丁蘇蘇，葉嬋娟，姚晶晶，李倚云

（江蘇省揚(yáng)州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 揚(yáng)州 225000）

香菇Lentinus edodes又稱香蕈、冬菰，營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，被視為“菇中之王”，是我國(guó)久負(fù)盛名的珍貴食用菌，也是我國(guó)著名的藥用菌，歷代醫(yī)藥學(xué)家對(duì)香菇的藥性及功效均有著述［1-2］。香菇多糖提取自香菇子實(shí)體，是香菇的主要有效成分，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、抗病毒、刺激干擾素形成等多種作用［3-4］。作為免疫輔助藥物，香菇多糖可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移，提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，改善患者的身體狀況，并延長(zhǎng)其生命，治療胃癌、膀胱癌、肺癌、肝癌等的療效良好［5-6］。本研究中參考2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法［7］178-181，對(duì)香菇多糖無菌原料藥中的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行了動(dòng)態(tài)濁度檢查方法學(xué)［8］研究，同時(shí)考察了研磨法溶解樣品的干擾性及回收率，為該產(chǎn)品采用動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VERSA max 型酶標(biāo)儀（美谷分子儀器＜上海＞有限公司）；XS205DU 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司，精度為0.01 mg）；ZH-2 型自動(dòng)旋渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。研缽和試管均置金屬容器中，于250 ℃烘箱中放置至少30 min，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。

1.2 試藥

香菇多糖無菌原料藥（南京某制藥有限公司，批號(hào)分別為Y1904101，Y1904102，Y1905103，灰棕色顆粒）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為150601-201987，規(guī)格為每支80 EU）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（BET）用水（批號(hào)為1909250，規(guī)格為每瓶50 mL），動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（批號(hào)為1912090，規(guī)格為每支1.25 mL，檢測(cè)范圍為10～0.01 EU/ mL），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查反應(yīng)板（批號(hào)為190603-078），均購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司；動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)為19071812，規(guī)格為每支0.5 mL，檢測(cè)范圍為

10～0.01 EU/mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）確定

臨床治療時(shí)，注射用香菇多糖的使用劑量為1 周2 次，每次1 mg，用2 mL 滅菌注射用水振搖溶解，加250 mL 0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液，靜脈滴注。按公式L=K/（f·M）計(jì)算，其中，L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；K為人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K為5 EU/（kg·h）；f為安全系數(shù)，由于本品為抗腫瘤輔助治療藥，為保證用藥安全，根據(jù)指導(dǎo)原則，f取值為3［7］516-517；M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量，人均體質(zhì)量按60 kg 計(jì)算，則L為100 EU/mg。

2.2 供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）確定

香菇多糖無菌原料藥為分子量較大的多糖物質(zhì)，未經(jīng)過制劑工藝處理時(shí)，在水中極微溶解［5］。制備樣品時(shí)，先在無熱原研缽中將顆粒狀香菇多糖無菌原料藥輕輕壓碎，研磨成細(xì)粉，加入適量BET 用水，繼續(xù)研磨至香菇多糖溶散于其中，形成透明、均勻的溶液后，再用BET 用水稀釋至質(zhì)量濃度為0.2 mg / mL 的供試品溶液。按公式MVD =C·L/λ計(jì)算，其中，L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度，C為供試品溶液的濃度。本品L為100 EU/mg，λ為0.031 25 EU/mL，則MVD為640倍。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與可靠性試驗(yàn)

