20

2022-01-14

四川省科技廳項(xiàng)目（No. 2019YFS0542）

Tel： 0028-86570206； E-mail： huyonghezyy@163.com

（責(zé)任編輯：余小慧，李淑媛）