何嘯蘭， 王鹍鵬， 周月希， 吳尚蓉， 胡雅君△

毓麟珠對(duì)卵巢早衰大鼠SIRT1-FoxO1-自噬通路的調(diào)控作用*

何嘯蘭1， 王鹍鵬2， 周月希1， 吳尚蓉1， 胡雅君1△

（1武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430030；2武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430030）

探討毓麟珠對(duì)卵巢早衰（POF）大鼠自噬的影響，并分析其防治POF的作用機(jī)制。雌性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法選取16只為正常組，其余大鼠通過腹腔注射環(huán)磷酰胺建立POF模型。造模成功大鼠分為POF組、戊酸雌二醇（0.09 mg/kg）組（簡稱雌二醇組）、低劑量（7.56 g/kg）毓麟珠組、高劑量（15.12 g/kg）毓麟珠組和毓麟珠+沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）抑制劑EX527組（簡稱毓麟珠+EX527組），每組16只。低、高劑量毓麟珠組大鼠分別灌胃相應(yīng)劑量的毓麟珠藥液，雌二醇組大鼠給予戊酸雌二醇溶液灌胃，毓麟珠+EX527組大鼠在給予15.12 g/kg毓麟珠藥液灌胃的同時(shí)腹腔注射10 mg/kg EX527，正常組和POF組大鼠給予等體積的生理鹽水干預(yù)，每天1次，連續(xù)給藥3周。給藥結(jié)束后，記錄各組大鼠的雙側(cè)卵巢重量和體重，計(jì)算卵巢指數(shù)；ELISA檢測(cè)各組大鼠血清雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）和抗繆勒管激素（AMH）水平；檢測(cè)各組大鼠卵巢組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）水平；蘇木精-伊紅（HE）染色和TUNEL染色觀察各組大鼠卵巢組織病理變化，計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡數(shù)，并分析竇卵泡中顆粒細(xì)胞凋亡水平；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠卵巢組織微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（LC3B）蛋白表達(dá)；RT-qPCR檢測(cè)各組大鼠卵巢組織LC3B、p62、beclin-1、Atg5和Atg7的mRNA表達(dá)；Western blot檢測(cè)各組大鼠卵巢組織LC3A/B、p62、beclin-1、Atg5、Atg7、SIRT1、叉頭框蛋白O1（FoxO1）和乙酰化FoxO1（Ac-FoxO1）的蛋白水平；評(píng)估POF大鼠的生育能力。與正常組相比，POF組大鼠卵巢指數(shù)，血清E2和AMH水平，卵巢組織SOD和CAT活性，卵巢原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇卵泡數(shù)量，p62 mRNA和蛋白水平，SIRT1和FoxO1蛋白水平，以及受孕率和胚胎數(shù)均顯著降低，而血清FSH水平，卵巢組織MDA水平，閉鎖卵泡數(shù)量，顆粒細(xì)胞凋亡水平，卵巢LC3B蛋白陽性表達(dá)，LC3B、beclin-1、Atg5和Atg7 mRNA水平，beclin-1、Atg5、Atg7和Ac-FoxO1蛋白水平，以及LC3-II/LC3-I比值均顯著升高（<0.05）；與POF組相比，高劑量毓麟珠組和雌二醇組大鼠卵巢指數(shù)，血清E2和AMH水平，卵巢組織SOD和CAT活性，卵巢原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇卵泡數(shù)量，p62 mRNA和蛋白水平，SIRT1和FoxO1蛋白水平，以及受孕率和胚胎數(shù)均顯著升高，而血清FSH水平，卵巢組織MDA水平，閉鎖卵泡數(shù)量，顆粒細(xì)胞凋亡水平，卵巢LC3B蛋白陽性表達(dá)，LC3B、beclin-1、Atg5和Atg7 mRNA水平，beclin-1、Atg5、Atg7和Ac-FoxO1蛋白水平，以及LC3-II/LC3-I比值均顯著降低（<0.05）；EX527可顯著減弱毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢功能的保護(hù)作用。毓麟珠可能通過激活SIRT1-FoxO1通路抑制氧化應(yīng)激及細(xì)胞自噬，從而改善POF大鼠卵巢功能。

毓麟珠；卵巢早衰；氧化應(yīng)激；自噬；SIRT1-FoxO1信號(hào)通路

卵巢早衰（premature ovarian failure， POF）是一種由多種因素共同引起的內(nèi)分泌改變疾病，通常用于描述40歲以下的女性，其基本表現(xiàn)是閉經(jīng)、促性腺激素高、雌激素低和不孕；發(fā)病率逐漸上升，對(duì)女性的身心健康有嚴(yán)重影響［1-2］。目前POF的治療方法有激素替代療法、促排卵療法、卵巢移植、免疫療法、促排卵療法等。其中，治療效果好的雌激素類藥物作為常用藥物，副作用大，停藥后復(fù)發(fā)率高，易致癌，不適合作為長期治療方法［3］。大量研究表明，中藥治療POF，療效確切，安全性高，且費(fèi)用低［4］，近年來逐漸成為研究熱點(diǎn)。毓麟珠見于《景岳全書·婦人規(guī)》，為應(yīng)用較多的調(diào)經(jīng)方之一。已有研究顯示毓麟珠聯(lián)合激素治療可以改善脾腎陽虛型POF患者癥狀，改善卵巢功能［5］；并可以通過調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）信號(hào)通路，促進(jìn)卵泡發(fā)育，改善早發(fā)性卵巢功能不全小鼠卵巢功能［6］。但毓麟珠防治POF的作用機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步探索。

