劉 佳, 范春光, 孫立魁, 趙增琳

(山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院/國家藥品監(jiān)督管理局材料器械安全性評價重點實驗室/山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室, 山東 濟南, 250101)

表面接觸醫(yī)療器械使用過程中與人體皮膚接觸，其材料本身和(或)其可瀝濾物可能會導致皮膚產生刺激反應。因此，相關產品上市前須對其進行皮膚刺激評價。根據(jù)ISO10993系列方法，評價方法有3種，分別為人體試驗、體內動物試驗和體外試驗，其中常用的是家兔皮膚刺激試驗。體外重建人類表皮模型(RhE)皮膚刺激試驗是針對家兔皮膚刺激試驗研發(fā)的替代模型[1]。RhE模型是采用人正常角蛋白細胞體外培養(yǎng)形成的包括基底層、棘層、顆粒層和有功能的角質層在內的三維皮膚模型[1]。RhE模型體外皮膚刺激試驗是將試驗樣品置于模型表面孵育一定時間后清除，再檢測模型中細胞的活性，與陰性對照相比得到相對活性(活度)，根據(jù)組織活度預測試驗樣品的刺激性。該模型被廣泛用于化學品和化妝品皮膚刺激試驗[2], 前期實驗室通過研究[3]證明該體外皮膚刺激模型也可應用在醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗中。

白細胞介素(IL)-1α作為促炎細胞激動素，能夠誘導表皮層角質形成細胞炎癥級聯(lián)反應[4]。此外，被動釋放的IL-1α能夠進一步誘導細胞因子 IL-6和IL-8的表達[5]。IL-8對中性粒細胞和淋巴細胞具有強烈的趨化作用[6]。研究[7]表明, RhE皮膚刺激模型培養(yǎng)基中IL-1α和IL-8的表達增加，其可以作為皮膚刺激反應的分子標記物。本研究針對國產化的SkinEthicTMRHE模型在醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗方面進行研究，選取2種典型的表面接觸醫(yī)療器械產品，采用SkinEthicTMRhE模型試驗檢測其皮膚刺激性，并探討模型中相關蛋白，尋找出該模型合適的分子標記物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品: 分別選取水膠體敷料(記為T1)和物理抗菌洗液(記為T2)作為試驗樣品。此外，本研究還選取了2個濃度典型的皮膚刺激陽性物質乳酸作為效力檢測樣品。

1.1.2 模型信息: SkinEthicTMRHE模型(上海斯安膚諾生物科技有限公司)。

1.1.3 主要試劑: 組織培養(yǎng)基(上海斯安膚諾生物科技有限公司)、杜氏磷酸鹽緩沖溶液(DPBS, 1×, gibco)、氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司)、芝麻油(ACROS)、20%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液(sigma)、噻唑藍(MTT, sigma)、異丙醇(滬試)、人IL-1α 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(R&D)、人IL-8 ELISA試劑盒(R&D)。

1.2 方法

1.2.1 試驗樣品浸提液制備: 試驗組T1, 取水膠體敷料按照3.0 cm2/mL的比例加入極性浸提介質(氯化鈉注射液)，于(37.0±1.0) ℃、60轉/min震蕩條件下，浸提(72.0±2.0) h制備極性浸提液，記為T1-1; 另取敷料按照相同比例，加入芝麻油，同條件制備非極性浸提液T1-2。試驗組T2, 物理抗菌洗液原液不作處理，記為T2。試驗組T3, 1.5%和4%的乳酸/氯化鈉注射液溶液，分別記為T3-1和T3-2。介質對照, 對照按照樣品制備方法同樣處理，分別制備，氯化鈉注射液對照記為VC-1; 同芝麻油介質對照VC-2。陰性對照, DPBS不作處理作為陰性對照，記為NC。陽性對照, 氯化鈉注射液配制的1%的SDS極性陽性對照，記為PC-1; 芝麻油制備1%的SDS非極性陽性對照，記為PC-2。

1.2.2 體外RhE模型培養(yǎng): 將預孵育后小室轉移至預先加入1 mL培養(yǎng)基的6孔板中，吸取100 μL試驗液或對照液置于每個模型表皮表面(重復3孔)，培養(yǎng)箱中孵育(24.0±2.0) h。孵育后，使用無菌DPBS沖洗小室內組織，去除殘留樣品，對模型進行MTT檢測。使用酶標儀選擇570 nm波長濾光片讀取光密度(OD)值。

