袁 圓 曾 輝 肖 艷 楊麗霞 崔曉嬌 楊 韻 吳后呂

(1. 長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410036；2. 國家酒類產品質量檢驗檢測中心〔湖南〕，湖南 長沙 410036；3. 湖南國際旅行衛(wèi)生保健中心〔長沙海關口岸門診部〕，湖南 長沙 410011)

酸性大紅GR又名酸性紅73，為黃光紅色粉末，屬于偶氮類生物染色劑，溶于水、乙醇和乙二醇乙醚，不溶于大多數有機溶劑，主要用于毛絲織物、皮革和紙張的染色，還可用于塑料、木材和水泥等的著色[1-4]。酸性大紅GR是一種強致癌物，為食品禁用色素[5-6]。由于酸性大紅GR具有水溶性好、顏色鮮艷、固色能力強和價格低廉等優(yōu)點，有不法經營者為了美化食品的外觀，將其充當食用色素添加到食品中。2021年7月28日，國家市場監(jiān)管總局發(fā)布的《食品中酸性大紅GR的測定》[7]等4項食品補充檢驗方法的公告(2021年第28號)，為檢測食品中違法添加酸性大紅GR提供了有力的技術支撐。

不確定度是表征合理賦予被測量值的分散性，與測量結果相聯系的參數[8-10]。當檢測結果能提供不確定度數值時可以很大程度提高測量結果的準確性[11-12]。研究擬參照BJS 202107《食品中酸性大紅GR的測定》中的液相色譜法測定自制陽性橙汁中酸性大紅GR含量(定量限為1.5 mg/kg)，依據JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，對檢測過程中的不確定度來源進行分析，以期為高效液相色譜法檢測橙汁等復雜基質中酸性大紅GR含量的測量及結果判定提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸性大紅GR標準品：純度98.8%，北京曼哈格生物科技有限公司；

甲酸：色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

甲醇：色譜純，德國默克化工公司；

乙酸銨、無水乙醇、氨水、檸檬酸、乙酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

橙汁：市售；

陽性橙汁：實驗室制備。

1.2 儀器和設備

高效液相色譜儀：Waters Alliance e2695型，配2998PDA檢測器，美國沃特世公司；

超純水儀：Milli-Q型，美國密理博公司；

電子天平：XS205DU型，梅特勒—托利多國際貿易(上海)有限公司；

離心機：ST16R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

氮吹儀：N-ECAP45型，美國Organomation公司；

固相萃取裝置：HSE-24B型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 依據BJS 202107《食品中酸性大紅GR的測定》進行樣品處理。

(1) 樣品提?。壕_稱取2.0 g(精確到0.000 01 g)樣品于50 mL離心管中，用移液器移取10 mL無水乙醇—氨水—水(V無水乙醇∶V氨水∶V水=7∶2∶1)溶液加入到樣品中，搖勻后超聲5 min，以8 000 r/min的速度離心5 min，將上清液轉移至50 mL離心管中。重復上述步驟提取2次，合并提取液，于60 ℃水浴下用氮氣吹至5 mL以下。用檸檬酸溶液調節(jié)pH至3.0～4.0。

(2) 樣品凈化：加少許水將1 g聚酰胺粉調成糊狀，倒入提取液中攪拌均勻后再倒入G3垂熔漏斗中抽濾，依次用60 ℃ pH 4的水、甲醇—甲酸(V甲醇∶V甲酸=6∶4)溶液和水洗滌容器、垂熔漏斗3～5次，直到洗出的水溶液pH為中性后，再用無水乙醇—氨水水(V無水乙醇∶V氨水∶V水=7∶2∶1)溶液洗滌3～5次，至吸附的色素完全解吸后，收集全部解吸液至離心管，用乙酸調節(jié)pH直至中性，于60 ℃水浴下氮吹至近干，加入甲醇—水(V甲醇∶V水=6∶4)溶液溶解，定容至5 mL后渦旋混勻，用0.45 μm 尼龍膜過濾，濾液供高效液相色譜分析測定。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇—0.01 mol/L乙酸銨(V甲醇∶V乙酸銨=60∶40)；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長512 nm；進樣量20 μL。

1.3.3 標準溶液的配制

(1) 標準儲備液：精確稱取0.025 34 g酸性大紅GR標準品溶于水中，定容至25 mL A級容量瓶中，得到1.00 mg/mL標準儲備液。

(2) 標準中間液：用移液管(A級)準確移取2.00 mL標準儲備液于100 mL容量瓶(A級)中，用水定容，得到20.0 μg/mL標準中間液。

(3) 標準工作液：用移液管(A級)分別準確移取標準中間液0.10，0.25，0.50，2.50，5.00，10.00 mL于10 mL容量瓶(A級)中，用水稀釋定容，得到質量濃度分別為0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL的標準工作液。

2 結果分析

2.1 數學模型

橙汁中酸性大紅GR含量按式(1)計算：

(1)