作為細(xì)胞降解過程，自噬吞噬受損的細(xì)胞器和功能失調(diào)的細(xì)胞質(zhì)以維持細(xì)胞功能，在卵巢功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7-8］。自噬受多種信號(hào)通路調(diào)控，其中沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silence information regulator 1， SIRT1）/叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1， FoxO1）通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的主要通路之一。FoxO1調(diào)節(jié)許多自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，如微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3， LC3）、自噬相關(guān)蛋白5（autophagy-related protein 5， Atg5）和beclin-1，與自噬密切相關(guān)［9］。SIRT1是一類NAD+依賴型脫乙酰酶，通過使FoxO1去乙?；诩?xì)胞自噬中具有重要作用［10］。據(jù)報(bào)道，激活SIRT1/FoxO1通路可抑制自噬［11］，且SIRT1/FoxO1通路的激活可抑制氧化應(yīng)激，改善自然衰老過程中的卵巢功能［12］。此外，多項(xiàng)研究證實(shí)SIRT1-FoxO-自噬通路通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，參與對(duì)衰老的調(diào)節(jié)［13-14］。而毓麟珠對(duì)POF的保護(hù)機(jī)制是否與SIRT1/FoxO1通路介導(dǎo)的自噬有關(guān)，還未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過觀察毓麟珠對(duì)POF模型大鼠自噬的影響，探討其防治POF的相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

1　動(dòng)物

160只SPF級(jí)雌性SD大鼠，9～10周齡，體重（220±20） g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物證號(hào)為SCXK（鄂）2015-0018。所有動(dòng)物均可自由獲得充足的食物和水，在實(shí)驗(yàn)前對(duì)其進(jìn)行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度20～24 ℃，濕度40%～60%。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2　主要藥物、試劑及儀器

毓麟珠的成分為：當(dāng)歸12 g，熟地黃12 g，菟絲子12 g，人參6 g，麩炒白術(shù)6 g，茯苓6 g，白芍6 g，杜仲6 g，鹿角霜6 g，花椒6 g，川芎3 g，炙甘草3 g。上述中藥飲片均從北京同仁堂科技股份有限公司購入，按常規(guī)方法煎煮，濃縮至每mL含原藥材2 g，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

戊酸雌二醇片（Delpharm Lille SAS）；環(huán)磷酰胺（Sigma-Aldrich）；EX527（SIRT1抑制劑）和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）購自碧云天生物科技公司；大鼠抗繆勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）、雌二醇（estradiol， E2）和促卵泡激素（follicle-stimulating hormone， FSH）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和過氧化氫酶（catalase， CAT）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（Solarbio，G1120）；兔源SIRT1、FoxO1和β-actin抗體（Cell Signaling Technology）；乙?；疐oxO1（acetylated FoxO1， Ac-FoxO1）抗體（ABclonal）；LC3B抗體（Abcam）。iMark680多功能酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；ABI Prism?7500型熒光定量PCR儀（ABI）；BX61電動(dòng)顯微鏡（Olympus）。

3　主要方法

3.1建模和分組在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每只大鼠的發(fā)情周期通過陰道涂片觀察7 d。篩選具有正常發(fā)情周期的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取26只大鼠作為正常（normal）組，其余134只大鼠用于造模，第1天腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，然后以8 mg/kg的劑量連續(xù)注射14 d以建立POF模型［15］。造模過程中，每天固定時(shí)間對(duì)大鼠進(jìn)行陰道涂片，在顯微鏡下觀察其異位周期變化。陰道上皮無動(dòng)情周期變化或動(dòng)情周期明顯延長，表明POF大鼠建模成功。15 d后，將130只造模成功的雌性大鼠隨機(jī)分為POF組、戊酸雌二醇組（簡稱雌二醇組）、低劑量毓麟珠（low-dose Yulinzhu）組、高劑量毓麟珠（high-dose Yulinzhu）組和毓麟珠+SIRT1抑制劑EX527組（簡稱毓麟珠+EX527組），每組26只。

