高瀝文，陳世國，張 裕，強 勝

（南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，南京 210095）

1 RNA干擾的基本作用機制

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是真核生物中一種由RNA介導的保守調(diào)節(jié)機制，又稱RNA沉默（RNA silencing），是一種能以同源序列配對的形式靶向目標基因，在轉錄水平或轉錄后水平有效沉默或抑制目標基因表達的技術。RNA沉默現(xiàn)象在1990年首次被發(fā)現(xiàn)，Napoli等[1]為培育顏色更深的紫色矮牽牛花，將查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS）基因轉入牽?；ㄖ校欢鄶?shù)花朵的顏色不僅沒有加深，反而變?yōu)榛ò咨蛉咨?，研究者將這種當外源轉入的基因與內(nèi)源基因同源時會導致兩者的表達都被抑制的現(xiàn)象稱為“共抑制”（co-suppression）。1992年，Romano和Macino[2]在粗糙脈胞菌Neurosporacrassa中首次發(fā)現(xiàn)外源轉基因的沉默，稱之為“抑制”（quelling）。1998年，F(xiàn)ire等[3]發(fā)現(xiàn)在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans中，雙鏈 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）比單鏈 RNA（single-stranded，ssRNA）能更有效地抑制靶標的轉錄表達，并將特異性基因轉錄后沉默這一現(xiàn)象稱為RNA干擾，這一發(fā)現(xiàn)標志著RNAi革命的誕生。

RNA干擾最顯著的特征就是能產(chǎn)生具有序列特異性調(diào)控功能的小RNA（small RNA，sRNA）。sRNA在許多生物過程中發(fā)揮關鍵作用，包括維持RNA的穩(wěn)定性及加工、生物和非生物應激反應，以及形態(tài)和發(fā)育事件的調(diào)節(jié)[4]。真核生物轉錄組富含兩種內(nèi)源性sRNA：小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和微RNA（micro-RNA，miRNA）。siRNAs通常指一類20～24 nt雙鏈RNA分子，其由更長的前體加工而成，來源于基因組或外源性RNA序列，如病毒和轉基因轉錄物[5,6]。miRNAs是由主要從位于蛋白質(zhì)編碼基因之間的區(qū)域轉錄而來的、含有莖環(huán)結構的原初 miRNA（primary-miRNA，pri-miRNA）產(chǎn)生的典型長度為20～22 nt的單鏈非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）[7,8]。通常，雙鏈RNA或者分子內(nèi)部能形成可折疊發(fā)夾結構的單鏈RNA可誘導RNA沉默。在沉默起始階段，dsRNA是誘導細胞產(chǎn)生RNAi的關鍵成分。dsRNA前體在細胞內(nèi)被稱為Drosha和/或Dicer的RNase III樣核酸內(nèi)切酶加工成siRNA，然后siRNA在效應階段與包含 AGO（Argonaute）蛋白的核酶復合物結合，形成 RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。在大多數(shù)情況下，RISC在轉錄后水平負調(diào)節(jié)靶基因表達[7-9]。RISC中的解旋酶將siRNA解旋為兩條單鏈，其中的反義鏈引導RISC與同源的靶mRNA結合，RISC中核酸內(nèi)切酶將靶mRNA切割，從而阻斷其翻譯成蛋白質(zhì)的活性，引起靶基因沉默。在RNA聚合酶存在的情況下，可以觸發(fā)次級siRNAs的發(fā)生，以增強沉默效應即為擴增階段[10-11]。

近年來，有許多綜述從不同角度對 RNAi在植物品質(zhì)改良、植物抗蟲、抗真菌病害領域的研究和應用情況進行了總結。其中Kim[12]細化了從不同生物中克隆及鑒定新miRNA的標準：①小RNA的表達能通過技術手段檢測到；②存在發(fā)夾狀前體，且該序列中無大的凸起或環(huán)狀結構；③該序列在系統(tǒng)學上是保守的；④Dicer酶缺失突變會增加發(fā)夾狀前體的積累，只滿足上述條件之一不足以注釋為一個新miRNA。段成國等[13]介紹了miRNA介導的RNA調(diào)控途徑和siRNA介導的RNA沉默路徑的異同：miRNA和siRNA在代謝上共享著一些相似的蛋白和路徑，但二者來源及作用方式不同，為進一步理解真核生物基因表達調(diào)控的多層次性及復雜性奠定基礎。王愛英等[14]著重介紹了RNAi在植物品質(zhì)改良中的作用，當前RNAi技術在提升農(nóng)作物品質(zhì)（包括改良油脂、淀粉品質(zhì)、提高植物營養(yǎng)物質(zhì)或有效成分、降低有害物質(zhì)含量）、改良園藝植物性狀和提高植物果實品質(zhì)等方面均有應用。王偉偉等[15]總結了RNAi的作用機理及其在植物改良、生物防治、疾病預防和治療中的應用進展并提出解決脫靶問題、提高靶基因的沉默效率是在實際應用中面臨的巨大問題。胡少茹等[16]系統(tǒng)總結了RNAi在害蟲防治方面的研究進展，并介紹了靶標基因選擇、昆蟲中腸核酸酶及不同昆蟲dsRNA剪切方式對RNAi效率的影響，進而介紹了脂質(zhì)體修飾和納米粒子包被能提高RNAi效率，為該技術應用提供了重要參考。本文對近年來RNAi技術在作物保護方面的研究進展進行了梳理，對使用RNAi農(nóng)藥的風險、益處及面對的挑戰(zhàn)進行了歸納，通過總結RNAi在殺蟲劑、殺菌劑等方面研究進程，以期對開發(fā)基于RNAi技術的生物除草劑提供借鑒和依據(jù)。