1.3 數(shù)據(jù)計算及試驗接受準則

計算6個空白對照孔OD值均值。其余各孔OD值均扣除空白均值得修正值。計算每塊組織經修正的OD值均值。將NC組均值設為100%活度。每塊組織修正OD值均值除以NC組OD值均值得到每塊組織活度。再計算各組組織活度均值即為各組組織活度。陰性對照和介質對照組3塊組織OD均值≥0.8～<2.8, 且3塊組織活度的標準差(SD)≤20%; 介質對照組活度為80%～120%, 且陽性對照組活度<40%; 3塊組織活度的標準差(SD)≤20%。試驗樣品組3塊組織活度的標準差(SD)≤20%。

結果判定: 試驗組活度≤50%, 即表示刺激反應陽性(I)。采用浸提液進行試驗時，其中一種介質浸提液顯示陽性結果(活度≤50%且SD≤20%)則認為此醫(yī)療器械/材料有刺激性(I)。

ELISA檢測 IL1α、IL-8含量: 孵育24 h后，收集小室下的培養(yǎng)基，按照試劑盒規(guī)定的操作步驟測定IL-1α和IL-8的含量，計算蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以平均值表示，行t檢驗;P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 體外RhE試驗

研究結果顯示，使用RhE模型進行體外刺激試驗中，試驗樣品水膠體敷料和物理抗菌洗液皮膚刺激指數(shù)為均0, 為無刺激反應; 1%乳酸皮膚刺激指數(shù)為0, 為無刺激反應; 4%乳酸皮膚刺激指數(shù)為I, 顯示為有刺激反應，見圖1。組織病理學顯示，陽性對照組上皮細胞變性壞死。4%乳酸組上皮細胞萎縮，角質層脫落。其他組上皮組織織未見明顯異常，見圖2。

NC: DPBS陰性對照組; VC-1: 氯化鈉注射液對照組; VC-2: 芝麻油對照組; PC-1: 1%的SDS極性陽性對照液組; PC-2: 1%的SDS非極性陽性對照組; T1-1: 水膠體敷料極性浸提介質(氯化鈉注射液)組; T1-2: 水膠體敷料非極性浸提介質(芝麻油)組; T2: 物理抗菌洗液原液組; T3-1: 1.5%乳酸/氯化鈉注射液溶液; T3-2: 4%乳酸/氯化鈉注射液溶液。圖1 RhE體外皮膚刺激模型組織活度

RhE模型蘇木精-伊紅(HE)染色結果,放大倍數(shù)為200倍。A: DPBS陰性對照組; B: 氯化鈉注射液對照組; C: 1%的SDS極性陽性對照液組; D: 1%的SDS非極性陽性對照組; E: 水膠體敷料極性浸提介質(氯化鈉注射液)組; F: 水膠體敷料非極性浸提介質(芝麻油)組; G: 物理抗菌洗液組; H: 4%乳酸/氯化鈉注射液溶液。圖2 RhE模型組織病理學圖片示例

2.2 體外RhE模型體外皮膚刺激試驗培養(yǎng)基中IL-1α表達結果

ELISA結果顯示，陽性對照組培養(yǎng)基中IL-1α表達均高于相應介質對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001); 水膠體敷料極性(氯化鈉注射液)浸提實驗組IL-1α表達與氯化鈉注射液對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 水膠體敷料非極性(芝麻油)浸提實驗組IL-1α表達與芝麻油對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。物理抗菌洗液原液組IL-1α表達與氯化鈉注射液對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。1.5%、4.0%乳酸組與氯化鈉注射液對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05), IL-1α與皮膚刺激指數(shù)呈正相關，見圖3。

ELISA實驗檢測RhE模型培養(yǎng)基中IL-1α的表達情況。NC: DPBS陰性對照組; VC-1: 氯化鈉注射液對照組; VC-2: 芝麻油對照組; PC-1: 1%的SDS極性陽性對照液組; PC-2: 1%的SDS非極性陽性對照組; T1-1: 水膠體敷料極性浸提介質(氯化鈉注射液)組; T1-2: 水膠體敷料非極性浸提介質(芝麻油)組; T2: 物理抗菌洗液原液組; T3-1: 1.5%乳酸/氯化鈉注射液溶液組; T3-2: 4%乳酸/氯化鈉注射液溶液組。與相應的介質對照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。圖3 體外RhE模型體外皮膚刺激試驗培養(yǎng)基中IL-1α表達結果(n=3)