3.2給藥分組完成后開始給藥，低、高劑量毓麟珠組大鼠分別灌胃7.56和15.12 g/kg的毓麟珠藥液，雌二醇組大鼠給予0.09 mg/kg的戊酸雌二醇溶液灌胃，毓麟珠+EX527組大鼠在給予15.12 g/kg毓麟珠藥液灌胃的同時(shí)，腹腔注射10 mg/kg EX527［16］，正常組和POF組大鼠給予等體積的生理鹽水灌胃和腹腔注射。灌胃體積為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)給藥3周。劑量換算：藥物的等效劑量根據(jù)人和動(dòng)物的體表面積計(jì)算，其中大鼠的日劑量相當(dāng)于成人的6.3倍。成人平均體質(zhì)量按70 kg換算，毓麟珠成人每日給藥劑量相當(dāng)于生藥84 g，則大鼠每日給藥劑量為84 g/70 kg×6.3=7.56 g/kg，因此設(shè)置低、高劑量藥物劑量為7.56和15.12 g/kg。戊酸雌二醇片，按每人每天1 mg，根據(jù)大鼠與人的體表面積進(jìn)行換算，所以大鼠灌胃劑量為1 mg/70 kg×6.3=0.09 mg/kg。

3.3樣本收集給藥結(jié)束后，每組隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行生育能力評(píng)估；從每組剩余大鼠身上進(jìn)行取材。首先，大鼠稱重，通過腹腔注射2%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）麻醉，切開腹部皮膚，充分暴露腹腔，鈍性解剖后從腹主動(dòng)脈采血。其次，取出卵巢并稱重，然后每組隨機(jī)選取6只大鼠的卵巢組織，研磨勻漿，制備10%組織勻漿液；每組剩余10只大鼠，將左側(cè)卵巢組織液氮速凍并儲(chǔ)存在-80 ℃以備進(jìn)一步分析，右側(cè)卵巢組織固定在4%多聚甲醛中，制備石蠟切片。

3.4卵巢指數(shù)記錄大鼠的雙側(cè)卵巢重量和體重，卵巢指數(shù)計(jì)算為卵巢重量/體重。

3.5血清E2、FSH和AMH水平測(cè)定通過腹主動(dòng)脈采血從大鼠模型中獲取血液樣本，靜置后在4 ℃下，以3 000×離心10 min，取上清保存于-20 ℃冰箱。按照ELISA試劑盒說明書操作檢測(cè)血清E2、FSH和AMH的水平。

3.6卵巢組織MDA、SOD和CAT水平測(cè)定將稱重的卵巢組織，按照1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，勻漿，勻漿后取上清液，按照試劑盒的說明檢測(cè)卵巢組織MDA含量及SOD和CAT活性。

3.7HE染色和卵泡計(jì)數(shù)卵巢組織用4%多聚甲醛固定24 h，脫水。隨后，將組織包埋在石蠟中并切成5 μm厚的切片，放置在載玻片上。用蘇木精和伊紅染色，拍照，在光學(xué)顯微鏡下分析卵巢組織形態(tài)學(xué)變化并分類測(cè)定各級(jí)卵泡數(shù)［17］。原始卵泡：卵母細(xì)胞周圍僅含有單層紡錘形顆粒細(xì)胞，體積??；初級(jí)卵泡：體積變大，卵母細(xì)胞周圍出現(xiàn)5～6層柱狀顆粒細(xì)胞；次級(jí)卵泡：卵泡體積更大，顆粒細(xì)胞增至6～12層；竇卵泡：至少有兩層帶卵泡腔的顆粒細(xì)胞，閉鎖卵泡：發(fā)育不成熟的卵泡出現(xiàn)退化，卵母細(xì)胞形態(tài)異常，甚至卵泡中沒有卵母細(xì)胞。

3.8TUNEL染色取卵巢組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化后與蛋白酶K在37 ℃下孵育25 min。然后，用3% H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min；加入TdT和dUTP酶反應(yīng)混合物覆蓋樣品，在37 ℃下避光孵育2 h。隨后，將細(xì)胞核用DAPI避光染色10 min?？篃晒獯銣鐒┓馄?，用熒光顯微鏡觀察切片，卵巢中的凋亡細(xì)胞被染成綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。每張切片檢測(cè)了5個(gè)隨機(jī)視野（每只大鼠3個(gè)切片，每組10只大鼠），總共檢查了每組150個(gè)隨機(jī)視野（5×3×10=150）。在每個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)數(shù)竇卵泡中TUNEL陽性顆粒細(xì)胞和總顆粒細(xì)胞。通過Image-Pro Plus 6.0軟件分析竇卵泡中TUNEL陽性顆粒細(xì)胞的百分比（%），以此表示顆粒細(xì)胞凋亡水平。

3.9免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢組織LC3B蛋白表達(dá)組織切片后經(jīng)脫蠟、水化、微波修復(fù)抗原后，用3%過氧化氫孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，5%牛血清白蛋白封閉后，滴加兔源Ⅰ抗LC3B（1∶200），4 ℃過夜，加Ⅱ抗（1∶100）室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察LC3B陽性表達(dá)并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析LC3B陽性區(qū)域的平均積分吸光度（）。

