高文欣, 李希琳, 傅煜軒

(蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院, 江蘇 蘇州, 215000)

作為一種新發(fā)傳染病病原體，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)全球大流行在世界范圍內(nèi)造成了巨大的健康危機和無以估量的損失，故亟需針對病毒的致病機制進行詳細(xì)闡述和研究[1]。SARS-CoV-2為正股單鏈RNA病毒，基因組長約30 kb, 包含多達(dá)8個非結(jié)構(gòu)基因(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF8b和ORF9)[2-3]。ORF3作為冠狀病毒特有的重要非結(jié)構(gòu)基因，可編碼翻譯2種輔助蛋白，即ORF3a和ORF3b。相關(guān)研究[4]表明，冠狀病毒輔助蛋白ORF3a、ORF3b廣泛參與宿主免疫調(diào)控，在病毒的致病性中發(fā)揮著重要作用，且能夠反映病毒毒力，還是病毒RNA復(fù)制、組裝以及釋放所必需的。不同冠狀病毒ORF3a、ORF3b基因序列保守性較差，易突變或缺失[5]。目前, SARS-CoV-2輔助蛋白ORF3a、ORF3b的功能尚不明確，本研究探討了特異性輔助蛋白ORF3a、ORF3b對SARS-CoV-2致病性的影響，以期為深入理解其致病機制并提出針對性防控策略奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肺細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫; ploy(I∶C)購自美國Sigma公司; RIPA裂解液、Lipofectamine 3000、SYBR Green Master Mix試劑均購自美國Life Technologies公司; 二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司; 多聚甲醛、TritonX-100化學(xué)試劑購自南京化學(xué)試劑股份有限公司; MyD88、TRAF6和GAPDH一抗均購自美國CST公司; pFLAG-NC、pFLAG-ORF3a、pFLAG-ORF3b表達(dá)載體和S、M、E及N表達(dá)載體購自美國Addgene公司; PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司; ABI-7500實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(美國Applied Biosystems公司); Olympus FluoView FV10i熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 總RNA提取及炎癥因子檢測

將A549細(xì)胞鋪板，密度為60%～80%, 對A549細(xì)胞予以ploy(I∶C)刺激并通過Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染ORF3a或ORF3b表達(dá)載體，設(shè)置2組分別轉(zhuǎn)染ORF3a表達(dá)載體(pFLAG-ORF3a組)、ORF3b表達(dá)載體(pFLAG-ORF3b組)，并設(shè)置未處理組(Mock組)和單純ploy(I∶C)刺激組(control組)。24 h后通過Trizol試劑對各組細(xì)胞進行總RNA提取，使用PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，以GAPDH為內(nèi)參，使用SYBR Green Master Mix試劑通過ABI-7500實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀進行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)。設(shè)置40個循環(huán)反應(yīng)，以所得Ct平均值計算基因表達(dá)量。引物序列: β干擾素(IFN-β)正向引物5′-TAGCACTGGCTGGAATGAG-3′, 反向引物5′-GTTTCGGAGGTAACCTGTAAG-3′; 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)正向引物5′-CCCAGGGACCTCTCTCTAATCA-3′, 反向引物5′-GCTACAGGCTTGTCACTCGG-3′; 白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)正向引物5′-AATCTGTACCTGTCCTGCGTGTT-3′, 反向引物5′-TGGGTAATTTTTGGGATCTACACTCT-3′; 白細(xì)胞介素-6(IL-6)正向引物5′-AGTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-3′, 反向引物5′-TGACAAACAAATTCGGTACATCCT-3′;GAPDH正向引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 反向引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá)

將密度為60%～80%的A549細(xì)胞鋪板，給予IFN-β刺激后，應(yīng)用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染ORF3a或ORF3b表達(dá)載體，分別設(shè)置為IFN-β+pFLAG-ORF3a組[IFN-β(+)、pFLAG-ORF3a(+)、pFLAG-ORF3b(-)]、IFN-β+pFLAG-ORF3b組[IFN-β(+)、pFLAG-ORF3a(-)、pFLAG-ORF3b(+)], 并設(shè)置未處理組[IFN-β(-)、pFLAG-ORF3a(-)、pFLAG-ORF3a(-)]和IFN-β刺激組[IFN-β(+)、pFLAG-ORF3a(-)、pFLAG-ORF3a(-)], 24 h后，加入RIPA裂解液冰上裂解15 min, 以12 000 g離心10 min, 取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，通過BCA法檢測蛋白濃度后，將1×上樣緩沖液和蛋白混合, 98 ℃煮5 min, 進行上樣電泳，每個樣本上樣量總蛋白為50 μg。轉(zhuǎn)膜、封閉2 h后，給予MyD88、TRAF6和GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，以TBST緩沖液洗滌3次后，加二抗室溫孵育60 min, 用TBST緩沖液洗滌3次后進行曝光。

