譙夢丹，馬麗麗，楊冰，劉宇程，周密

(1.西南石油大學 化學化工學院，四川 成都 610500； 2.西南石油大學 工業(yè)危廢處置與資源化利用研究院，四川 成都 610500)

含油污泥是原油在開采、運輸、儲存過程中產生的一種污染物[1]。其成分極其復雜，包含重金屬、老化原油、多環(huán)芳烴及鹽類等[2]，是《國家危險廢物名錄》HW08類危廢物[3-4]。這類有毒物質對人體健康和生態(tài)系統(tǒng)平衡存在巨大的影響[5]。因此，針對含油污泥處理技術的研究已迫在眉睫。目前，電場強化微生物技術多用于土壤中石油烴的降解，而利用該技術處理含油污泥的研究并不多見[6-7]。本研究從某油田的含油鉆屑中篩選出2株石油烴降解能力較強的菌株，研究電場強化微生物技術對含油污泥的處理效果，以期為含油污泥的處理提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

本研究使用的菌株篩選自含油鉆屑；含油污泥，取自某石油化工企業(yè)的清罐油泥，含油污泥的理化性質見表1，將其風干、粉碎后用于后續(xù)實驗。

CS-700高速多功能粉碎機；LC-LX-H1850臺式高速離心機；SB-4200 DTD超聲波清洗機；SW-CJ-2FD潔凈工作臺；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋；THZ-92A恒溫振蕩器；UV-1900i紫外分光光度計；TD1326可調直流穩(wěn)壓電源；MGC-250光照培養(yǎng)箱；OIL480低濃度石油類紅外測油儀；PHS-3C pH計。

表1 含油污泥理化性質Table 1 Physicochemical properties of oily sludge

1.2 培養(yǎng)基制備

實驗所用培養(yǎng)基如下，所有培養(yǎng)基的pH均調整為7.0～7.5，并在121 ℃、1×105Pa下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.1 LB培養(yǎng)基 酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L。

1.2.2 原油液體培養(yǎng)基 原油5 g/L、NaCl 5 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、(NH4)2SO41 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、CaCl20.5 g/L。

1.2.3 原油固體培養(yǎng)基 原油5 g/L、NaCl 5 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、(NH4)2SO41 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、CaCl20.5 g/L、瓊脂20 g/L。

1.2.4 柴油液體培養(yǎng)基 柴油5 g/L、NaCl 5 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、(NH4)2SO41 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、CaCl20.5 g/L。

1.3 實驗方法

1.3.1 石油烴降解菌的篩選 取10 g含油鉆屑接入150 mL的無菌水中，在35 ℃、150 r/min條件下，放入搖床振蕩30 min后，移取1 mL的懸液加入到LB培養(yǎng)基中，在上述相同條件下培養(yǎng)48 h。然后，將富集的菌懸液移取1 mL轉移至原油液體培養(yǎng)基中，在上述相同條件下培養(yǎng)48 h，重復3次后，將富集菌懸液按一定梯度稀釋后，將稀釋液接入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，從平板上挑取形態(tài)不一的菌株進行劃線、分離，得到長勢好的單菌，再將單菌接種到原油液體培養(yǎng)基中，進行復篩培養(yǎng)，最終篩選出5株降解菌(編號為S1～S5)。

1.3.2 菌株的降解能力 篩選出的5株菌株經過活化后，將菌液分別接種到100 mL的柴油液體培養(yǎng)基中，放入搖床培養(yǎng)7 d后，將培養(yǎng)基倒入分液漏斗，加入正己烷萃取柴油，采用紫外分光光度計測定萃取液中的柴油的含量。柴油降解率按式(1)計算。

(1)

式中D——柴油降解率，%；

C0——處理前柴油含量，mg/L；

C1——處理后柴油含量，mg/L。

1.3.3 菌株的鑒定 本研究將篩選出的兩株菌株保藏在甘油中委托生工生物公司進行16S rDNA測序，所得結果經NBCI 數(shù)據(jù)庫比對后，挑選相關序列，采用MEGA 6.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定菌屬。

