周永靜，王肖輝，李如意，周霖▲，吳慧麗▲

(1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007；2.鄭州市中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052；4.上海市閔行區(qū)梅隴社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 中國 201104)

結(jié)腸癌是當(dāng)前臨床較為常見的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)生率及死亡率一直居于全球惡性腫瘤前列[1,2]。截止目前，該病的病因及病機仍不明確，臨床常采用的化療及根治術(shù)雖然在一定程度上降低了腫瘤的死亡率，且明顯改善病人預(yù)后，然而這些手段在疾病治療過程中對多數(shù)患者的正常臟器會產(chǎn)生較大的損傷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后水平[3-5]。中醫(yī)藥是中國傳統(tǒng)文化的瑰寶，隨著傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，中醫(yī)藥對于腫瘤的防治已經(jīng)取得明顯成效。研究表明，中藥的某些化學(xué)成分能夠顯著抑制腫瘤生長，且具有高效低毒，綜合調(diào)節(jié)等顯著優(yōu)勢，近年來得到廣大學(xué)者和臨床專家的一致認(rèn)可，這些中藥活性成分可能是未來腫瘤治療的潛在靶點藥物[6,7]。

馬錢子，為馬錢科植物馬錢的干燥成熟種子，具有散結(jié)消腫，通絡(luò)止痛的功效，主治跌打損傷，骨折腫痛，癰疽瘡毒等。馬錢苷(Loganin,Log)是從金銀花、山茱萸和馬錢子中提取的環(huán)烯醚萜苷，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)及抗炎等作用[8]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體免疫密切相關(guān)，近年來，關(guān)于馬錢苷的抗腫瘤活性引起廣泛關(guān)注[9-12]，但目前馬錢苷對結(jié)腸癌的治療作用還未見報道。因此，本實驗通過SW480細(xì)胞接種BALB/c裸鼠，觀察和探討馬錢苷對結(jié)腸癌裸鼠的干預(yù)作用，為馬錢苷治療結(jié)腸癌的作用機制提供重要的理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥物和試劑

馬錢苷(10 mg，批號：18524-94-2，sigma公司)；5-氟尿嘧啶(5-Fu，1 g，批號：51-21-8，LMAI Bio公司);白細(xì)胞介素-6(IL-6)(96T，批號：E-EL-M0044c，Elabscience公司)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)(96T，批號：E-EL-M0037c，Elabscience公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(96T，批號：E-EL-M0049c，Elabscience公司)；超氧化歧化酶(SOD)(50T/48樣，批號：A001-1，南京建成生物有限公司)；過氧化氫酶(CAT)(50T/48樣，批號：A007-1，南京建成生物有限公司)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(50T/24樣，批號：A005-1，南京建成生物有限公司)；與丙二醛(MDA)(50T/48樣，批號：A003-1，南京建成生物有限公司)；Nrf-2(20 μL，批號：12721T，Cell Signaling Technology公司)；HO-1(100 μL，批號：868065，Cell Signaling Technology公司)；RhoA(20 μL，批號：2117T，Cell Signaling Technology公司)；ROCK1(20 μL，批號：40035T，Cell Signaling Technology公司)；ROCK2(100 μL，批號：82365，Cell Signaling Technology公司)；p-NF-kBp65(20 μL，批號：3033T，Cell Signaling Technology公司)；NF-kBp65(20 μL，批號：6956T，Cell Signaling Technology公司)；GAPDH(100 μL，批號：51332S，Cell Signaling Technology公司)。

1.2 動物

BALB/c裸鼠(8周，20～22 g)購自鄭州大學(xué)動物中心，飼養(yǎng)在(23±2)℃的SPF動物房中，光照/黑暗周期為12 h，自由飲水和食物。

1.3 動物倫理

所有動物實驗均按照鄭州大學(xué)動物倫理委員會操作指南進(jìn)行。

1.4 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

SW 480購自于美國細(xì)胞中心，SW 480細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基都保存在37℃的5%的CO2培養(yǎng)箱中。

