石 柳，劉 雪，黃 喆，曾德清 (.贛州市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 贛州 34000；.全南縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 贛州 34800)

肝癌具有高侵襲轉(zhuǎn)移能力、發(fā)病隱匿、潛伏期長、高增殖活性、高復(fù)發(fā)率等特點，早期難以準確診斷，部分患者確診時病情已達中晚期，術(shù)后5年生存率較低[1-2]。隨著精準醫(yī)學(xué)概念的興起，分子靶向藥物逐漸被被應(yīng)用于肝癌治療，獲得可喜的成效。人類異常紡錘體樣小頭畸形相關(guān)蛋白基因(ASPM)與DNA損傷修復(fù)、細胞有絲分裂有關(guān)，與腫瘤的發(fā)生、進展關(guān)系密切，在乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中異常高表達，但ASPM在肝癌中作用研究較少[3-4]。本研究分析ASPM對肝癌細胞惡性表型的影響，為臨床對肝癌診斷和治療提供新的理論依據(jù)及靶向策略。

1 資料與方法

1.1細胞系與主要試劑、儀器:人肝癌細胞株 QGY-7703購自中南大學(xué)細胞中心；民海生物醫(yī)學(xué)有限公司的小牛血清；Gibco公司胰蛋白酶、RPMI1640細胞培養(yǎng)液；PCR儀 (Sony，Japan)；美國BD公司FACS Calibur流式細胞儀；三箭生物技術(shù)有限公司的流式凋亡細胞檢測試劑盒；上海邦景實業(yè)有限公司的MitoTrackerTMGreen試劑盒；Transwell小室(Costar美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng):將人肝癌細胞株 QGY-7703培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液(含小牛血清10%、鏈霉素100 μg/ml、青霉素100 IU/ml)，放置在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 2～3天傳代1次，用0.02%EDTA配制的0.1%胰酶消化細胞。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前1 d取對數(shù)生長期細胞，按試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染后的24 h、48 h及72 h收集細胞用qRT-PCR檢測目的基因的沉默效率。以ASPM基因沉默的QGY-7703細胞為試驗組，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的QGY-7703細胞為對照組。

1.2.3檢測QGY-7703細胞CCK-8生存率:siRNA沉默目的基因后，于第24 h、48 h、72 h分別檢測在波長450 nm處細胞的OD值，計算細胞的生長速度。

1.2.4平板克隆形成實驗:siRNA沉默目的基因后，取對數(shù)生長期的細胞經(jīng)PBS清洗后，加入甲醇進行固定，棄去甲醇，加入結(jié)晶紫進行染色。

1.2.5檢測細胞周期:將試驗組和對照組細胞用D-Hank′s 液漂洗，PI染色，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.2.6檢測細胞的凋亡數(shù)量：siRNA沉默目的基因后，采用細胞凋亡檢測試劑盒和MitoTrackerTMGreen試劑盒通過流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡數(shù)量。

1.2.7Transwell小室檢測細胞遷移：siRNA沉默目的基因后，分別接種于Transwell小室的上室中，上室加入無血清培基，14 h后取出上室，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，流水緩慢沖洗，進行拍照，計數(shù)。觀察指標：比較兩組細胞生長速度、克隆形成能力、細胞周期分布、細胞凋亡比例、細胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS21.0軟件進行t及χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1兩組細胞生長速度和克隆形成能力對比:與對照組相比，試驗組QGY-7703肝癌細胞的生長速度明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。試驗組細胞克隆形成數(shù)目為(165.12±10.45)個低于對照組(264.21±12.59)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：與對照組比較，①P<0.05圖1 兩組QGY-7703肝癌細胞生長速度

2.2兩組細胞周期分布對比:試驗組G1/G0期細胞比例高于對照組，S期細胞比例低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩組G2/M期細胞比例相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組細胞周期分布對比

2.3兩組細胞凋亡比例對比:沉默ASPM可促進QGY-7703肝癌細胞的凋亡，試驗組QGY-7703的凋亡水平(8.10±0.16)%高于對照組的(0.65±0.11)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4兩組細胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目對比:試驗組細胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組細胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目對比個，n=3)

3 討論

肝癌屬于消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)率較高，且5年存活率低下，預(yù)后欠佳[5]。癌細胞轉(zhuǎn)移、浸潤是肝癌復(fù)發(fā)與預(yù)后不佳的主要因素[6]，針對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移一直是臨床研究的熱點。腫瘤干細胞能夠無限增殖、自我更新，進而誘發(fā)腫瘤，同時其生長周期較慢，可逃避化療、放療藥物作用。而目前臨床治療靶細胞為快速復(fù)制的細胞，對于此類生長周期較慢的細胞靶向攻擊能力欠佳，治療期間此類細胞易潛伏，成為日后患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[7-8]。

ASPM屬于人類同源蛋白，分布于細胞有絲分裂期的紡錘體兩極和細胞周期間期的中心體，參與調(diào)控紡錘體生成和細胞周期中心體，促使細胞增殖，并可調(diào)節(jié)細胞質(zhì)分裂和有絲分裂方向，是一項干細胞標志物[9]。ASPM在癌細胞中高表達，其表達隨著細胞分化程度增高而下調(diào)，降低ASPM表達能夠抑制細胞的增殖能力與自我更新。本研究提示沉默ASPM基因可抑制QGY-7703的增殖能力和克隆形成能力、遷移能力，促使G1期細胞增加及S期細胞減少，加速Q(mào)GY-7703凋亡。當(dāng)ASPM發(fā)生突變，會影響其編碼的蛋白功能，造成中間體功能發(fā)生缺陷，影響染色體分離，出現(xiàn)異倍體，誘發(fā)腫瘤，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等因素密切相關(guān)。