式中：

X——試樣中酸性大紅GR含量，mg/kg；

v——試樣定容體積，mL；

c——測定試液中酸性大紅GR的質量濃度，μg/mL；

c0——空白試液中酸性大紅GR的質量濃度，μg/mL；

m——試樣質量，g；

1 000——單位換算系數。

2.2 不確定度來源分析

通過對檢測過程和數學模型分析得出，高效液相色譜法測定橙汁中酸性大紅GR不確定度來源如圖1所示。

圖1 不確定度來源分析圖

2.3 不確定度的評定

2.3.3 標準系列溶液配制引入的不確定度urel(std1)

(2) 配制標準系列溶液需使用3支1 mL A級移液管，1支2 mL A級移液管，2支5 mL A級移液管，5個10 mL A級容量瓶，1個100 mL A級容量瓶，計算得出各量具引入的相對不確定度見表1，配置標準系列溶液引入的相對不確定度urel(c)按式(2)計算，結果見表2。

表1 各量具引入的不確定度

表2 配制標準系列溶液引入的相對不確定度

(2)

式中：

urel(c)——配置標準系列溶液引入的不確定度；

urel(v1)——移液管引入的相對不確定度；

v2——移液管移取的體積，mL；

v3——移液管的體積，μg/mL；

urel(v4)——容量瓶引入的相對不確定度；

10——容量瓶的體積，mL。

通過式(2)，可以得出標準系列各濃度引入的不確定度的詳細過程。

因此，標準系列溶液配制引入的相對標準不確定度為：

2.3.4 標準曲線擬合引入的不確定度urel(std2) 標準曲線各濃度分別為0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL，對標準曲線的每個濃度點重復分析3次，用最小二乘法對標準曲線各濃度與峰面積進行擬合，得到線性回歸方程見表3。通過式(3)計算得出殘差標準差s為2 274.98。樣品平行測定7次，測得樣液平均濃度C0=0.586 8，定容體積為5.0 mL，將各數值代入式(1)，計算得出試樣中酸性紅含量為1.46 mg/kg，再由式(4)求得擬合標準曲線得出的標準不確定度為0.021。

表3 線性回歸方程

(3)

(4)

式中：

Aj——第i個標準溶液的第j次計數值；

B1——標準曲線的斜率，53 154.78；

B0——截距，1 386.48；

Ci——第i個標準溶液的質量濃度，μg/mL；

C0——樣品的平均質量濃度，0.586 7 μg/mL；

S——工作液峰面積殘差的標準差，2 274.98；

P——樣品的測量次數，7；

n——標準曲線各點的測量次數，18；

urel(std2)——標準曲線引入的標準不確定度。

2.3.6 樣液的定容引入的相對標準不確定度urel(νd)

2.3.8 重復測定樣品引入的相對不確定度urel(X) 取被測樣品重復檢測7次(n=7)，按式(5)和式(6)計算，得出樣品中酸性大紅GR含量、重復測定的標準偏差、相對標準不確定度見表4。

表4 重復測定引入的不確定度

(5)

(6)

式中：

Xi——酸性大紅GR第i次測量的含量，mg/kg；

n——測量次數，7；

s(X)——重復測定的標準偏差；

urel(X)——重復測定引入的相對不確定度。

2.3.9 樣品回收率引入的相對不確定度urel(R) 對空白試樣進行添加量為3.0 mg/kg的加標試驗(n=7)，按式(7)、式(8)和式(9)計算，得出酸性大紅GR的回收率引入相對標準不確定度見表5。

表5 樣品回收率引入的不確定度

(7)

(8)

(9)

式中：

Ri——酸性大紅GR第i次測量的回收率，%；

n——測量次數，7；

s(R)——回收率的標準偏差；

u(R)——回收率引入的不確定度；

urel(R)——回收率引入的相對不確定度。

2.3.10 合成相對標準不確定度urel根據式(10)合成各分量得到：urel=0.038。

(10)

2.3.11 擴展不確定度 該測量誤差的分布類型屬正態(tài)分布，在置信水平為95%時，取k=2。擴展不確定度U=urel×k×X=0.038×2×1.46=0.11。

2.3.12 不確定度評定結果 采用高效液相色譜法測定橙汁中酸性大紅GR含量，檢測結果表示為X=(1.46±0.11) mg/kg (k=2)。

3 結論

研究所用自制陽性橙汁樣品中酸性大紅GR含量的檢測結果為X=(1.46±0.11) mg/kg (k=2)，通過建立數學模型，對高效液相色譜法測定橙汁中酸性大紅GR含量可能引入的不確定度分量進行評定。評定結果表明，標準物質的純度、標準曲線擬合和高效色譜儀分析引入的不確定度為測定過程中不確定度的主要來源。在實際檢測中可以通過提高標準品純度、控制標準曲線校準過程和定期對儀器進行維護保養(yǎng)，來減小測量結果的不確定度，從而提高檢測結果的準確度。