2 實驗方法

2.1 動物建模和分組給藥

將SW480細(xì)胞懸液(每只裸鼠3×106細(xì)胞，0.2 mL)皮下注射到裸鼠的左腋窩，并接種40只裸鼠。接種SW480細(xì)胞的裸鼠7 d后均出現(xiàn)直徑約5 mm的皮下結(jié)節(jié)，成功建立移植瘤模型。接種后第8天，將已建立皮下移植腫瘤模型的30只裸鼠隨機分為3組(n=10)：模型組(M)、馬錢苷組(Log組)(5 mg/kg)、5氟尿嘧啶組(5-Fu組)(20 mg/kg)，馬錢苷及5-Fu均溶于含NaOH的生理鹽水中,腹腔注射相應(yīng)藥物，0.1 mL/只裸鼠。模型組給予等量生理鹽水，每隔2 d 1次，連續(xù)7次。

2.2 裸鼠體質(zhì)量與腫瘤體積測定

每3 d記錄裸鼠體質(zhì)量，每隔3 d測量1次腫瘤裸鼠的體質(zhì)量、最大直徑(a)和最小直徑(b)，并根據(jù)公式計算腫瘤體積:v=ab2/2(mm3)。

2.3 腫瘤組織學(xué)分析

最后一次給藥后24 h時,立即切除腫瘤組織，固定在4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋并切成 5 μm厚度。石蠟切片在二甲苯和乙醇中脫蠟，用蘇木精和伊紅染色，然后在200倍放大的光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.4 血清和細(xì)胞上清液中炎癥細(xì)胞因子水平的測定

血清和細(xì)胞上清液中的白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平通過ELISA試劑盒根據(jù)制造商的說明進(jìn)行測定。

2.5 血清與腫瘤組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

血清和細(xì)胞上清液中的超氧化歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、與丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的水平通過商品化試劑盒進(jìn)行測定。

2.6 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織中Nrf-2、ROCK1和p-NF-kBp65的表達(dá)水平。具體過程為，腫瘤組織用4%多聚甲醛(PFA)固定，包埋在石蠟中并切片。石蠟切片在二甲苯和乙醇中脫蠟，在檸檬酸鈉緩沖液中微波處理，并用PBS洗滌。內(nèi)源過氧化物酶活性被3%的過氧化氫阻斷20 min。每個樣品用5%山羊血清封閉20 min，然后用一抗抗體在4℃處理過夜。第2天，用PBS洗滌3次后，將每個樣品用山羊抗兔IgG二抗處理20 min，然后孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白工作液(Streptavidin-perosidase,SP)20 min，用PBS洗滌3次。然后，樣品用3-3′二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，并用蘇木精重新染色。脫水和干燥后，切片用中性樹膠固定并在顯微鏡下觀察。

2.7 蛋白質(zhì)印跡

將樣品切碎并在含有2 mmol/L PMSF的冰冷RIPA緩沖液中提取蛋白。然后樣品在4℃下于12 000×g離心15 min，總蛋白濃度通過BCA分析試劑盒測定。將蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后在4℃下用孵育一抗過夜。第2天，用辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗孵育2 h，膜通過增強化學(xué)發(fā)光(Enhanced Chemiluminescence,ECL)試劑顯影并進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)成像。

2.8 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以表示，并使用GraphPad軟件繪圖(Version 6.0，Graphpad Prism Software)。通過單因素方差分析和圖基多重比較檢驗分析各組均值差異的統(tǒng)計顯著性。兩組之間統(tǒng)計學(xué)比較，采用t檢驗，P值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 Log對荷瘤裸鼠腫瘤重量和腫瘤體積的影響

結(jié)果顯示：Log組的腫瘤重量和腫瘤體積低于模型組(P<0.01)，見圖1。

注：與模型組比較：##P<0.01

3.2 Log對荷瘤裸鼠血清和腫瘤中促炎細(xì)胞因子的影響

如圖2所示，與模型組相比，Log增高了荷瘤裸鼠血清和腫瘤中促炎細(xì)胞因子水平(P<0.01)，這一結(jié)果表明，Log能提高荷瘤裸鼠的T細(xì)胞免疫功能。