2 RNAi技術的發(fā)展現(xiàn)狀及其在作物保護方面的應用

2.1 RNAi技術的發(fā)展現(xiàn)狀

經(jīng)過20年的發(fā)展，RNAi技術本身已處于成熟期。在醫(yī)學領域，2018年8月，全球第一個RNAi醫(yī)療產(chǎn)品——Alnylam公司的Patisiran（商品名Onpattro，用于成人患者治療由遺傳性轉甲狀腺素蛋白介導的淀粉樣變性引起的多發(fā)神經(jīng)?。┇@美國FDA（Food and Drug Administration，食品藥品監(jiān)督管理局）批準上市，在RNAi藥物發(fā)展史上具有里程碑的意義。在農(nóng)藥領域，利用RNAi技術研發(fā)農(nóng)藥處于起步階段。RNA農(nóng)藥是利用RNAi原理開發(fā)的僅針對病、蟲、草等農(nóng)業(yè)有害生物的目標基因而不影響農(nóng)作物的遺傳表達的一種新型生物制劑產(chǎn)品。RNA農(nóng)藥是具有高度特異性和系統(tǒng)性的全新機制藥物，它結合了化學農(nóng)藥和轉基因作物兩種科技的優(yōu)勢，有望帶來農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展道路上的又一次科技革命，是當前和未來科技戰(zhàn)略必爭的前沿領域。根據(jù)各公司公告數(shù)據(jù)顯示，孟山都公司從 2010年起每年投入數(shù)百萬美元進行相關產(chǎn)品的研發(fā)，拜耳、先正達、陶氏化學和巴斯夫等化工巨頭們也先后開始對RNA農(nóng)藥以及相關轉基因產(chǎn)品的研發(fā)進行投資。預計在未來5～10年，以RNAi技術為核心的RNA農(nóng)藥將進入研發(fā)熱潮，在農(nóng)藥市場上RNA農(nóng)藥有望實現(xiàn)零的突破。

雖然RNAi生物農(nóng)藥還處于起步階段，但自從發(fā)現(xiàn)RNAi以來，科學家在開發(fā)這種獨特的作物保護技術方面取得了許多成果。2014年，Hu等[17]通過注射將dsRNA輸送到小菜蛾Plutellaxyllostella體內(nèi)，增加了小菜蛾幼蟲的死亡率，為解決昆蟲抗藥性提供了新思路。2016年，高夢燭等[18]通過構建 RNAi膜蛋白（Putative membrane related protein，PMRP）載體并將其導入轉基因擬南芥，發(fā)現(xiàn)PMRP表達量的降低可增強擬南芥的抗寒性，為增強作物抗逆性提供了理論依據(jù)。RNAi通過利用序列依賴的作用模式在信使RNA水平上發(fā)揮作用。由于設計了互補的 dsRNA分子，具有高的靶向特異性，與傳統(tǒng)的農(nóng)用化學品相比，允許種植者更精確地瞄準特定的害蟲[19]。RNAi方法還提供了關于植物病害中涉及的宿主和病原體因素的重要線索，在某些情況下，RNAi誘導分子能夠識別可被操縱的、影響病害發(fā)展的基因，這些基因就是靶標基因[20]。靶標基因可以是植物內(nèi)源基因[21]、植物病原體基因（病毒[22]和真菌[23]）、其他害蟲或雜草基因（昆蟲[24]、螨蟲[25]和雜草[26]）。通過使用不同類型的RNAi誘導分子，例如發(fā)夾結構的hpRNA、人工微RNA（artificial micro-RNA，amiRNA）和/或雙鏈RNA，可以阻斷這些靶標基因的功能[27]。

2.2 RNAi的生物殺蟲劑

據(jù)統(tǒng)計，昆蟲導致的農(nóng)業(yè)損失占總損失量的20%～40%[28]。研究人員預計，未來幾年，全球氣溫每升高1度，昆蟲的為害就會增加10%～25%，這些為害主要出現(xiàn)在溫帶地區(qū)[29]。常年使用大量化學殺蟲劑已經(jīng)導致一些昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生了很強的抗藥性[30]，這促使著人們必須尋求更有效的新型殺蟲劑。

使用HIGS（host-induced gene silencing，宿主誘導基因沉默）和SIGS（spray-induced gene silencing，噴霧誘導基因沉默）技術開發(fā)RNAi生物殺蟲劑，已被證明是傳統(tǒng)殺蟲劑的潛在替代品[31]。自從真核生物基因沉默機制闡明以來，這種技術在害蟲治理中的應用已經(jīng)取得了重大進展。以前，RNAi曾被用作檢測昆蟲基因功能的工具，但Baum等[32]開發(fā)了一種口服施用（通過人工飲食或轉基因玉米）的RNAi方法，通過靶向各種液泡型ATP合成酶（vacuolar-type ATPase，V-ATPase）亞單位以及α-微管蛋白來誘導玉米根螢葉甲DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte死亡。同年，Mao等[33]報道了通過喂食表達細胞色素P450基因的特異性dsRNA的植物葉片能抑制棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的生長。這些研究為將RNAi技術應用到農(nóng)業(yè)殺蟲劑的開發(fā)中提供了可能性。最近，拜耳公司開發(fā)的能有效控制玉米根蟲Diabroticavirgifera的轉基因玉米‘SmartStax PRO’（型號為MON87411）品種在加拿大（2016年）和美國（2017年）等多個地區(qū)被批準進行商業(yè)化種植[34]，這被認為是RNAi技術在農(nóng)業(yè)中應用的一個里程碑事件。近期，該品種得到阿根廷食用和種植的最終授權，在歷經(jīng)多年的監(jiān)管審批過程，終于邁出了向農(nóng)民推出的第一步[35]。事實證明RNAi技術已經(jīng)可以作為新的害蟲管理工具提供給種植者。通過這種RNAi轉化方法即研發(fā)轉基因植物，在特定害蟲中誘導基因沉默是一種極具良好發(fā)展前景的害蟲管理方法[36,37]。

