凌 厲，李書鵬，張長寧，桂書彥，陳立波 (.華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院內分泌科，廣東 深圳 5805；.北京大學深圳研究生院化學生物學與生物技術學院，廣東 深圳 58055)

隨著現(xiàn)代技術的進步和工業(yè)化時代的全面來臨，缺血性腦卒中逐漸成為目前全球范圍內最具破壞人類健康的重大疾病[1]。缺血性腦卒中一經(jīng)發(fā)生，導致大腦產生嚴重的生理和神經(jīng)損傷，這些損傷所帶來的生理病理并發(fā)癥很大程度上取決于腦血管閉塞發(fā)生的區(qū)域及類型[2]。這種腦血管的閉塞可以是永久性的，也可以是一過性的，無論何種類型的閉塞，都會嚴重影響血流向大腦的供應[3]，在缺乏營養(yǎng)供給的情況下，神經(jīng)元很快經(jīng)歷了不可逆轉的凋亡壞死，神經(jīng)功能喪失[4]。腦缺血的病理生理級聯(lián)反應已經(jīng)被廣泛認識，常見的機制包括氧化應激反應[5]、毒性神經(jīng)遞質釋放[6]、免疫炎性細胞浸潤等[7]。目前臨床中常用的治療手段只有溶栓，然而適應證較窄和治療窗口短的特性極大地限制了溶栓藥物在臨床中的使用[8]。因此急需新的一線治療藥物。

據(jù)報道，內源性激素的損傷與多種疾病密切相關，如癌癥[9]、心血管疾病和與年齡相關的神經(jīng)退行性疾病等[10]。有文獻顯示腦卒中主要影響中老年人群，其機制可能與內源性激素缺乏相關[11]，如雌激素、孕酮、褪黑素等[12]。其中褪黑素的作用備受研究者關注。隨著人類年齡的增長，褪黑素表達水平下降，導致人類腦卒中易感性提高[13]。褪黑素的神經(jīng)保護作用可能與松果體和其他組織分泌的吲哚胺相關[14]。然而一些腦缺血動物模型的實驗結果顯示，其涉及的相關機制眾多，目前已提出來的機制包括位置鈣離子穩(wěn)態(tài)，抑制炎性反應，降低氧化應激反應，調節(jié)小膠質細胞的功能等[15]?？偠灾屎谒氐倪@些有益作用主要歸因于其親脂特性，可以快速向大腦進行傳輸，另一方面，褪黑素受體也在大腦中廣泛分布，與鈣調蛋白等多種胞內蛋白相互作用，關系緊密。褪黑素與這些蛋白等結合進一步放大了其保護效應[16]。

過去圍繞著褪黑素參與氧化應激反應的機制展開了大量研究，相關通路信號分子包括PI3K/Akt、增殖蛋白激酶(MAPKs),氧化應激相關因子2 (Nrf2)等，然而針對這些作用通路的藥物研究未能轉化為有效的臨床成果，因此，褪黑素的神經(jīng)保護作用機制有待進一步闡明。本文探究腦缺血過程中褪黑素通過MAPK通路參與氧化應激誘導的炎性反應作用機制，闡明褪黑素對腦卒中的神經(jīng)保護作用，為臨床中的進一步轉化應用提供有力證據(jù)。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組：選取SD雄性大鼠，體重250～300 g，8～10周齡，分為四組，每組12只，分別為假手術組、腦缺血組[大腦中動脈閉塞(MCAO)手術]、褪黑素+腦缺血組(褪黑素治療組)以及褪黑素(Mela)+假手術組(褪黑素預處理組)。褪黑素治療組在腦缺血建模前給藥，以5 mg/kg劑量溶于生理鹽水中，腹腔注射。實驗中共計7只實驗動物死亡，4只來自缺血組，3只來自褪黑素治療組，死亡原因包括腦水腫，血腦屏障破壞等。通過補充更多實驗動物以進行調整。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2MCAO模型構建：大鼠麻醉后仰臥于顯微鏡下，消毒、備皮，于頸部正中做一切口，皮下鈍性分離，沿右側胸鎖乳突肌向下找到頸動脈，小心分離頸動脈鞘，繼而分離頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，最后結扎頸總動脈和頸外動脈。分離過程中注意勿觸碰迷走神經(jīng)。使用動脈夾將頸內動脈夾閉并用眼科剪刀在頸總動脈剪一小口，插入線栓并小心結扎。手術過程中檢測實驗動物肛溫，麻醉蘇醒后將實驗動物置于飼養(yǎng)室，若動物出現(xiàn)站立不穩(wěn)提尾時轉圈等癥狀說明建模成功。建模成功24 h后取材進行后續(xù)實驗。