注：與模型組比較：##P<0.01

3.3 Log對荷瘤裸鼠血清和腫瘤中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

如圖3所示，與模型組相比，Log提高了荷瘤裸鼠血清和腫瘤中MDA水平，降低血清與腫瘤組織中SOD、CAT、GSH-Px水平。這一結(jié)果表明，Log能調(diào)節(jié)荷瘤裸鼠的氧化應(yīng)激水平。

注：與模型組比較：##P<0.01

3.4 Log對荷瘤裸鼠腫瘤組織Nrf-2、ROCK1和p-NF-kBp65蛋白的影響

如圖4所示，免疫組織結(jié)果顯示，與模型組相比，Log提高了荷瘤裸鼠腫瘤中ROCK1、p-NF-kB p65的水平，同時降低了腫瘤組織Nrf-2水平(P<0.01)。

注：與模型組比較：##P<0.01

3.5 Log對荷瘤裸鼠腫瘤組織Nrf-2/NO-1信號與ROCK/NF-kB信號蛋白水平的影響

如圖5蛋白印跡結(jié)果顯示，與模型組相比，Log提高了荷瘤裸鼠腫瘤中RhoA、ROCK1、ROCK2、p-NF-kBp65的水平，同時降低了腫瘤組織Nrf-2、HO-1水平(P<0.01)。

注：與模型組比較：##P<0.01

4 討論

有研究表明馬錢子具有抗腫瘤的效果，馬錢子的主要成分馬錢苷可以抑制癌細(xì)胞增殖和遷移[13]。本研究表明，馬錢苷可以減小腫瘤體積，調(diào)節(jié)荷瘤裸鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)，其機制可能與Nrf-2/NO-1信號與ROCK/NF-kB信號的調(diào)控有關(guān)。

結(jié)腸癌是中國最常見的消化系統(tǒng)疾病之一。各種炎性刺激因子可在腸粘膜下層聚集大量巨噬細(xì)胞，并激活巨噬細(xì)胞分泌各種促炎因子。炎癥因子進(jìn)一步誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡和壞死，這是結(jié)腸癌的主要機制之一。近年來，我國結(jié)腸癌的治療取得了很大進(jìn)展，但多重耐藥問題日益嚴(yán)重[14]。盡管目前大量結(jié)腸癌患者受益于新輔助化療，但在同步化療和放療的情況下，結(jié)腸癌的存活率仍然很低[15]。據(jù)報道，化療耐藥性是結(jié)腸癌患者治療失敗的常見原因。

炎性反應(yīng)是指免疫反應(yīng)的激活，在此期間炎性細(xì)胞因子過度產(chǎn)生，包括IL-6和TNF-α[16]，與結(jié)腸癌相關(guān)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生增加[17]。據(jù)報道，腫瘤組織中TNF-α水平的升高與結(jié)腸癌的嚴(yán)重程度相關(guān)，并且IL-1β的產(chǎn)生對某些信號通路產(chǎn)生不利影響[18]。此外，各種腫瘤組織中循環(huán)水平的IL-6的增加，被認(rèn)為是結(jié)腸癌進(jìn)展的預(yù)測因子[19]。研究表明，結(jié)腸癌降低了炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，其表現(xiàn)為血清和細(xì)胞中IL-1β、TNF-α和IL-6水平的降低，提示結(jié)腸癌存在免疫抑制，且與患者預(yù)后不良有關(guān)[20]。而Log可明顯提高體內(nèi)外IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。