1.4 SARS-CoV-2假病毒顆粒收集及感染

用S、M、E、N表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(轉(zhuǎn)染比例為8∶6∶8∶3), 設(shè)置2組分別轉(zhuǎn)染ORF3a表達(dá)載體(pFLAG-ORF3a組)、ORF3b表達(dá)載體(pFLAG-ORF3b組)，并設(shè)置未轉(zhuǎn)染組(Mock組)和空載轉(zhuǎn)染組(pFLAG-NC組)。72 h后，收集細(xì)胞上清液，以10 000 g離心30 min去除細(xì)胞碎片，再以120 000 g超速離心3 h, 收集病毒顆粒沉淀，通過無血清培養(yǎng)基懸浮后，將收集到的4組SARS-CoV-2假病毒顆粒加入過表達(dá)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)的A549細(xì)胞(A549-ACE2)中, 24 h后，細(xì)胞以4%多聚甲醛固定，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕洗，通過倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像，統(tǒng)計各組被SARS-CoV-2假病毒感染的細(xì)胞(GFP陽性細(xì)胞)占比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad軟件8.0進行圖形表示和統(tǒng)計分析，所有結(jié)果均顯示為3次獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同處理組之間的差異采用t檢驗或單因素方差分析(one-way ANOVA)進行分析，雙側(cè)檢驗P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ORF3a、ORF3b對SARS-CoV-2假病毒顆粒組裝與釋放的影響

將各組SARS-CoV-2假病毒顆粒加入A549-ACE2中, 24 h后通過熒光顯微鏡觀察并統(tǒng)計，結(jié)果顯示, pFLAG-ORF3a組、pFLAG-ORF3b組細(xì)胞組裝和釋放出的SARS-CoV-2假病毒顆粒量均高于Mock組和pFLAG-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001), 見圖1。由此表明, ORF3a、ORF3b可促進SARS-CoV-2假病毒顆粒的組裝與釋放。

A: 各組A549-ACE2細(xì)胞經(jīng)SARS-CoV-2假病毒感染的熒光顯微鏡下觀察結(jié)果(放大100倍); B: 各組GFP陽性細(xì)胞情況比較(與Mock組、pFLAG-NC組比較, ***P<0.001)。圖1 SARS-CoV-2假病毒感染A549-ACE2細(xì)胞的熒光顯微鏡下觀察與統(tǒng)計

2.2 ORF3a、ORF3b對宿主細(xì)胞干擾素應(yīng)答的影響

給予A549細(xì)胞ploy(I∶C)刺激以誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答，并轉(zhuǎn)染ORF3a或ORF3b表達(dá)載體, 24 h后檢測各組IFN-β表達(dá)水平。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示, control組IFN-β相對表達(dá)量高于Mock組，而pFLAG-ORF3a組、pFLAG-ORF3b組IFN-β相對表達(dá)量低于control組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001), 說明ORF3a、ORF3b表達(dá)均可顯著抑制ploy(I∶C)所誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)水平，見圖2A。Western blot檢測結(jié)果顯示, IFN-β刺激組MyD88、TRAF6蛋白表達(dá)量高于未處理組，而IFN-β+pFLAG-ORF3a組、IFN-β+pFLAG-ORF3b組MyD88、TRAF6蛋白表達(dá)量低于IFN-β刺激組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001), 見圖2B, 提示ORF3a、ORF3b表達(dá)均能抑制干擾素信號通路中關(guān)鍵蛋白MyD88、TRAF6的表達(dá)水平，進而抑制干擾素應(yīng)答。

A: 各組細(xì)胞IFN-β相對表達(dá)量比較(組間比較, ***P<0.001); B: 各組干擾素信號通路蛋白表達(dá)量的Western blot檢測結(jié)果。圖2 ORF3a、ORF3b對宿主細(xì)胞干擾素應(yīng)答的影響

2.3 ORF3a、ORF3b對宿主細(xì)胞炎癥應(yīng)答的影響

采用qRT-PCR法檢測A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染ORF3a或ORF3b表達(dá)載體后的炎癥因子表達(dá)情況，結(jié)果顯示, pFLAG-ORF3a組、pFLAG-ORF3b組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6相對表達(dá)量均高于pFLAG-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.001), 見圖3，說明ORF3a和ORF3b可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。

A: 各組細(xì)胞TNF-α相對表達(dá)量比較; B: 各組細(xì)胞IL-1β相對表達(dá)量比較; C: 各組細(xì)胞IL-6相對表達(dá)量比較。與pFLAG-NC組比較, **P<0.01, ***P<0.001。圖3 ORF3a、ORF3b對宿主細(xì)胞炎癥應(yīng)答的影響