此外，研究者們也探索了用非轉基因的方式來應用RNAi技術，即外源施用dsRNA。然而，在植物中通過外源應用dsRNA來觸發(fā)昆蟲體內(nèi)RNAi是一項具有挑戰(zhàn)的任務。首先，在被昆蟲咀嚼/吮吸攝取之后，dsRNAs必須在具有唾液核酸酶的中腸或血淋巴中能夠留存下來，因為核酸酶能迅速降解dsRNA。其次，必須通過內(nèi)吞途徑或跨膜Sid-1通道蛋白介導途徑從上皮細胞中攝取dsRNAs，由Dicer2加工成siRNAs，再裝載到AGO2上并觸發(fā)局部RNAi。因此，為了在整個昆蟲體內(nèi)建立有效的沉默系統(tǒng)，必須想辦法讓RNAi分子（dsRNA或sRNA）系統(tǒng)地擴散到相應的靶標細胞中。在植物和秀麗隱桿線蟲中，RNAi的系統(tǒng)傳播通過依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerases，RdRp）進行擴增，但一般昆蟲基因組中缺乏RdRp蛋白基因。盡管存在這些障礙，但Baum等[32]通過喂食表達dsRNA的轉基因玉米成功誘導玉米根螢葉甲幼蟲大量死亡的研究，證明了RNAi可以在昆蟲中進行系統(tǒng)傳播。事實上，盡管該過程具體涉及到哪些酶仍未被明確，但鞘翅目昆蟲似乎也表現(xiàn)出了系統(tǒng)的RNAi擴散[38]。

外源性的dsRNA能直接應用于植物抗蟲是由Hunter等[24]首次發(fā)現(xiàn)的，他們使用根部浸泡法和樹干注射法，將針對亞洲柑橘木虱Diaphorinacitri、馬鈴薯木虱Bactericeracockerelli和玻璃翅葉蟬Homalodisca vitripennisArg激酶的dsRNA遞送到來檬Citrusaurantifolia中，在單次施用7周后，在2.5 m高的樹中仍能檢測到引入的dsRNA，而且取食了該植物的木虱和玻璃翅葉蟬體內(nèi)也能檢測到dsRNA的存在。隨后，陸續(xù)有研究表明：在植物中外源應用體外轉錄/合成的dsRNA后，對害蟲的控制都達到了顯著的效果。2015年，Ivashuta等[39]在番茄中施用靶向玉米根蟲ATPase的dsRNA，提高了玉米根蟲的死亡率。Li等[40]通過根浸泡讓水稻和玉米直接吸收dsRNA，然后將吸收后的植株分別飼喂稻褐飛虱Nilaparyatalugens和亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis，都觀察到了幼蟲死亡率增高的現(xiàn)象。2018年，Ellango等[41]將靶向小菜蛾酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）基因的dsRNA涂抹到甘藍Brassicaoleracea葉片上讓小菜蛾幼蟲取食，結果發(fā)現(xiàn)幼蟲死亡率大大提高。2019年，研究人員還發(fā)現(xiàn)，通過向煙草和豇豆植株噴灑含有菜豆普通花葉病毒Beancommonmosaicvirus（BCMV）外殼蛋白dsRNA的生物黏土納米片，能保護植物免受蚜蟲介導的病毒傳播引起的BCMV感染[42]。最近，Yan等[43]通過更換納米載體改進了大豆蚜蟲上的經(jīng)皮dsRNA傳遞系統(tǒng)。該系統(tǒng)能吸收噴霧法施用的dsRNA，并助其在4 h內(nèi)穿透蚜蟲體壁，抑制靶基因的表達從而提高蚜蟲死亡率。這些研究表明，dsRNA在作物保護中正朝著實際應用邁出重要的步伐。有報道顯示，孟山都公司正在通過一項名為“BioDirect”的技術來開發(fā)RNAi生物農(nóng)藥，通過外源施用dsRNA制劑來幫助植物抵御昆蟲和病原體的攻擊。該技術已經(jīng)通過了研發(fā)過程的第一階段，成功減少了馬鈴薯葉甲Leptinotarsa decemlineata幼蟲對馬鈴薯的感染、成蟲的出現(xiàn)和多個野外試驗點的植物落葉；抑制了番茄斑萎病毒Tamato spottedwiltvirus（TSWV）的病毒濃度，降低疾病癥狀，改善番茄和胡椒的植物健康；成功控制了抗草甘膦長芒莧Amaranthuspalmeri和莧菜藤子（waterhemp）的生長[44,45]。先正達公司的科學家也正在開發(fā)基于RNAi的生物防治產(chǎn)品，以保護馬鈴薯植物免受馬鈴薯葉甲的為害[46]。

2.3 RNAi的生物殺菌劑

植物病原真菌是導致作物減產(chǎn)和影響全球糧食安全的主要因素[47]。然而，化學殺真菌劑的大量、廣泛使用往往會給人類健康和生態(tài)系統(tǒng)帶來嚴重后果。因此，迫切需要更安全、環(huán)保的替代品[48-50]。此外，一些殺真菌劑，如嘧菌酯或肟菌酯，由于抗性菌株的出現(xiàn)將不再高效[51,52]。

為了克服這些問題，利用基因工程開發(fā)新的真菌病害防治方法被寄予厚望。2010年，Nowara等[23]將表達靶向白粉病菌Blumeriagraminis葡聚糖轉移酶基因Avra10的dsRNA轉入大麥Hordeumvulgare中，成功增強了大麥對白粉病的抗性，正式開啟了RNA沉默技術在真菌病害中應用的大門。2013年，Panwar等[53]利用改進后的根癌農(nóng)桿菌介導的瞬時表達系統(tǒng)，將含有小麥葉銹菌Pucciniatriticina基因PtMAPK1、PtCYC1和PtCNB的發(fā)夾狀沉默構建體轉入小麥葉片中，導致葉片中產(chǎn)生大量真菌基因特異性siRNA分子，進而導致葉銹菌內(nèi)源靶基因的轉錄減少了近70%、小麥葉片病癥減輕；他們還利用大麥條紋花葉病毒介導的RNAi系統(tǒng)，將葉銹菌基因片段遞送至小麥中，也能提高小麥對葉銹菌的抗性[54]。Koch等[55]通過在植株中表達細胞色素P450羊毛甾醇C14α-脫甲基酶基因CYP51的RNAi結構，成功增強了擬南芥和大麥對鐮刀菌屬Fusariumspp.的抗性，這是通過HIGS方法提高植物抗性的優(yōu)秀實例。