2.3 體外RhE試驗培養(yǎng)基中IL-8表達結果

ELISA結果顯示，陽性對照組培養(yǎng)基中IL-8表達均低于相應介質對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.001); 水膠體敷料極性、非極性浸提實驗組IL-8表達與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。物理抗菌洗液原液組IL-8表達與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。1.5%、4.0%乳酸實驗組IL-8表達低于氯化鈉注射液對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01), 見圖4。

ELISA實驗檢測RhE模型培養(yǎng)基中IL-8的表達情況。NC: DPBS陰性對照組; VC-1: 氯化鈉注射液對照組; VC-2: 芝麻油對照組; PC-1: 1%的SDS極性陽性對照液組; PC-2: 1%的SDS非極性陽性對照組。T1-1: 水膠體敷料極性浸提介質(氯化鈉注射液)組; T1-2: 水膠體敷料非極性浸提介質(芝麻油)組; T2: 物理抗菌洗液原液組; T3-1: 1.5%乳酸/氯化鈉注射液溶液; T3-2: 4%乳酸/氯化鈉注射液溶液; 與相應的介質對照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。圖4 體外RhE模型體外皮膚刺激試驗培養(yǎng)基中IL-8表達結果(n=3)

3 討 論

針對醫(yī)療器械浸提液體外刺激試驗進行的國際實驗室間比對研究[8-9]驗證了RHE模型能夠有效地評價醫(yī)療器械皮膚刺激反應。本實驗室針對RHE模型也進行了大量研究，證明該模型能夠應用于醫(yī)療器械皮膚刺激替代試驗。既往研究[10-11]表明，在使用體外皮膚刺激模型研究空氣污染物刺激性實驗中, IL-1α和IL-8表達均增加，其可以作為敏感的分子標記物，提示相關的皮膚刺激性。但也有研究認為，對皮膚刺激性物質和致敏性物質刺激RHE模型后, IL-1α和IL-8表達情況有所不同。當局部用致敏物質孵育時，細胞內外 IL-1α水平非常低，但會引起明顯的細胞毒性，其IL-8的釋放量最大。但只存在皮膚刺激物下，作者觀察到反向的細胞因子釋放譜，并認為IL-8、IL-1α和MTT在皮膚刺激試驗中都是必要的，可以用來區(qū)分物質的刺激性和致敏性[12]。在本研究中，對試驗液孵育24 h后培養(yǎng)基中的IL-8表達含量進行測定，結果發(fā)現(xiàn)IL-8在組織活度低的培養(yǎng)基中含量很低，在組織活度高的培養(yǎng)基中的含量基本一致。由于本研究模型主要檢測皮膚刺激物對SkinEthicTMRHE模型的刺激作用，而文獻檢索也表明IL-8的表達與致敏性相關性更高。分析結果認為, IL-8與皮膚刺激性關系不大，但可能與該模型檢測致敏性物質有關。本研究結果表明，體外皮膚刺激模型培養(yǎng)基中IL-1α的表達含量隨試驗樣品刺激性的增加而增加。與本實驗室前期MTT法中測得的吸光度情況相比，體現(xiàn)出更高的敏感性。同時，實驗室前期家兔刺激試驗結果也顯示, IL-1α表達能夠更為敏感地監(jiān)測出皮膚刺激反應。另一方面，對于臨界值不好判斷的結果，應該結合MTT結果和體內實驗，防止出現(xiàn)假陽性或假陰性結果。

綜上所述，醫(yī)療器械體外皮膚刺激試驗中, RhE模型體外皮膚刺激試驗中，培養(yǎng)基中IL-1α表達量與刺激指數(shù)呈正相關，和IL-8與皮膚刺激指數(shù)呈負相關。IL-1α可作為RhE模型體外皮膚刺激試驗的分子標記物，提高醫(yī)療器械刺激試驗體外替代模型的準確性。