1.3.4 含油污泥處理實驗 如圖1所示，電動裝置由有機玻璃板組成。反應室長20 cm、寬10 cm、高10 cm，電極室長10 cm、寬10 cm、高12 cm。電場強化微生物處理含油污泥實驗在反應室中進行。為了防止污泥進入電解室，在反應室和電解室中間放入濾紙。兩碳板采用平行方式放入電解室中，電解液成分(單位是g/L)是NaNO3：1.5，(NH4)2SO4：1.5，MgSO4·7H2O：0.5，KCl：0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O：0.01，CaCl2：0.002，每3 d換1次電解液。本研究設置3個處理組，其中電動微生物組(EKBio)為施加電場并加入降解菌(每株菌加量為2.5%，v∶w)；電動力學組(EK)為只施加電場；微生物組(Bio)則只添加降解菌(每株菌加量為2.5%，v∶w)。每組3個重復，每個反應器500 g含油污泥。根據(jù)含油污泥中的碳、氮、磷比，以NH4Cl作為氮源，添加到污泥中，使C∶N∶P約為100∶10∶1。每隔12 h切換電極，電壓梯度為1 V/cm，實驗處理周期為20 d，將反應室分為初始陽極、中間、初始陰極三個區(qū)域，每次分別從三個區(qū)域取樣。EKBio、EK、Bio三個處理組分別在第0天和第20天進行取樣，另外對EKBio處理組在第4天和第12天進行取樣，所有樣品保存至4 ℃冰箱中待測。采用紅外分光光度法(HJ 1051—2019)測定含油污泥中石油烴的含量，計算出總石油烴(TPH)的降解率。在本研究中，EKBio處理組和EK處理組的TPH總降解率是初始陽極、中間和初始陰極附近TPH降解率的平均值，而Bio處理組的TPH總降解率是3組平行實驗TPH降解率的平均值，而每個組的TPH降解率是由三個區(qū)域附近的污泥混合為一個樣進行測定得到。

圖1 電動裝置圖Fig.1 Schematic of the electrokinetics setup

2 結果與討論

2.1 石油烴降解菌的篩選及鑒定

2.1.1 菌株的篩選 篩選出的S1～S5菌株對柴油均具有一定的降解作用，其中S1和S2對柴油的降解率較高，分別為27.53%和48.22%(表2)。因此，選定菌株S1和S2用于后續(xù)電場強化微生物技術處理含油污泥實驗。

表2 菌株S1～S5對柴油的降解率Table 2 Degradation rate of diesel oil by strains S1～S5

2.1.2 菌株 16S rDNA 的鑒定 將S1、S2菌株分別命名為PCY、PCW。PCY 的 16S rDNA 序列與Pseudomonasstutzeristrain CCUG 11256(登錄號 NR_118798.1)有99%的相似度；PCW的16S rDNA序列與Klebsiellaoxytocastrain ATCC 13182(登錄號NR_118853.1)有99%的相似度，通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，表明PCY菌為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，PCW菌為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)。

圖2 菌株PCY、PCW的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The 16S rDNA phylogenetic tree of strains PCY and PCW

2.2 含油污泥中石油烴的降解

2.2.1 不同處理方式對石油烴降解的影響 不同處理方式下含油污泥中總石油烴(TPH)的降解情況見圖3。

由圖3可知，經過20 d的處理，電動微生物組(EKBio)、電動組(EK)、微生物組(Bio)的TPH降解率分別為31.25%，14.18%，7.45%。EKBio處理后的TPH降解率明顯高于Bio處理后的TPH降解率，表明電場作用提高了微生物降解石油烴的效率。在EKBio處理中，一方面，電場可能促進營養(yǎng)物質在污泥中的均勻分布，同時進一步促進營養(yǎng)物質進入微生物細胞內，加強微生物的新陳代謝[8]，有助于石油烴降解菌的生長[9]；另一方面，電場對細菌產生刺激作用，使其保持較高的酶活性及代謝活性，并且在電場作用下增強了細菌運動[10]，促使微生物能夠更快地降解石油烴，顯著縮短處理周期。此外，在電滲透作用下石油烴也會從陽極運動到陰極，從而提高了其生物利用度[9]。EK處理后的TPH降解率低于EKBio處理后的TPH降解率，并且EK處理組在不同區(qū)域的TPH降解率均低于EKBio處理組在不同區(qū)域的TPH降解率(圖4)，這也表明加入外源微生物能夠有效提高EK處理含油污泥的效率。在EK和EKBio處理中，兩電極附近的TPH降解率均高于中間附近的TPH降解率，原因可能是在電場條件下，由于水分子和含油污泥表面相互作用，產生水向陰極流動的電滲透，在轉換電極作用下，這種水流裹挾石油烴向兩極移動，最終在電氧化作用下石油烴被降解[10]，而在EKBio處理中，外源降解菌會在電滲透和電遷移作用下向兩極移動，降解菌與污染物之間的接觸程度增大[11]，使得EKBio處理組中兩電極附近的TPH降解率明顯高于EK處理組中兩電極附近的TPH降解率，證明了電場強化微生物的積極作用。