3.10RT-qPCR檢測(cè)卵巢組織LC3B、p62、beclin-1、Atg5和Atg7的mRNA表達(dá)使用Trizol試劑從卵巢組織中提取總RNA。然后從分離的RNA樣品中合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。使用熒光定量PCR試劑盒和ABI 7500熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR，評(píng)估目的基因的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。所有程序均按照制造商的說明進(jìn)行。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，75 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，使用2-ΔΔCt法分析mRNA表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)變化。每個(gè)樣品的分析重復(fù)3次。

表1　RT-qPCR引物序列

3.11Western blot檢測(cè)卵巢組織LC3A/B、p62、beclin-1、Atg5、Atg7、SIRT1、FoxO1和Ac-FoxO1蛋白表達(dá)卵巢組織樣品中的蛋白質(zhì)通過RIPA裂解液提取。使用分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。通過10% SDS-PAGE分離每個(gè)樣品的等量總蛋白（30 μg），電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。隨后將膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后與Ⅰ抗LC3A/B、p62、beclin-1、Atg5、Atg7、FoxO1（1∶1000）、SIRT1（1∶1 000）、Ac-FoxO1（1∶500）和GAPDH（1∶2 000）在4℃下孵育過夜。然后與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶3 000）在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。LC3A/B抗體用于檢測(cè)LC3-II/LC3-I比值。

3.12評(píng)估POF大鼠的生育能力進(jìn)行生育力評(píng)估以確認(rèn)毓麟珠對(duì)POF大鼠生育力的潛在影響。在毓麟珠給藥3周后，每組10只大鼠分別與具有生育能力的正常雄性大鼠（12周齡）以1∶1的比例配對(duì)，動(dòng)物在下午5點(diǎn)同籠，并在第2天上午9點(diǎn)左右進(jìn)行陰道涂片檢查，以確保1周內(nèi)交配成功。成功交配的動(dòng)物不再同居。兩周后，用戊巴比妥（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，頸椎脫臼處死。取出子宮，計(jì)數(shù)每窩幼仔數(shù)（胚胎數(shù)）。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間有差異進(jìn)一步采用SNK-檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢指數(shù)的影響

與正常組相比，POF組大鼠卵巢指數(shù)顯著降低（<0.05）；與POF組相比，高劑量毓麟珠組和雌二醇組大鼠卵巢指數(shù)顯著升高（<0.05）；與高劑量毓麟珠組相比，雌二醇組大鼠卵巢指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），毓麟珠+EX527組大鼠卵巢指數(shù)顯著降低（<0.05），見圖1A。

2　毓麟珠對(duì)POF大鼠血清E2、FSH和AMH水平的影響

與正常組相比，POF組大鼠血清E2和AMH水平顯著降低（<0.05），F(xiàn)SH水平顯著升高（<0.05）；與POF組相比，高劑量毓麟珠組和雌二醇組大鼠血清E2和AMH水平顯著升高（<0.05），F(xiàn)SH水平顯著降低（<0.05）；與高劑量毓麟珠組相比，雌二醇組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），毓麟珠+EX527組大鼠血清E2和AMH水平顯著降低（<0.05），F(xiàn)SH水平顯著升高（<0.05），見圖1B～D。

Figure 1.　Comparison of ovarian index （A） and serum E2（B）， FSH （C） and AMH （D） levels of rats in each group. Mean±SD. n=16. *P<0.05 vs normal group；#P<0.05 vs POF group；&P<0.05 vs estradiol group；△P<0.05 vs high-dose Yulinzhu group.

3　毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢組織MDA含量及SOD和CAT活性的影響

與正常組相比，POF組大鼠卵巢組織MDA含量顯著升高（<0.05），SOD和CAT活性顯著降低（<0.05）；與POF組相比，高劑量毓麟珠組和雌二醇組大鼠卵巢組織MDA含量顯著降低（<0.05），SOD和CAT活性顯著升高（<0.05）；與高劑量毓麟珠組相比，雌二醇組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），毓麟珠+EX527組大鼠卵巢組織MDA含量顯著升高（<0.05），SOD和CAT活性顯著降低（<0.05），見圖2。

Figure 2.　Comparison of MDA level （A）， and SOD （B） and CAT activity （C） in ovarian tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs normal group；#P<0.05 vs POF group；&P<0.05 vs estradiol group；△P<0.05 vs high-dose Yulinzhu group.