隨后，Wang等[56]也于2016年在擬南芥和番茄中利用HIGS沉默灰葡萄孢Botrytiscinerea的DCL基因，降低了灰葡萄孢的致病性。其實，Wang[56]和他的團隊在2013年已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢的sRNA分子可以轉移到宿主植物細胞中，作為 sRNA效應物抑制宿主免疫并實現(xiàn)侵染。這是第一次發(fā)現(xiàn)真菌病原體將sRNA傳遞到宿主細胞并“劫持”植物的證據(jù)。在灰葡萄孢侵染擬南芥Arabidopsisthaliana后，病原菌的Bc-siR3.2可以裝載到AGO1上，并靶向參與植物免疫反應的絲裂原活化蛋白激酶基因MPK2和MPK1以及番茄MAPKKK4序列的轉錄物。此外，氧化應激相關基因（PRXIIF）和細胞壁相關激酶（WAK）分別被Bc-siR3.1和Bc-siR5靶向[57]。這種sRNA效應因子主要由RNA內(nèi)切酶Dicer的同源蛋白（Dicer-like，DCL）Bc-DCL1和Bc-DCL2產(chǎn)生[56]。此外，Bc-siR37能靶向3種免疫應答基因WRKY7，PMR6和FEI2，這3種基因編碼的分別是免疫相關轉錄因子、果膠裂解酶、富含亮氨酸重復（leucine rich repeat，LRR）的受體激酶，過量表達Bc-siR37的植物對灰葡萄孢表現(xiàn)出較高敏感性[58]。最近，Hu等[59]成功利用基于菜豆莢斑駁病毒Beanpodmottlevirus（BPMV）的HIGS抑制了豆薯層銹菌Phakopsorapachyrhizi在大豆中的積累，顯著降低了葉片中大豆銹病癥狀的發(fā)展。所以，研發(fā)生產(chǎn)表達真菌同源基因序列的轉基因植物是一種非常有前途的抗真菌方法[60,61]。

最近一些研究表明，通過外源應用真菌、細菌產(chǎn)生的或體外合成的dsRNAs、siRNAs和hpRNAs誘導轉錄后基因沉默來提高植物對病害的抗性已成為一個有潛力的發(fā)展策略[62]。例如，局部應用靶向禾谷鐮孢Fusariumgraminearum麥角甾醇生物合成相關基因（CYP51A、CYP51B和CYP51C）的dsRNAs或siRNAs可抑制大麥中的真菌生長[63]；用靶向亞洲鐮孢菌Fusariumasiaticummyosine5的dsRNA噴灑小麥植株可降低真菌毒性[64]；在歐洲油菜Brassicanapus中，外源應用靶向灰葡萄孢不同基因的dsRNAs可降低灰霉病的發(fā)病水平[65]；外源應用針對灰葡萄孢siRNA生物合成相關蛋白（如DCL1和DCL2）基因的dsRNAs或siRNAs，顯著減少了各種水果和蔬菜中的灰霉病[66]；對大豆直接噴灑靶向病原菌目標基因的dsRNAs，可將葉片中豆薯層銹菌Phakopsorapachyrhizi的積累量降低75%[59]。

2.4 RNAi的抗病毒制劑

研究表明，RNAi是植物抵抗病毒感染的防御機制之一。與真菌來源的siRNA類似，病毒來源的dsRNA也可以通過DCL加工成病毒來源的siRNA，然后引導AGO蛋白靶向宿主基因來減輕植物的病害癥狀[67,68]。用攜帶宿主植物基因外顯子片段的病毒載體來侵染植株能以序列特異性方式抑制病毒的基因表達[69]。Kamachi等[22]用轉基因技術轉化煙草，在花椰菜花葉病毒Cauliflowermosaicvirus（CaMV）35S啟動子的控制下，將含有黃瓜綠斑駁花葉病毒Cucumbergreenmottlemosaicvirus（CGMMV）外殼蛋白（CP）基因序列的反向重復RNA導入煙草，成功賦予了煙草對CGMMV的抗性，并能在抗性植株體內(nèi)檢測到CP序列的特異性siRNA。Shimizu等[70]將水稻矮縮病毒Ricedwarfvirus（RDV）的非結構蛋白Pns12的特異性RNA干擾構建體引入水稻植株后，得到的植株體內(nèi)積累了構建體特異性的siRNA，并且該水稻后代對病毒感染有很強的抗性。此外，Zhang等[71]通過導入能表達幾個較短但每個都包含一種病毒高保守序列的dsRNA，成功獲得了對苜蓿花葉病毒Alfalfamosaicvirus（AMV）、菜豆莢斑駁病毒Beanpodmottlevirus（BPMV）和大豆花葉病毒Soybeanmosaicvirus（SMV）都具有抗性的轉基因植株。這些結果證明了RNA干擾策略對于在主要作物中建立病毒抗性的有效性。