1.32，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色：建模后實驗動物脊髓離斷，心臟灌流，取腦組織，從額葉或枕葉開始連續(xù)做2 mm冠狀切片，將切片置于剛制備的2%TTC溶液中，室溫染色1 h。將切片在4%多聚甲醛中固定，拍照并測定梗死面積。

1.4HE染色：將組織切片進行脫蠟處理，經(jīng)二甲苯處理、再用分級酒精溶液重新水化(從100%到70%，每次洗滌5～10 min)。隨后將載玻片用蒸餾水沖洗以清除殘留乙醇，并在室溫下浸泡蘇木素10 min。蒸餾水洗凈載玻片,在顯微鏡下觀察,以確保核染色，若染色未完全則增加蘇木素處理時間。使用Image J軟件對神經(jīng)元死亡和存活程度進行分析。

1.5Western印跡：提取腦組織蛋白離心后，取上清液仔細分離。使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。調整蛋白質樣品濃度至30 μg，電泳后轉移到聚偏氟乙烯PVDF膜上。封閉后將 PVDF與一抗置于冰箱中過夜孵育。次日加二抗。ECL檢測試劑檢測X射線條帶。所使用的抗體包括抗-p-JNK、抗-JNK、抗-Nrf2、抗-HO-1、抗-Trx和β-actin，抗體稀釋濃度為1∶1 000。

1.6統(tǒng)計學分析：采用SPSS22.0版本版件進行t檢驗。

2 結果

2.1褪黑素預處理對腦缺血的影響：將小鼠分為假手術組、腦缺血組和褪黑素治療組，TTC結果顯示褪黑素治療后顯著減少小鼠的腦缺血體積(P<0.05),見圖1。缺血性損傷導致神經(jīng)元的損傷可能是由于梗死區(qū)血流量驟降和ATP供應嚴重耗竭而導致的壞死，也可能是由于梗死區(qū)周圍半暗帶區(qū)的細胞凋亡所致。根據(jù)大腦位置的不同，壞死和凋亡細胞死亡之間存在廣泛的干擾，多由谷氨酸和活性氧等活性因子觸發(fā)。接下來我們選擇梗死周圍區(qū)域作為感興趣區(qū)進行形態(tài)學分析。HE染色顯示額葉皮質和紋狀體的神經(jīng)元損傷程度。與假手術組相比，腦缺血組小鼠腦皮質的神經(jīng)纖維束表現(xiàn)出明顯的異常形態(tài)特征。然而，褪黑素治療在很大程度上減輕了這種損害(P<0.05)。缺血后同側皮質和紋狀體的特征包括神經(jīng)元扇形結構樣，伴有輕微的染色改變、空泡形成和中性粒細胞浸潤。見圖2。

注：與假手術組比較，①P<0.001;與腦缺血組比較，②P<0.05圖1 腦缺血組和褪黑素預處理組腦組織TTC染色及統(tǒng)計

注：與假手術組比較，①P<0.001;與腦缺血組比較，②P<0.05圖2 腦缺血后皮質區(qū)及紋狀體區(qū)HE染色和中性粒細胞浸潤(40×)

2.2褪黑素預處理對MCAO介導的MAPK-p38/p-JNK通路轉歸的影響:MCAO損傷后p-JNK和p-P38的表達高于假手術組。褪黑素預處理后MCAO介導的應激相關MAPK p-P38/p-JNK通路的上調顯著下降(P<0.05)。見圖3。

注：1～4：腦缺血組、褪黑素治療組、假手術組、褪黑素預處理組

注：與假手術組比較，①P<0.001,②P<0.01;與腦缺血組比較，③P<0.05圖3 皮質和紋狀體區(qū)腦缺血后p-38,p-p38,JNK和p-JNK的表達

2.3褪黑素對內源性抗氧化劑Nrf2/HO-1/Trx通路的作用:MCAO處理24 h后Nrf2和HO-1的表達較假手術組增高(P<0.05)。見圖4。Trx在腦缺血后表達下調，而褪黑素治療顯著恢復了Trx的表達水平。值得注意的是，沒有觀察到褪黑素治療組的Nrf2的表達水平有任何影響(P>0.05)。見圖4。