4　毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢形態(tài)及組織病理的影響

肉眼觀察可見，正常組卵巢外觀正常，呈紅色，表面有數(shù)個(gè)白色凸起點(diǎn)；與正常組相比，POF組大鼠的卵巢形態(tài)出現(xiàn)一定程度的萎縮，卵巢呈淡白色，表面凸起的斑點(diǎn)較少；與POF組相比，低、高劑量毓麟珠組和雌二醇組卵巢形態(tài)明顯恢復(fù)，接近正常，表面凸起點(diǎn)較多，且高劑量毓麟珠組與雌二醇組改善相似；與高劑量毓麟珠組相比，毓麟珠+EX527組大鼠卵巢體積縮小，呈淡白色，表面凸起的斑點(diǎn)減少。

HE染色結(jié)果顯示，正常組有不同發(fā)育階段的卵泡和黃體，與正常組相比，POF組各期卵泡空泡樣變化明顯，排列松散，卵泡閉鎖增多（<0.05），間質(zhì)纖維化，血管充血，卵巢原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇卵泡顯著減少（<0.05）；與POF組相比，低、高劑量毓麟珠組和雌二醇組卵母細(xì)胞形態(tài)明顯改善，卵巢原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇卵泡顯著增多（<0.05），閉鎖卵泡數(shù)量顯著下降（<0.05），高劑量毓麟珠組閉鎖卵泡數(shù)量減少幅度低于雌二醇組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）；與高劑量毓麟珠組相比，毓麟珠+EX527組原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇卵泡數(shù)量顯著降低（<0.05），閉鎖卵泡數(shù)量顯著升高（<0.05），見圖3、4。

Figure 3.　HE staining of rat ovarian tissues in each group. A： normal group， follicles and corpus luteum with different developmental stages； B： POF group， the follicles showed obvious vacuolar-like changes， loose arrangement， and increased follicular atresia； C： estradiol group， the morphological changes of oocytes were significantly improved， and the numbers of primordial follicles， primary follicles， secondary follicles and antral follicles increased significantly； D： low-dose Yulinzhu group， the morphological changes of oocytes were significantly improved， and the numbers of primordial follicles， primary follicles， secondary follicles and antral follicles increased significantly； E： high-dose Yulinzhu group， the morphological changes of oocytes were significantly improved， and the numbers of primordial follicles， primary follicles， secondary follicles and antral follicles increased significantly； F： Yulinzhu+EX527 group， the numbers of primordial follicles， primary follicles， secondary follicles and antral follicles decreased， and the number of atretic follicles increased. The scale bar=80 μm （upper） or 10 μm （lower）.

4　毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響

與正常組相比，POF組大鼠竇卵泡中顆粒細(xì)胞凋亡水平顯著升高（<0.05）；與POF組相比，低、高劑量毓麟珠組和雌二醇組顆粒細(xì)胞凋亡水平顯著降低（<0.05）；與高劑量毓麟珠組相比，雌二醇組顆粒細(xì)胞凋亡水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），毓麟珠+EX527組顆粒細(xì)胞凋亡水平顯著升高（<0.05），見圖5、6A。

Figure 4.　Changes in the numbers of follicles at all levels in the ovary of rats in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs normal group；#P<0.05 vs POF group；&P<0.05 vs estradiol group；△P<0.05 vs high-dose Yulinzhu group.

Figure 5.　TUNEL staining of rat ovarian tissues in each group. A： normal group； B： POF group； C： estradiol group； D： low-dose Yulinzhu group； E： high-dose Yulinzhu group； F： Yulinzhu+EX527 group. The scale bar=40 μm.

Figure 6. Comparison of the level of apoptosis （A） and the positive expression of LC3B protein （B） in ovarian tissues of rats in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs normal group；#P<0.05 vs POF group；&P<0.05 vs estradiol group；△P<0.05 vs high-dose Yulinzhu group.

5　毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢LC3B蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，POF組大鼠卵巢LC3B蛋白陽性表達(dá)顯著升高（<0.05）；與POF組相比，低、高劑量毓麟珠組和雌二醇組大鼠卵巢LC3B蛋白陽性表達(dá)顯著降低（<0.05）；與高劑量毓麟珠組相比，雌二醇組卵巢LC3B蛋白陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），毓麟珠+EX527組大鼠卵巢LC3B蛋白陽性表達(dá)顯著升高（<0.05），見圖6B、7。

Figure 7.　Immunohistochemical staining of LC3B in rat ovarian tissues in each group. A： normal group； B：POF group； C： estradiol group； D： low-dose Yulinzhu group； E： high-dose Yulinzhu group； F： Yulinzhu+EX527 group. The scale bar=20 μm.

6　毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢組織LC3B、p62、beclin-1、Atg5和Atg7 mRNA水平的影響

與正常組相比，POF組大鼠卵巢組織LC3B、beclin-1、Atg5和Atg7 mRNA水平均顯著升高（<0.05），p62 mRNA水平顯著降低（<0.05）；與POF組相比，低、高劑量毓麟珠組和雌二醇組大鼠卵巢組織LC3B、beclin-1、Atg5和Atg7 mRNA水平均顯著降低（<0.05），p62 mRNA水平顯著升高（<0.05）；與高劑量毓麟珠組相比，雌二醇組大鼠卵巢組織上述mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），毓麟珠+EX527組大鼠卵巢組織LC3B、beclin-1、Atg5和Atg7 mRNA水平均顯著升高（<0.05），p62 mRNA水平顯著降低（<0.05），見圖8。

Figure 8.　The mRNA levels of LC3B （A）， p62 （B）， beclin-1 （C）， Atg5 （D） and Atg7 （E） in ovarian tissues of rats in each group. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs normal group；#P<0.05 vs POF group；&P<0.05 vs estradiol group；△P<0.05 vs high-dose Yulinzhu group.