同樣的，外源施用也適合防治病毒。2001年，Tenllado和Díaz-Ruíz[72]將辣椒輕斑駁病毒Peppermild mottlevirus（PMMoV）、煙草蝕紋病毒Tobaccoetchvirus（TEV）、苜?；ㄈ~病毒分別與體外轉錄的977 bp、1483 bp和1124 bp的dsRNAs機械接種在本氏煙草Nicotianabenthamiana葉片上，這三種dsRNA分別針對辣椒輕斑駁病毒復制酶、煙草蝕紋病毒輔助成分和苜?；ㄈ~病毒RNA3序列，結果發(fā)現(xiàn)PMMoV感染被減弱了。當前，使用RNAi技術已經(jīng)成功讓許多植物獲得了病毒抗性：如2010年，Gan等[73]向玉米噴灑能表達靶向甘蔗花葉病毒Sugarcanemosaicvirus（SCMV）外殼蛋白dsRNA的大腸桿菌EscherichiacoliHT115 (DE3)粗提取物，成功抑制了SCMV感染；2014年，Shen等[74]對番木瓜Caricapapaya機械共接種能表達針對番木瓜環(huán)斑病毒Papayaringspotvirus（PRSV）外殼蛋白序列的大腸桿菌M-JM109lacY粗提取物，得到的多數(shù)番木瓜植株對PRSV有抗性，且抗性在接種兩個月后保持不變；同年，Lau等[75]通過在蘭花Brassolaeliocattleyahybrida上機械接種能表達靶向建蘭花葉病毒Cymbidiummosaicvirus（CymMV）的dsRNA的大腸桿菌HT115 （DE3）粗提取物，成功減少了CymMV感染的癥狀；2016年，Konakalla等[76]在煙草中通過機械接種針對煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus（TMV）p126的體外轉錄的237 bp dsRNA，成功賦予煙草對TMV感染的顯著抗性；2018年，Kaldis等[77]對植株機械接種體外轉錄的、以小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV）輔助成分蛋白酶為靶標的 dsRNA，使得黃瓜、西瓜、南瓜等植物分別獲得了不同程度的抗性。由此可見，基于 RNA干擾技術的抗病毒方法是未來農(nóng)業(yè)中控制植物病毒的重要方法。

2.5 RNAi的生物除草劑

農(nóng)田雜草是導致農(nóng)作物減產(chǎn)的重要因素之一，在我國每年農(nóng)田雜草危害造成直接經(jīng)濟損失近千億元。目前，雜草的防治主要還是依賴于化學除草劑，然而人們在大規(guī)模使用化學除草劑的同時，也給環(huán)境造成了一系列的問題。此外，長期應用化學除草劑帶來的雜草抗藥性問題也越來越嚴重。迄今，全球 71個國家95種作物中已有266種植物（包含153種雙子葉植物和113種單子葉植物）對31類除草劑中的21類164種產(chǎn)生抗性[78]。

面對上述問題，2013年孟山都公司研究人員在“全球除草劑抗性挑戰(zhàn)”（Global Herbicide Resistance Challenge）國際會議上，介紹了利用RNAi技術進行草甘膦抗性雜草管理的探索試驗結果。他們以靶標酶EPSPS突變的抗草甘膦長芒莧為試驗材料，經(jīng)室內(nèi)盆栽和大田試驗表明，通過向抗草甘膦雜草長芒莧導入特異性的雙鏈RNA，能夠導致長芒莧細胞內(nèi)EPSPS基因沉默不產(chǎn)生5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，使其對草甘膦抗性丟失而恢復敏感性。這一結果表明可以直接利用精確的RNA片段來抑制植物體內(nèi)5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶的正常產(chǎn)生。報告還指出，RNAi也適用于其他類除草劑抗性治理，包括ALS（Acetolactate Synthase，乙酰乳酸合成酶）抑制劑pyrithlobac-Na和氯嘧磺隆、氟磺胺草醚和硝磺草酮[26]。由此可見，RNAi技術完全有潛力發(fā)展成為一種新的除草技術。其實，在2011年的一項專利中，Sammons等[79]就報道了在植物中應用外源dsRNA成功引發(fā)植物基因的RNA干擾的案例。他們用表面活性劑Silwet L-77對本氏煙草進行預處理，并噴灑體外轉錄的685 bp dsRNA和化學合成的、針對內(nèi)源性植物烯去飽和酶mRNA的21 nt sRNAs，成功對該酶的基因進行了沉默。該專利是對外源dsRNA能引發(fā)植物基因RNA干擾的首次報道，建立了通過葉面施用dsDNA、siRNA、ssRNA甚至是DNA分子來下調(diào)編碼植物除草劑抗性基因的轉錄水平的可能性。隨后，陸續(xù)有文獻報道可通過外源施用dsRNAs進行植物內(nèi)源基因的調(diào)節(jié)。Lau等[21]研究表明，將含有MYB1-dsRNAs的細菌粗提取物直接應用于石斛蘭Dendrobium hybrid的花蕾上，可抑制靶基因DhMyb1的表達，并改變了花細胞的表型（表皮細胞從錐形變成扁平）。Li等[40]研究表明，將擬南芥根系浸泡在含有dsMob1A的水溶液中，可抑制目標基因Mob1A的表達，擬南芥根的長度和數(shù)量受到顯著抑制，植株不能抽薹或開花。將水稻根浸泡在熒光標記的 dsEYFP（增強型黃色熒光蛋白）中24小時后，在水稻鞘、莖以及以水稻為食的褐飛虱體內(nèi)能觀察到熒光，且dsEYFP引起了RNAi關鍵基因Ago和Dicer轉錄水平升高。當把水稻根浸泡在dsActin中時，它們的生長也受到顯著抑制。這些研究表明，被吸收的dsRNA可以觸發(fā)植物RNAi[80]。因此，利用外施dsRNA對作物進行RNA干擾來達到防除雜草的目的有較高的可行性。