注：1～4：腦缺血組、褪黑素治療組、假手術組、褪黑素預處理組

注：與假手術組比較，①P<0.001,②P<0.01;與腦缺血組對比，③P<0.05，④P<0.01圖4 皮質和紋狀體區(qū)腦缺血后Nrf2、HO-1和Trx的表達

3 討論

本次研究探究了內源性神經(jīng)激素褪黑素對MCAO誘導的腦缺血的保護機制，是既往研究的延伸，進一步證明了褪黑素的作用機制。本次研究主要應用蛋白質組學的方法，探究了褪黑素在腦缺血發(fā)生后對集中紋狀體蛋白的調節(jié)作用。褪黑素在各種病理和疾病條件下都被認為是一種內源性強抗氧化劑、自由基清除劑和內源性抗氧化酶的調節(jié)劑[17]，早期研究報道了氧化應激反應和炎性反應過程的交叉互作[18]，因此，圍繞褪黑素展開的治療的目標應該多通過刺激抗氧化酶來調節(jié)和減輕神經(jīng)炎性反應和氧化應激的積累。實際上，褪黑激素與多種抗氧化系統(tǒng)的激活有關，因此有助于維持大腦內的平衡環(huán)境[19]。特別是褪黑激素可以激活谷胱甘肽和Nrf2/HO-1通路等的研究，已被業(yè)內廣泛熟知。此外，有研究表明褪黑激素通過激活Sirt1、Sirt3、Sirt6和其他抗氧化途徑和介質在能量缺乏和細胞生存相關的細胞過程中發(fā)揮重要作用[20]。研究表明，天然衍生的多酚類物質的抗氧化作用涉及Sirt1-Nrf2通路的激活[21]。同樣，褪黑激素作為一種有效的抗氧化劑和內源性神經(jīng)保護神經(jīng)激素，也可以激活Sirt1-Nrf2通路[22]。雖然氧化應激反應和炎性反應雖然是腦缺血過程中的重要病理級聯(lián)反應過程，圍繞褪黑素的抗氧化應激效應的研究也已開展多年，但在腦缺血的臨床治療中仍未得到良好的成果轉化。

首先，褪黑素的腦缺血保護作用毋庸置疑，在本次研究中也得到了驗證。研究表明MCAO模型梗死區(qū)通常涉及紋狀體區(qū)域，神經(jīng)元的壞死大多也發(fā)生在該部位，TTC染色結果顯示該區(qū)域在腦缺血發(fā)生后呈白色，代表血流供給中斷和細胞的壞死。然而褪黑素處理后梗死區(qū)顯著降低，說明了褪黑素的潛在保護作用。以前的研究介紹了褪黑素針對腦卒中的多種保護功效，大多數(shù)圍繞其減輕活性氧自由基(ROS)介導的氧化應激反應和炎性反應等展開論述，多項腦缺血模型實驗結果表明褪黑素因下調核因子(NF)-κB、環(huán)氧化酶(COX)-2和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達而具有抗炎潛力，然而針對這些通路的臨床轉化效果不如預期，因此還需要更多的實驗探究褪黑素參與腦缺血的作用機制。本研究中關注到褪黑素通過MAPK-p38/p-JNK信號通路參與腦缺血保護的作用機制。褪黑素可以通過下調MAPK通路信號蛋白的表達起到神經(jīng)保護的作用。研究表明MAPK/JNK/p-38信號通路主要參與機體的炎性反應，降低該信號通路分子的表達可以通過減少iNOS和COX2分子產生ROS，進而減少腦缺血后的梗死面積。本研究結果顯示，褪黑素處理后，JNK以及p-38蛋白表達水平顯著下降，說明褪黑素可能通過該信號通路起到減少梗死體積，保護神經(jīng)功能的作用。本研究還關注了褪黑素對Trx表達的影響。Trx蛋白是一種可以調節(jié)氧化還原反應的關鍵作用蛋白，本文結果顯示褪黑素預處理的條件下可以顯著提高Trx的表達水平，進一步支持了褪黑素在缺血性損傷中的抗氧化作用，補充了褪黑素的作用機制。

綜上所述，內源性抗氧化劑和晝夜節(jié)律調節(jié)劑褪黑素預處理對缺血性腦損傷有保護作用，相關機制包括對如氧化應激相關激酶和神經(jīng)炎性反應的調節(jié)，補充內源性抗氧化神經(jīng)激素褪黑素將通過調節(jié)將MAPK p-P38/pJNK信號通路、 Trx蛋白的表達減輕腦缺血的神經(jīng)損害。