7　毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢組織LC3、p62、beclin-1、Atg5和Atg7蛋白水平的影響

與正常組相比，POF組大鼠卵巢組織LC3-II/LC3-I比值及beclin-1、Atg5和Atg7蛋白水平均顯著升高（<0.05），p62蛋白水平顯著降低（<0.05）；與POF組相比，低、高劑量毓麟珠組和雌二醇組大鼠卵巢組織LC3-II/LC3-I比值及beclin-1、Atg5和Atg7蛋白水平均顯著降低（<0.05），p62蛋白水平顯著升高（<0.05）；與高劑量毓麟珠組相比，雌二醇組大鼠卵巢組織上述蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），毓麟珠+EX527組大鼠卵巢組織LC3II/LC3I比值及beclin-1、Atg5和Atg7蛋白水平均顯著升高（<0.05），p62蛋白水平顯著降低（<0.05），見圖9。

Figure 9.　Protein levels of LC3-I， LC3-II， p62， beclin-1， Atg5 and Atg7 in ovarian tissues of rats in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs normal group；#P<0.05 vs POF group；&P<0.05 vs estradiol group；△P<0.05 vs high-dose Yulinzhu group.

8　毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢組織SIRT1、FoxO1和Ac-FoxO1蛋白水平的影響

與正常組相比，POF組大鼠卵巢組織SIRT1和FoxO1蛋白水平均顯著降低（<0.05），Ac-FoxO1蛋白水平顯著升高（<0.05）；與POF組相比，低、高劑量毓麟珠組和雌二醇組大鼠卵巢組織SIRT1和FoxO1蛋白水平均顯著升高（<0.05），Ac-FoxO1蛋白水平顯著降低（<0.05）；與高劑量毓麟珠組相比，雌二醇組大鼠卵巢組織上述蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），毓麟珠+EX527組大鼠卵巢組織SIRT1和FoxO1蛋白水平均顯著降低（<0.05），Ac-FoxO1蛋白水平顯著升高（<0.05），見圖10。

Figure 10.　Protein levels of SIRT1， FoxO1 and Ac-FoxO1 in ovarian tissues of rats in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs normal group；#P<0.05 vs POF group；&P<0.05 vs estradiol group；△P<0.05 vs high-dose Yulinzhu group.

9　毓麟珠對(duì)POF大鼠生育能力的影響

正常組大鼠均妊娠，受孕率為100%；與正常組相比，POF組大鼠的受孕率（40%）和胚胎數(shù)均顯著降低（<0.05）；與POF組相比，低、高劑量毓麟珠組和雌二醇組大鼠的受孕率（60%和80%）和胚胎數(shù)均顯著升高（<0.05）；與高劑量毓麟珠組相比，雌二醇組大鼠的受孕率（80%）和胚胎數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），毓麟珠+EX527組大鼠的受孕率（50%）和胚胎數(shù)均顯著降低（<0.05），見圖11。

Figure 11.　The number of embryos of rats in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs normal group；#P<0.05 vs POF group；&P<0.05 vs estradiol group；△P<0.05 vs high-dose Yulinzhu group.

討論

氧化應(yīng)激是誘發(fā)卵巢衰老的重要影響因素之一。研究表明，氧化應(yīng)激可以激活自噬，在生理狀態(tài)下，自噬通過負(fù)反饋?zhàn)饔帽Ｗo(hù)細(xì)胞。但是，在某些情況下，氧化應(yīng)激引起的過度自噬也會(huì)導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡［18］。因此，通過調(diào)節(jié)氧化還原水平以達(dá)到自噬的穩(wěn)態(tài)對(duì)POF的治療意義重大。

首先，本實(shí)驗(yàn)采用化療藥物環(huán)磷酰胺建立POF模型。環(huán)磷酰胺是常用的抗腫瘤藥物，具有顯著的免疫抑制作用和細(xì)胞毒作用；該藥物可抑制卵巢功能并破壞卵巢中的卵泡，進(jìn)而影響生育能力［19-20］，通常用于制作POF大鼠模型。在本研究中，腹腔注射環(huán)磷酰胺后，大鼠卵巢出現(xiàn)損傷，表現(xiàn)為卵巢指數(shù)下降，氧化應(yīng)激增加，各發(fā)育階段的卵泡數(shù)量明顯減少，閉鎖卵泡增多，發(fā)育期卵泡的顆粒細(xì)胞大量死亡，并且血清E2、AMH分泌水平下降，F(xiàn)SH水平升高。血清FSH水平升高表明環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢毒性程度，與E2和AMH水平結(jié)合將更好地作為卵巢儲(chǔ)備功能的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)［14］。這些數(shù)據(jù)與POF紊亂一致，證明卵巢功能明顯受損，通過這種方法成功建立了POF模型。