3 RNAi生物農(nóng)藥存在的問題與展望

3.1 使用RNAi生物農(nóng)藥的風險和益處

雖然基于RNAi的生物農(nóng)藥具有高效、特異性高等特點，但不可避免地存在許多風險，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：第一，潛在的偏離目標的影響。雖然RNAi被證明是高度序列特異性的，能定向降解目標轉錄物。然而，真核生物中RNAi途徑的保守性意味著如果非靶標生物與RNAi藥物存在足夠的轉錄物同源性，那么施用該藥物對非靶標生物的影響可能十分明顯[31]。非靶標效應包括對目標病原體體內(nèi)非靶標RNA或作物其他組織中的RNA產(chǎn)生干擾作用。如果將RNAi方法用于作物保護，則必須考慮潛在的無法預知的偏離目標的影響，但是這種影響是相對于天然存在的sRNA豐富度和RNA干擾活性來說的。sRNA測序已經(jīng)清晰地表明植物中天然存在數(shù)百萬種性質(zhì)不同的sRNAs，植物病毒感染還會誘導寄主植物產(chǎn)生成千上萬個性質(zhì)不同的sRNAs，它們通常針對整個病毒基因組[81]?，F(xiàn)今，已有研究者觀察到不同個體之間存在sRNA的轉移（表1），雜草和作物之間也存在這種情況，如菟絲子Cuscutacampestris在寄生擬南芥時可將自身22個核苷酸的miRNA作用于擬南芥的mRNAs[82]。因此，若雜草與作物之間轉移的sRNA包含了農(nóng)藥靶標基因，那么噴灑的農(nóng)藥將無差別攻擊作物和雜草。既然RNAi在真核生物中無處不在、無時無刻不在發(fā)生，那么，在研發(fā)的早期對偏離目標的可能性進行評估是非常必要的。當前，保險的方法是使用不保守的目標基因，這一點在蜜蜂中獲得了很好的證明，Arpaia等[83]將蜜蜂對專門針對害蟲的dsRNA沒有敏感性這一現(xiàn)象進行了細致的總結。隨著生命科學技術的飛速發(fā)展、基因組數(shù)據(jù)的快速積累，未來通過進行更細致的比較，使用計算機程序來設計和分析潛在的有效 siRNAs和dsRNAs，能夠盡可能減小甚至消除目標偏離的影響[84-86]。

表1 跨物種轉運的sRNAs及其作用靶點Table 1 sRNAs of cross-kingdom transport and its targets

第二，病原體和害蟲對RNA農(nóng)藥的抗性。植物病原體及害蟲是否會對基于RNAi的控制策略產(chǎn)生抗性？答案是肯定的，它們會在不同程度上針對某些目標產(chǎn)生抗性。當然，并不是只有在使用 RNA農(nóng)藥時病原體和害蟲才會產(chǎn)生抗性，許多植物病原體的抗性變異在使用傳統(tǒng)的植物疾病控制策略時早已出現(xiàn)。抗病毒RNAi可以賦予轉基因植物對病毒近乎免疫的抗性能力，但有報道稱病毒抗藥性的發(fā)生破壞了植物對這種病毒的抗性。Simón等[95]發(fā)現(xiàn)，帶有miRNA靶序列的Plumpoxvirus（PPV）病毒嵌合體通過靶序列中的突變逃脫了RNA沉默。有研究表明，可破壞基于RNAi的轉基因植株的病毒可以在實驗室條件下產(chǎn)生，也可在田間自然發(fā)生[96-97]。Lafforgue等[98]在實驗室條件下用25個獨立的蕪菁花葉病毒Turnipmosaicvirus（TuMV）種群在完全易感的野生型擬南芥中進化，通過侵染抗病毒感染的轉基因擬南芥來定期檢測逃逸突變體的存在，進而觀察到抗性破壞病毒逐漸增加。然而，這些變異體是否能與其他自然發(fā)生的病毒競爭還不得而知。不過，有一點十分重要，雖然已經(jīng)出現(xiàn)了相應的抗性破壞病毒，但是基于RNAi的轉基因抗病毒番木瓜和南瓜在田間試驗中對病毒的抗性水平仍然非常高[97]。

第三，病原體相互作用對RNA干擾效率的影響?；赗NAi生物農(nóng)藥的另一個潛在不良影響可能來自混合感染。RNAi可能單獨對靶標有效，但與另一個病原體復合侵染可能會影響其效果。Song等[99]將含有李屬壞死環(huán)斑病毒Prunusnecroticringspotvirus（PNRSV）反向重復序列的RNAi載體轉入兩種櫻桃砧木，一種櫻桃砧木對PNRSV敏感（Gisela 7），另一種對PNRSV和李矮縮病毒PrunedwarfVirus（PDV）耐受（Gisela 6）。當植物受到PNRSV和PDV（CH39）混合物的攻擊時，兩種轉化體都表現(xiàn)出對病毒的抗性，對兩種病毒耐受的未轉化Gisela 6雖未表現(xiàn)出病狀，但體內(nèi)能檢測到PNRSV，這表明PNRSV和PDV之間的相互作用可能導致RNAi的保護作用減弱。實際上，共同感染的病毒之間發(fā)生相互作用從而對植物的抗性產(chǎn)生不利影響的現(xiàn)象并不令人驚訝，因為抗病毒植株被天然病毒感染過程中也可能出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象。當具有番茄黃化曲葉病毒Tomatoyellowleafcurlvirus（TYLCV）抗性基因Ty-1或其等位基因Ty-3的轉基因番茄被TYLCV和黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus（CMV）混合感染時，植株的抗性會受損[100]。

第四，環(huán)境因子對RNA干擾的影響。許多研究表明溫度對植物中的病毒感染有直接影響[101-103]。溫度的影響與RNAi活性直接相關[104,105]，因此，對于田間那些受RNAi保護的植物來說，溫度很有可能影響植物的抗性續(xù)航力及RNA沉默效力。暴露在極端溫度下會導致病毒感染發(fā)生變化，如熱掩蔽過程中被感染植株的病毒癥狀減少[101,106,107]，而在低溫期病毒癥狀激增[108,109]。Szittya等[110]表明，轉基因和病毒誘導產(chǎn)生的建蘭環(huán)斑病毒（Cymbidiumringspottombusvirus，CymRSV）siRNAs在高溫時增加，這種增加會導致病毒積累的減少和病害的減弱，而低溫則抑制了siRNAs的產(chǎn)生。Ghoshal和Snafac[111]指出，溫度也能直接影響RNA沉默所涉及的酶，比如不僅在RNA干擾中起作用，也在抑制mRNA翻譯中起作用的AGO1。他們發(fā)現(xiàn)，高溫下植物病害癥狀的恢復不是依賴于病毒RNA的清除，而是與番茄環(huán)斑病毒（Tomatoringspot nepovirus，TomRSV）RNA2編碼的外殼蛋白與肌動蛋白的減少有關。當AGO1基因發(fā)生沉默時，番茄環(huán)斑病毒RNA2的翻譯被抑制，阻止了癥狀恢復，這與低溫條件下發(fā)生的現(xiàn)象類似。由此可看出溫度變化與植物防御之間存在復雜的相關性。