眾所周知，抗氧化劑/II相解毒酶的喪失加上活性氧和氮的增加，對正常的結(jié)腸穩(wěn)態(tài)是有害的。先前的研究表明，抗氧化劑/II相解毒酶表達(dá)的減少有助于解釋Nrf2基因敲除小鼠更易受直接應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的結(jié)腸疾病的影響[21]。目前的研究還表明，一些抗氧化劑/II相解毒酶的表達(dá)，包括NAD(P)氫醌還原酶1和UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1，在用氮氧甲烷/DSS處理的小鼠的正常粘膜中升高，但未敲除Nrf2。血紅素加氧酶1在經(jīng)處理的WT和Nrf2敲除小鼠的正常粘膜中的表達(dá)增加。在Nrf2敲除小鼠中誘導(dǎo)血紅素加氧酶1不足為奇，因為調(diào)節(jié)血紅素加氧酶1的其他轉(zhuǎn)錄因子(除Nrf2外)，如缺氧誘導(dǎo)因子1[22]和激活蛋白1[18]，可能仍存在于Nrf2敲除小鼠中?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明解毒酶NAD(P)H-醌還原酶1和UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1的表達(dá)降低，可能是加速Nrf2基因敲除小鼠結(jié)腸組織中腫瘤轉(zhuǎn)化的重要事件，進(jìn)一步表明這些防御酶對于保護(hù)結(jié)腸粘膜免受結(jié)腸相關(guān)結(jié)腸直腸癌形成是重要的。本文研究發(fā)現(xiàn)，Log顯著荷瘤裸鼠減低Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)。表明Log可以調(diào)控荷瘤裸鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激。

先前的研究表明，氧化應(yīng)激失衡可以促發(fā)炎癥信號的表達(dá)。生物體細(xì)胞在遇到種種應(yīng)激刺激時，機體內(nèi)產(chǎn)生高水平高活性物質(zhì)，如活性氧、氮自由基等，從而導(dǎo)致機體內(nèi)氧化-還原反應(yīng)速率失衡，而各種氧化物導(dǎo)致的一體化氧化速度超出了機體抗氧化能力，最終結(jié)果導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷人體組織。氧化應(yīng)激的本質(zhì)即體內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡[23]。同時，生物體在長期的進(jìn)化過程中，也相應(yīng)形成了一套有效的自由基清除機制。這些抗氧化的酶包括SOD和GSH-Px等，一般來說，在腫瘤早期，因為自由基水平大大增加，這些過氧化物酶(SOD和GSH-Px)含量是明顯降低的；而MDA是機體內(nèi)不飽和脂肪酸在自由基的作用下產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，是反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的一項重要指標(biāo)，在腫瘤發(fā)展早期時表現(xiàn)為水平升高[24-25]。本研究結(jié)果顯示，馬錢苷最終降低SOD和GSH-Px水平，升高M(jìn)DA水平，可能是由于馬錢苷在腫瘤發(fā)展后期，激活體內(nèi)炎癥因子水平，激活腫瘤炎性反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致體內(nèi)的SOD和GSH-Px水平被動降低，MDA水平相應(yīng)升高的現(xiàn)象[26]。

結(jié)腸癌已經(jīng)發(fā)現(xiàn)慢性和反復(fù)炎癥，氧化應(yīng)激失衡不僅釋放反應(yīng)性炎癥刺激，而且誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)[27,28]，包括白介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白介素-6和TGF-β的表達(dá)增加有關(guān)增加。除此之外，氧化應(yīng)激失衡可以激活ROCK信號，激活的ROCK信號可以進(jìn)一步下游NF-kB信號。本實驗發(fā)現(xiàn)，Log可以顯著增加RhoA、ROCK1、ROCK2、p-NF-kBp65蛋白表達(dá)，增加腫瘤炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。

總之，本研究闡明了Log在結(jié)腸癌調(diào)節(jié)中的作用，Log有效地增加了結(jié)腸癌裸鼠的炎癥，增強了體內(nèi)氧化應(yīng)激失衡，本實驗證明了Log通過下調(diào)Nrf-2/NO-1及上調(diào)ROCK/NF-kB蛋白信號是其治療結(jié)腸癌的可能潛在作用機制，為將來更深層次的研究奠定了科學(xué)的前期基礎(chǔ)。