毓麟珠方中以熟地、當(dāng)歸、菟絲子和人參為主要藥物。熟地補(bǔ)益精血，可抵抗血清雌激素水平下降，減緩卵巢衰老；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，能改善卵巢血流動(dòng)力，在一定程度上抑制免疫性POF，并具有促進(jìn)卵泡發(fā)育、成熟的作用［21］；菟絲子補(bǔ)益肝腎，可提高雌激素水平，對(duì)POF有明顯療效［22］；人參大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)脾益肺，在抵抗衰老方面有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值，其主要活性成分人參皂苷Rg1已被報(bào)道可減少卵泡退化，抵抗卵巢衰老［17］。此外，當(dāng)歸、熟地和菟絲子也是現(xiàn)代中醫(yī)治療POF的核心藥物。鹿角霜、杜仲、花椒和川芎有溫養(yǎng)之勢(shì)，與補(bǔ)腎養(yǎng)血藥相配，既可宣滋陰藥物之滯，又能領(lǐng)補(bǔ)腎藥直入其地，促使卵泡成熟及排出。因此，毓麟珠現(xiàn)代常將其作為補(bǔ)腎、育卵、助孕之方，可減緩卵巢衰老［5-6］，并具有抗氧化應(yīng)激作用［23］。本研究結(jié)果顯示，高劑量毓麟珠可顯著改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF模型大鼠的卵巢功能，上調(diào)POF模型大鼠血清雌激素水平，抑制氧化應(yīng)激，改善卵巢組織的形態(tài)異常，增加成熟卵泡數(shù)量，減少卵泡閉鎖，并有效抑制顆粒細(xì)胞凋亡，與既往的研究結(jié)果一致。此外，本研究分析了毓麟珠給藥后POF大鼠的生育能力，結(jié)果表明毓麟珠顯著上調(diào)了POF大鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)，再次證實(shí)毓麟珠的抗氧化應(yīng)激和抗卵巢衰老功能。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探索。

已知生物老化過程由一系列相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制驅(qū)動(dòng)，包括氧化應(yīng)激、炎癥狀態(tài)和自噬功能，并通過不同的信號(hào)通路發(fā)揮作用［24］。SIRT1的NAD+依賴性去乙酰酶活性在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。SIRT1基因刺激抗氧化因子的表達(dá)，可修復(fù)因氧化應(yīng)激受損的細(xì)胞，并防止細(xì)胞功能障礙；在女性生殖系統(tǒng)中，SIRT1調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，其下調(diào)與卵巢儲(chǔ)備減少有關(guān)，還通過靶向?qū)β殉补δ芫S持至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的應(yīng)激反應(yīng)［25］。作為SIRT1的下游靶標(biāo)，F(xiàn)oxO1已被證實(shí)可被SIRT1去乙?；鳤c-FoxO1可促進(jìn)自噬，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。增強(qiáng)SIRT1表達(dá)可有效地減弱氧化刺激后的FoxO1乙?；?6］。據(jù)報(bào)道，激活SIRT1/FoxO1通路可抑制氧化應(yīng)激，改善自然衰老過程中的卵巢功能［12］。也有報(bào)道稱，通過抑制FoxO1介導(dǎo)的自噬可保護(hù)小鼠顆粒細(xì)胞免受氧化損傷［27］。在本研究中，我們觀察到，POF大鼠卵巢組織LC3B、beclin-1、Atg5和Atg7 mRNA，beclin-1、Atg5和Atg7蛋白水平，以及LC3-II/LC3-I比值高于正常大鼠，而p62 mRNA和蛋白水平降低，說明POF大鼠卵巢組織自噬被激活；Western blot結(jié)果顯示POF大鼠卵巢組織SIRT1和FoxO1蛋白水平顯著低于正常大鼠，而Ac-FoxO1蛋白水平顯著高于正常大鼠。這提示POF大鼠自噬的激活可能與SIRT1表達(dá)降低介導(dǎo)的FoxO1乙?；缴哂嘘P(guān)。給予毓麟珠干預(yù)后，SIRT1和FoxO1表達(dá)升高，Ac-FoxO1蛋白水平降低，同時(shí)卵巢組織自噬相關(guān)因子LC3B、beclin-1、Atg5和Atg7水平及LC3-II/LC3-I比值降低，p62水平升高，說明POF大鼠自噬被抑制，提示毓麟珠可能通過調(diào)控SIRT1/FoxO1通路，抑制POF大鼠自噬。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們接下來研究了毓麟珠介導(dǎo)的自噬抑制是否需要SIRT1/FoxO1通路。在毓麟珠處理的基礎(chǔ)上，使用SIRT1抑制劑EX527對(duì)POF大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，抑制SIRT1后毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢的保護(hù)作用被明顯減弱，同時(shí)其抑制氧化應(yīng)激和自噬的作用也被減弱，提示SIRT1/FoxO1通路參與了毓麟珠對(duì)POF大鼠卵巢的保護(hù)作用。