3.2 使用非轉基因方式應用RNAi技術的可行性

盡管，RNAi在翻譯過程中的作用已經(jīng)被證明，然而，未來仍需要更多的研究去闡明這項技術進而開發(fā)全新的生物農(nóng)藥。雖然不少事實已經(jīng)證明，基于RNAi技術的生物農(nóng)藥發(fā)展?jié)摿薮蟆⑶熬懊篮?，是新興的顛覆性前沿技術和植保領域未來重要的發(fā)展方向，但在實際發(fā)展中仍未上升到戰(zhàn)略高度予以重視，這可能與監(jiān)管批準、公眾認知以及相關的成本有關。即使出現(xiàn)基于RNAi的抗性作物，也會因為大眾缺乏對這項新技術的科學認知而不受認可，從而導致類似反轉基因的公眾反應。近年來，基于RNAi的病毒和昆蟲控制方法被商業(yè)批準的例子越來越多（表2），許多大規(guī)模的田間試驗也正在進行中，這就證明了基于RNAi的植物病害控制策略的潛力是巨大的。我們有理由相信，隨著應用越來越廣泛，大眾會慢慢意識到RNAi技術的巨大價值。然而，鑒于轉基因植物的開發(fā)和維護成本高[112,113]、公眾接受態(tài)度復雜的狀況，外源應用具有引發(fā)RNAi潛力的RNAi分子以誘導基因沉默被認為是基因轉化的一種替代方法，可以提供類似的益處，而不會危及生態(tài)穩(wěn)定，且社會接受度較高[80,111]，目前的證據(jù)顯示，飲食中RNAi分子的存在對人類沒有威脅[114]。

表2 植物中基于RNAi方法抵御病毒和昆蟲的商業(yè)批準實例Table 2 Examples of commercial approval for RNAi-based methods to resist viruses and insects in plants

目前，科學家們正在尋找非轉化方法來控制昆蟲、疾病、線蟲和雜草，通過局部施用方式成功吸收藥物已經(jīng)在不同的生物體中得到報道[115-117]。可見，在植物中局部應用病原體特異性dsRNA來保護作物是利用RNA干擾技術的一種有效方法。預計將來基于RNAi的生物農(nóng)藥將以可噴灑產(chǎn)品的形式進入市場，通過葉面施用、樹干注射、根浸或種子處理等方式作為直接控制劑[118,119]。外源性地將dsRNA分子應用到植物中對抗不同目標需要根據(jù)具體的防除對象進而選擇合適的施用方式。當用于對抗植物內(nèi)源基因或病毒時，RNAi應該發(fā)生在植物細胞內(nèi)，因此，最合適的方式是高壓噴霧，因為它允許dsRNA通過共質(zhì)體途徑輸送[120]。當防除對象是昆蟲和真菌時，RNAi應該發(fā)生在昆蟲和真菌細胞內(nèi)，因此昆蟲和真菌需要攝取完整的dsRNA（未被DCLs加工）以獲得有效的基因沉默。真菌細胞可以通過兩種途徑吸收dsRNA，一種是真菌細胞直接吸收RNA分子。Qiao等[121]通過比較致病真菌、卵菌和非致病真菌對dsRNA吸收效率，發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢、核盤菌Sclerotiniasclerotiorum、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、黑曲霉菌Aspergillusniger和大麗輪枝菌Verticilliumdahliae能夠有效吸收dsRNA，有益真菌綠木霉菌Trichodermavirens吸收dsRNA效率較低，而膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides卻不能吸收dsRNA。致病疫霉對dsRNA的吸收效率較低，病原菌的不同細胞類型和發(fā)育階段也影響dsRNA的吸收效率。通過防病效果檢測發(fā)現(xiàn)，SIGS對dsRNA吸收效率高的病原菌具有較好的防治效果，可以顯著抑制病害的發(fā)生。相反，SIGS無法抑制吸收效率低或不能吸收dsRNA病原菌的致病力。所以，當防治對象為dsRNA吸收率高的病原菌時，采用低壓噴霧法（其中dsRNA停留在葉表面）更合適。另一種是RNA分子先被植物細胞吸收然后再轉移到真菌中[64]。在這種情況下樹干注射、葉柄吸收是最合適的方法，因為它們不會導致dsRNA通過共質(zhì)體傳遞[122,123]。需要特別注意的是，雖然樹干注射和/或葉柄吸收是防除木質(zhì)部取食和/或咀嚼類昆蟲的理想方法，但噴霧法更適合韌皮部取食昆蟲（如蚜蟲）[112]。

3.3 使用非轉基因方式應用RNAi技術面對的挑戰(zhàn)

RNAi效應只有在連續(xù)供應dsRNA時才能維持，然而，噴灑在植物上的裸dsRNA的不穩(wěn)定性一直是其實際應用的主要挑戰(zhàn)。dsRNA在噴灑后，會被環(huán)境中的RNA酶和/或紫外線輻射降解[31]。所以在田間條件下，基于 RNAi的農(nóng)藥需要在植物生長后定期施用，以確保防治效果?？紤]到這點，一家名為 RNAgri（前APSE）的生物技術公司開發(fā)了一種系統(tǒng)，其中用APSE技術制造的RNA容器（APSE RNA Containers，ARCs）由大腸桿菌生產(chǎn)，這種系統(tǒng)可以大規(guī)模生產(chǎn)封裝的即噴型dsRNA[130]。