圖3 電動、微生物及其聯(lián)合處理對TPH降解率的影響Fig.3 Effects of electrokinetics，bioremediation and combined treatment on TPH degradation rate

圖4 電動微生物、微生物處理后 不同區(qū)域的TPH降解率Fig.4 Effects of electro-bioremediation and bioremediation on TPH degradation rate in different areas

2.2.2 電場強化微生物技術處理含油污泥的效果 在周期性極性反轉的方式下，采用電場強化微生物技術對含油污泥進行20 d的處理，處理過程中初始陽極、中間、初始陰極附近含油污泥的石油烴降解率變化見圖5。

圖5 電場強化微生物處理含油污泥過程中 不同區(qū)域的TPH降解率Fig.5 Effect of electro-bioremediation on TPH degradation rate in different areas

由圖5可知，在EKBio處理過程中，隨著處理時間的增加，TPH的總降解率呈上升趨勢，且兩電極附近的TPH降解率明顯高于中間附近的TPH降解率。這可能是因為陽極附近活性自由基的產生，以及自由基隨后擴散到含油污泥中，可將石油烴氧化為部分微生物易降解的產物[12-13]。此外，在電場作用下，降解菌向兩極移動[11]，使得兩電極附近的TPH降解率高于中間附近的TPH降解率。與本研究的結果相似，Li等[14]研究極性反轉電動強化生物降解對芘污染土壤的影響，發(fā)現(xiàn)極性反轉后兩電極附近的芘降解率高于中間部分的芘降解率。而Wei等[15]研究電極極性反轉對含菲粘土生物修復的影響，結果表明使用電極極性反轉對菲有更高的去除率，其中中間附近的菲去除率高于兩極附近的菲去除率。由此可見電極轉換對不同電極區(qū)域的污染物降解的影響較為復雜，可能與轉換電極的周期以及污染物種類和取樣時間有關。

2.2.3 電場強化微生物技術處理含油污泥的降解速率 由圖6可知，電場強化微生物處理過程中TPH的降解速率呈現(xiàn)下降趨勢。在0～4 d，石油烴的降解速率最快，這可能是因為大量外源微生物加入含油污泥，開始以石油烴作為碳源進行生長繁殖，并且在電場刺激下，微生物保持較高的代謝活性[10]，兩者的聯(lián)合作用使得TPH降解速率最高。在4～12 d和12～20 d，石油烴降解速率持續(xù)下降，可能是由于氮源、磷源等營養(yǎng)物質的消耗和缺乏，使得微生物新陳代謝速度下降，影響微生物降解石油烴的能力[9]。一些中間有毒產物的產生也會影響微生物降解石油烴的速率[16]。此外，中間區(qū)域的石油烴降解速率最低，可能是因為微生物在電遷移和電滲透的作用下向著兩極遷移[17]，有助于降解兩極的石油烴，從而使得中間區(qū)域的石油烴降解速率小于兩電極的降解速率。

圖6 電場強化微生物處理含油污泥過程中的降解速率Fig.6 Degradation rate of oily sludge treated by electro-bioremediation

2.3 含油污泥pH的變化

含油污泥的pH值對微生物高效降解有機污染物至關重要[14]。當直流電場作用于含油污泥時，水在電極處發(fā)生電解作用，陽極產生H+，陰極產生OH-，陽極和陰極附近的含油污泥會出現(xiàn)極端pH[18]。因此，本研究利用極性反轉的方式進行處理，EKBio處理組在處理20 d后的含油污泥pH仍保持在7～8之間(圖7)，這是由于當逆轉電極的極性時，電極上產生的H+和OH-會被中和，使得含油污泥pH值能夠保持穩(wěn)定[6]，從而避免對微生物的生長代謝的影響，有助于石油烴的降解。

圖7 電場強化微生物處理含油污泥過程中污泥pH值的變化Fig.7 Changes of soil pH value during the treatment of oily sludge by electro-bioremediation

3 結論

(1)本研究從含油鉆屑中篩選出兩株石油烴降解菌，經鑒定菌株PCY為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，菌株PCW為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)。

(2)將降解菌與電動相結合用于處理含油污泥，其石油烴降解率為31.25%，明顯高于單獨電動處理(14.18%)和單獨微生物處理(7.45%)，表明電動與微生物協(xié)同作用于含油污泥中石油烴的降解。