綜上所述，毓麟珠可能是通過激活SIRT1/FoxO1通路，抑制氧化應(yīng)激及細(xì)胞自噬，從而改善POF大鼠的卵巢功能。這可能是毓麟珠治療POF的機(jī)制之一。

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Regulatory effect of Yulinzhu on SIRT1-FoxO1-autophagy pathway in rats with premature ovarian failure

HE Xiao-lan1， WANG Kun-peng2， ZHOU Yue-xi1， WU Shang-rong1， HU Ya-jun1△

（1，，430030，；2，430030，）

To investigate the effect of Yulinzhu on autophagy of premature ovarian failure （POF） rats and analyze its mechanism of preventing and treating POF.Female SD rats were randomly divided into normal group， POF group， estradiol valerate group （estradiol group）， low-dose Yulinzhu group， high-dose Yulinzhu group， and Yulinzhu+silent information regulator 1 （SIRT1） inhibitor EX527 group （Yulinzhu+EX527 group）， with 16 rats in each group. The rats in low- and high-dose Yulinzhu groups were given Yulinzhu liquid by gavage at 7.56 and 15.12 g/kg， respectively. The rats in estradiol group were given estradiol valerate solution by gavage， and the rats in Yulinzhu+EX527 group were given 15.12 g/kg of Yulinzhu liquid by gavage and 10 mg/kg EX527 by intraperitoneal injection. The rats in normal group and POF group were given an equal volume of normal saline. These treatments were conducted once per day for 3 weeks. After the administration， the weight of both ovaries and body weight were recorded， and the ovarian index was calculated. ELISA was used to detect the serum levels of estradiol （E2）， follicle-stimulating hormone （FSH） and anti-Müllerian hormone （AMH） of the rats in each group. The levels of malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） in the ovarian tissue of rats in each group were detected. Hematoxylin-eosin （HE） staining and TUNEL staining were used to observe the pathological changes of the ovarian tissue of rats in each group. The numbers of follicles at various levels were counted， and the level of granulosa cell apoptosis in antral follicles was analyzed. Immunohistochemical method was used to detect the expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3B （LC3B） protein in ovarian tissues of rats in each group. RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of LC3B， p62， beclin-1， Atg5 and Atg7 in ovarian tissues of rats in each group. Western blot was used to detect the protein levels of LC3A/B， p62， beclin-1， Atg5， Atg7， SIRT1， forkhead box protein O1 （FoxO1） and acetylated FoxO1 （Ac-FoxO1） in ovarian tissues of rats in each group. Fertility in POF rats was assessed.Compared with normal group， the ovarian index， serum E2and AMH levels， ovarian tissue SOD and CAT activity， numbers of ovarian primordial follicles， primary follicles， secondary follicles and antral follicles， p62 mRNA and protein levels， SIRT1 and FoxO1 protein levels， pregnancy rate and embryo number of the rats in POF group were significantly reduced， while the serum FSH level， ovarian tissue MDA level， atretic follicle number， granulosa cell apoptosis level， ovarian LC3B protein positive expression， LC3B， beclin-1， Atg5 and Atg7 mRNA levels， beclin-1， Atg5， Atg7 and Ac-FoxO1 protein levels， and LC3-II/LC3-I ratio were significantly increased （<0.05）. Compared with POF group， the ovarian index， serum E2and AMH levels， ovarian tissue SOD and CAT activity， numbers of ovarian primordial follicles， primary follicles， secondary follicles and antral follicles， p62 mRNA and protein levels， SIRT1 and FoxO1 protein levels， pregnancy rate and embryo number of the rats in high-dose Yulinzhu group and estradiol group were significantly increased， while the serum FSH level， ovarian tissue MDA level， atretic follicle number， granulosa cell apoptosis level， ovarian LC3B protein positive expression， LC3B， beclin-1， Atg5 and Atg7 mRNA levels， beclin-1， Atg5， Atg7 and Ac-FoxO1 protein levels， and LC3-II/LC3-I ratio were significantly reduced （<0.05）. EX527 was able to significantly weaken the protective effect of Yulinzhu on ovarian function in POF rats.Yulinzhu may activate the SIRT1/FoxO1 signaling pathway to inhibit oxidative stress and autophagy， and improve the ovarian function of POF rats.

Yulinzhu； Premature ovarian failure； Oxidative stress； Autophagy； SIRT1-FoxO1 signaling pathway

R711.75； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.06.017

1000-4718（2022）06-1091-14

2021-12-20

2022-04-29

湖北省衛(wèi)健委中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（No. ZY2019M005）

Tel： 18062033176； E-mail： 2862948345@qq.com

（責(zé)任編輯：宋延君，羅森）