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1 支，用BET 用水溶解，并稀釋成終濃度分別為2.000 00，0.500 00，0.125 00，0.031 25 EU/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，取上述溶液各0.1 mL，加至預(yù)先加有0.1 mL 鱟試劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查反應(yīng)板內(nèi)，每個(gè)濃度平行3管。同時(shí)，以BET用水作陰性對(duì)照，平行2管。采用酶標(biāo)儀測(cè)定，以細(xì)菌內(nèi)毒素濃度對(duì)數(shù)值（lgC）為橫坐標(biāo)、平均反應(yīng)時(shí)間對(duì)數(shù)值（lgT）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，2批（安度斯，批號(hào)為1 912090；福州新北，批號(hào)為19071812）動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑回歸方程分別為lgT安=2.957-0.213 lgC安，r= -0.999 0；lgT福=2.939-0.205 lgC福，r= -0.996 0。結(jié)果陰性對(duì)照溶液反應(yīng)時(shí)間均大于最低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液反應(yīng)時(shí)間，2 種鱟試劑所作標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值均大于0.980，平行管之間變異系數(shù)均小于5%，表明細(xì)菌內(nèi)毒素濃度在0.031 25～2.000 00 EU/mL 范圍內(nèi)，其對(duì)數(shù)值與平均反應(yīng)時(shí)間對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系良好，細(xì)菌內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線均成立。結(jié)果見表1。

表1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Reliability test results of the standard curves of bacterial endotoxin

2.4 干擾試驗(yàn)

取3批（批號(hào)分別為Y1904101，Y1904102，Y1905103）香菇多糖無菌原料藥，各10 mg，精密稱定，分別放入去除熱原的研缽中，壓碎，研細(xì)，加入BET 用水2 mL，繼續(xù)研磨，直至香菇多糖溶散于BET 用水中，并呈透明、均勻溶液狀，轉(zhuǎn)移至試管中，用BET 用水稀釋至質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的溶液，備用。再用BET 用水將上述溶液稀釋至質(zhì)量濃度分別為5.000 0，2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.312 5 μg/mL 的系列供試品溶液A；選擇靠近標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（0.25 EU/mL）作為λm，制備與供試品溶液A 有相同稀釋倍數(shù)且含細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為λm（0.25 EU/ mL）的供試品溶液B；另以2.3 項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液作陽性對(duì)照，記作溶液C，每個(gè)濃度平行3管；以BET用水作陰性對(duì)照，記作溶液D，平行2管。分別取供試品溶液A、供試品溶液B 各0.1 mL，加至預(yù)先加有0.1 mL 鱟試劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查反應(yīng)板內(nèi)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)2管。測(cè)定完成后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計(jì)算供試品溶液A、供試品溶液B 的細(xì)菌內(nèi)毒素含量Ct和Cs，并按公式R=（Cs-Ct）/λm×100%計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。當(dāng)供試品溶液A 的質(zhì)量濃度為5.000 0 μg/mL時(shí)，部分供試品溶液B的回收率大于200%；當(dāng)質(zhì)量濃度分別為2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.312 5 μg / mL 時(shí)，供試品溶液B 的回收 率均在50%～200%范圍內(nèi)，均符合要求。故質(zhì)量濃度選擇2.500 0 μg/mL及以下進(jìn)行樣品定量測(cè)定。

表2 干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the interference test

2.5 研磨法處理樣品細(xì)菌內(nèi)毒素回收率試驗(yàn)［9-10］

樣品為難溶于水的大分子物質(zhì)，在供試品溶液制備過程中，進(jìn)行了分次物理研磨處理，為驗(yàn)證研磨過程對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素生物活性的影響，取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1 支，加BET 用水溶解，按2.3 項(xiàng)下方法制備含細(xì)菌內(nèi)毒素0.25 EU / mL 的溶液，備用，記為λm。分別取香菇多糖無菌原料藥（批號(hào)為Y1904101）10.12，10.10 mg，精密稱定，按2.4 項(xiàng)下方法分別制備溶液A、溶液B、溶液C、溶液D，采用酶標(biāo)儀測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得回歸方程lgT安= 2.821 - 0.254 lgC安，r=- 0.999 6；lgT福= 2.883- 0.235 lgC福，r= - 0.999 0。計(jì)算樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，并計(jì)算研磨法細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率。由表3 可知，當(dāng)供試品溶液的質(zhì)量濃度為0.312 5～5.000 0 μg/ mL 時(shí)，細(xì)菌內(nèi)毒素回收率均在50%～200%范圍內(nèi)；當(dāng)質(zhì)量濃度為2.500 0 μg/ mL 及以下時(shí)，細(xì)菌內(nèi)毒素回收率均在80%～120%范圍內(nèi)，均符合要求。故質(zhì)量濃度選擇2.500 0 μg/mL進(jìn)行樣品定量測(cè)定。