3 討 論

SARS-CoV-2目前仍處于全球大流行狀態(tài)，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生活，但SARS-CoV-2的致病性尚未闡明，故亟需深入研究以控制疫情傳播態(tài)勢[6-7]。ORFs是一類零散分布在結(jié)構(gòu)基因之間或內(nèi)部的編碼39～274個氨基酸的特異性蛋白，保守性較差，易突變[3-4]。這些ORFs蛋白對病毒的復(fù)制、致病性或免疫調(diào)控發(fā)揮著重要作用，包括促進炎癥產(chǎn)生、抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[8-9]。相關(guān)研究[10]指出, ORF8a或ORF8b通過泛素化酶體途徑介導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)降解，抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，協(xié)助嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)逃避宿主的免疫防御。另有報道[11]發(fā)現(xiàn)，有些ORFs蛋白是冠狀病毒的重要毒力因子及致病因子，具有較好的免疫原性，例如SARS-CoV的ORF3b蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，具備良好的免疫原性。

SARS-CoV-2理論上至少能夠編碼翻譯7個特異性非結(jié)構(gòu)蛋白(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF 7b、ORF8和ORF10)。雖然SARS-CoV-2和SARS-CoV的病毒基因組序列相近，兩者生活周期及其所引發(fā)疾病的臨床表現(xiàn)也類似，但對比分析氨基酸序列可發(fā)現(xiàn), SARS-CoV-2與SARS-CoV最主要的差異性序列表現(xiàn)在S蛋白(76%)和非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3(72%)、ORF8(40%)中[8-9]。ORF3作為冠狀病毒特有的重要非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒生活周期和致病性方面至關(guān)重要。ORF3a包含6個功能域(Ⅰ～Ⅵ), 這6個功能域分別與病毒毒力、感染性、離子通道形成和病毒釋放緊密相關(guān)，但SARS-CoV-2的ORF3a的6個功能域在氨基酸序列上均與SARS-CoV的ORF3a具有差異性[12], 且SARS-CoV-2的ORF3b蛋白只有22個氨基酸，遠(yuǎn)少于SARS-CoV的ORF3b蛋白的154個氨基酸[13-14], 提示SARS-CoV-2編碼翻譯的ORF3a、ORF3b蛋白的功能可能與SARS-CoV并不同。此外，感染SARS-CoV-2后的Vero細(xì)胞中，除了結(jié)構(gòu)基因蛋白(N、S、M)外, ORF3a是胞內(nèi)最豐富的表達(dá)轉(zhuǎn)錄本之一，而ORF10可能并不表達(dá)[2], 進一步提示ORF3蛋白在SARS-CoV-2生活周期及致病過程中扮演著重要角色。

本研究聚焦于SARS-CoV-2特異性非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3a、ORF3b在調(diào)控病毒組裝、釋放以及干擾素、炎癥應(yīng)答過程中的作用。SARS-CoV-2假病毒組裝和釋放檢測結(jié)果顯示, ORF3a和ORF3b可促進SARS-CoV-2假病毒顆粒的組裝和釋放，提示ORF3a和ORF3b在輔助病毒顆粒組裝和釋放等過程中扮演著重要角色，其活性可能與宿主中的病毒載量有關(guān)。干擾素表達(dá)是宿主抵抗病毒等微生物感染最重要的抗感染應(yīng)答之一，本研究發(fā)現(xiàn), ORF3a、ORF3b表達(dá)可顯著抑制ploy(I∶C)誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)水平，進一步證明干擾素應(yīng)答的減弱是通過抑制干擾素信號通路中關(guān)鍵蛋白MyD88、TRAF6表達(dá)水平來實現(xiàn)的，提示ORF3a和ORF3b的表達(dá)能夠為病毒提供有利的復(fù)制和組裝環(huán)境，使得病毒更高效地復(fù)制和組裝，并拮抗宿主抗病毒反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn), ORF3a或ORF3b的表達(dá)可誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)，說明ORF3a、ORF3b可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，提示宿主機體的炎癥損傷可能與病毒的ORF3a、ORF3b表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3a、ORF3b能夠促進SARS-CoV-2組裝、釋放，誘導(dǎo)宿主炎癥應(yīng)答，并抑制宿主干擾素表達(dá)。本研究為更好地了解病毒編碼翻譯產(chǎn)生的特異性非結(jié)構(gòu)蛋白在SARS-CoV-2致病性中的作用提供了新的見解，也為新型冠狀病毒肺炎致病機制的深入研究和針對性藥物的研發(fā)等提供了新的依據(jù)，同時能夠為設(shè)計改造減毒病毒株或無毒病毒株提供理論基礎(chǔ)，并為深入理解病毒誘導(dǎo)宿主固有免疫應(yīng)答與炎癥因子風(fēng)暴的機制和遏制SARS-CoV-2的傳播與致病性提供創(chuàng)新性科學(xué)理論。