此外，為防止 dsRNA在遞送至使用點之前發(fā)生降解，使用納米載體作為遞送系統(tǒng)的組件不失為一種選擇。Mitter等[131]證明了使用雙氫氧化物（layered double hydroxide，LDH）黏土納米粒子輸送系統(tǒng)能夠在葉片表面維持穩(wěn)定且持續(xù)的 dsRNA供應，它能在新葉片中提供抗病毒保護。黏土納米片是一個極好的工具，可以將病毒病原體的防護時間延長至20 d或更長，也可以使用生物層來鎖定作為病毒傳播媒介的害蟲，還可以用于研究dsRNA的攝取和系統(tǒng)轉運機制[132]。然而，這種方式對生產(chǎn)成本和開發(fā)的納米載體的效率有很強的依賴性。近來，有文章報道，通過沃森-克里克堿基配對，使用DNA納米結構作為RNA載體工具，能有效地將siRNA傳遞到植物細胞中。三維四面體、一維發(fā)夾瓦、一維納米線等DNA納米結構能促進21 nt綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP） sRNAs在本氏煙草葉片中的傳遞和生物學作用[133]。在實際應用中，必須考慮納米結構上siRNA附著位點的致密性、硬度、大小、形狀和位置等參數(shù)，以確保納米結構能有效地進入植物細胞，從而獲得良好的基因沉默效率。有研究發(fā)現(xiàn)，納米顆粒向植物細胞的傳遞效率取決于顆粒大小和電荷。與中性納米材料相比，具有大于20或30 mV zeta電位的帶電納米顆粒更有可能被植物細胞膜或葉綠體膜吸收。隨著納米顆粒尺寸的減小，它們的電位會增大，從而能更有效地通過細胞壁和脂膜[134]。碳納米管也已成功用于將生物分子運輸?shù)街参锛毎?。Demirer等[135]開發(fā)了一個基于納米管的平臺來直接傳遞siRNA，并在完整的植物細胞中顯示出較高的沉默效率。他們證明，納米管能成功傳遞siRNA和沉默內(nèi)源性基因，是由于有效的細胞內(nèi)傳遞和納米管誘導的保護siRNA免受核酸酶降解。Schwartz等[136]通過將siRNA包裝在碳點（一類非常小的納米粒子）中，建立了一種用于植物基因沉默的新工具。他們將納米制劑與表面活性劑一起低壓噴霧施用, 成功沉默了本氏煙和番茄中綠色熒光蛋白基因。此外，編碼鎂螯合酶（葉綠素合成所必需的一種酶）兩個亞單位的內(nèi)源性基因的沉默也證明了碳點制劑的遞送功效。

高昂的RNA生產(chǎn)成本與超大的田間用藥量之間的矛盾是未來RNAi生物農(nóng)藥應用面臨的現(xiàn)實問題。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，病、蟲、草等的田間規(guī)模管理需要數(shù)以噸級水平的 RNAs。粗略估計表明，每公頃田地需要有10克的RNA，而且這一數(shù)量還因防除目標對RNAi的敏感性及其系統(tǒng)性RNAi傳播能力而存在差異[50]。但是，迄今為止，昆蟲和疾病管理研究中常用的RNAi誘導分子（dsRNA或siRNA）是昂貴的合成物，或者是通過耗時費力的程序產(chǎn)生的[19]。為了克服這些方法的不足，科學家們已經(jīng)研究了在細菌中表達的dsRNA的遞送潛力，為大規(guī)模靶基因篩選提供了替代方法[137,138]。令人鼓舞的是，dsRNA生產(chǎn)成本在過去幾年大幅下降，使用核苷三磷酸（Nucleoside triphosphate，NPT）體外合成的dsRNA從2008年的每克12500美元降至2018年的每克不到60美元。最近，為了滿足高市場要求，一些工業(yè)公司正在研發(fā)基于微生物的生物合成生產(chǎn)系統(tǒng)，以較大規(guī)模和接近2美元每克的價格生產(chǎn)dsRNA[112,139]。大規(guī)模dsRNA生產(chǎn)系統(tǒng)，可以在降低成本的前提下實現(xiàn)高產(chǎn)量。這些生產(chǎn)系統(tǒng)涉及的基于酶促合成的兩條單鏈RNA的雜交在體外[56,72,76,78]或體內(nèi)都能進行。

3.4 展望

總之，RNAi生物農(nóng)藥的研發(fā)和成功應用必須解決好以下幾個關鍵的問題：①基因沉默靶標基因的選擇，如何篩選針對防治對象（如病原體、昆蟲、雜草等）靶標基因的 dsRNA序列是該技術的第一關鍵步驟；②如何選擇 dsRNA運載體系使其能夠高效特異的進入細胞，并有效地進行目標基因的沉默；③如何保障外源 dsRNA使用過程中的生物安全。各物種之間的部分關鍵基因在序列上也具有一定的差異性，這些差異序列則可作為靶標進行沉默用于控制特定種屬的有害生物。已有的研究表明細菌和病毒都具有將外源dsRNA攜帶進入植物細胞的能力[80]，但是它們具有物種、植物組織部位和發(fā)育時期的依賴性。因此，如何優(yōu)化外源 dsRNA在自然環(huán)境下高效進入各種目標生物細胞中的途徑，并高效地執(zhí)行其沉默功能，是影響該技術實現(xiàn)的核心障礙之一。同時，在自然環(huán)境下廣泛地使用攜帶特定 dsRNA的細菌或病毒將對環(huán)境構成威脅，因此如何有效地清除所用的細菌或病毒，同時降解它們所攜帶的外源dsRNA，消除生物安全隱患，將是影響該技術實現(xiàn)的另一核心障礙。

毫無疑問，將RNAi應用于農(nóng)作物保護無疑具有很多優(yōu)點，特別是能夠特異性地靶向已知的核苷酸序列，并有望減少植物病害、減輕環(huán)境負擔。近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)簡化了其應用程序，降低了生產(chǎn)成本。此外，研究者們還進行了一些探討，其目的在于使RNAi的使用變得更加有效和安全。盡管外源dsRNAs的識別、吸收和轉運機制仍有待確定，但最近的研究表明使用局部施用的RNA農(nóng)藥作為作物保護措施的潛在益處有很多，包括相對于許多現(xiàn)有農(nóng)藥而言的低毒性、物種特異性以及當設計了合適的 dsRNA序列時對環(huán)境的友好性。所以，如果謹慎地進行構思和開發(fā)，RNA農(nóng)藥能夠以安全有效的方式徹底改變田間病蟲害及雜草的管理體系。