表3 研磨法回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of the recovery test by grinding method

2.6 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定結(jié)果

取3批（批號(hào)分別為Y1904101，Y1904102，Y1905103）香菇多糖無菌原料藥各10 mg，精密稱定，分別用BET用水稀釋成質(zhì)量濃度為2.500 0 μg/ mL 的供試品溶液。按2.3 項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和陰性對(duì)照溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)為lgT= 2.911 - 0.203lgC，r= - 0.999 0。選擇0.25 EU/ mL 作為λm，同時(shí)制備含上述供試品質(zhì)量濃度及細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為λm的供試品陽性對(duì)照溶液，取上述溶液各0.1 mL，加至預(yù)先加有0.1 mL 鱟試劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查反應(yīng)板內(nèi)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定，每批樣品重復(fù)2管。結(jié)果見表4。

表4 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定結(jié)果（安度斯）Tab.4 Results of content determination of bacterial endotoxin in samples（Zhanjiang A&C Biological Co.，Ltd.）

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法包括凝膠法和光度測(cè)定法［7］178-181，其中凝膠法是通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素限度檢測(cè)的方法；光度測(cè)定法包括濁度法和顯色基質(zhì)法，濁度法是利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而定量測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。相比于傳統(tǒng)的凝膠法，動(dòng)態(tài)濁度法具有操作方便、快捷、檢測(cè)范圍寬、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)樣品中含有一定量的內(nèi)毒素時(shí)，動(dòng)態(tài)濁度法可以通過回收率判定樣品的干擾情況，方便試驗(yàn)者對(duì)假陽性結(jié)果作出判斷［11］。

本研究中建立了定量檢測(cè)香菇多糖無菌原料藥中細(xì)菌內(nèi)毒素的動(dòng)態(tài)濁度法，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.312 5～2.500 0 μg/mL 時(shí)，對(duì)試驗(yàn)無干擾作用，可選用質(zhì)量濃度為2.500 0 μg/mL的供試品溶液進(jìn)行定量測(cè)定。曾建立了檢測(cè)香菇多糖無菌原料藥中細(xì)菌內(nèi)毒素的凝膠法［12］，與本檢測(cè)結(jié)果一致。

香菇多糖屬大分子化合物，難溶于水，可溶于熱水或稀堿。用熱水或稀堿處理樣品，會(huì)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的生物活性產(chǎn)生影響。溫度低于70 ℃，內(nèi)毒素分子的破壞程度與時(shí)間呈正比［13］；堿溶液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素也有一定破壞作用，且實(shí)際操作中，堿溶解樣品后，需要用酸回調(diào)溶液的pH 值至合適范圍內(nèi)［14］，操作煩瑣。本研究中采用物理研磨法增加了香菇多糖無菌原料藥的溶解性，以提升樣品的溶解速度，操作簡(jiǎn)便，且3 批香菇多糖無菌原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素回收率均接近100%，表明物理研磨法對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的生物活性無影響。

動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素在生產(chǎn)與臨床上有良好的應(yīng)用前景。反應(yīng)曲線可直觀顯示反應(yīng)過程，快速、準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的內(nèi)毒素含量，并考察樣品受干擾情況，有利于在生產(chǎn)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)o菌原料藥的污染情況，降低生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)［15］。由于單位時(shí)間內(nèi)人體僅可承受一定限值的細(xì)菌內(nèi)毒素，多種藥物中細(xì)菌內(nèi)毒素疊加，如超過限值，會(huì)導(dǎo)致危險(xiǎn)［16］。而本品為癌癥輔助治療藥物，與其他藥物聯(lián)用時(shí)，動(dòng)態(tài)濁度法能準(zhǔn)確、快速測(cè)定各藥品中細(xì)菌內(nèi)毒素的量值，可作為臨床聯(lián)合用藥的參考。