孫婧悅 王嘯

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，在中國的發(fā)病率和死亡率均位居前列[1]。由于臨床癥狀不典型，胃癌的早期診斷率較低，多數(shù)患者確診時已處于進(jìn)展期，預(yù)后不佳[2]。目前，CEA、CA199、CA72-4、CA125 是已知的篩選胃癌的重要腫瘤標(biāo)志物，由于靈敏度不高，在協(xié)助診斷胃癌過程中作用有限。因此，尋找診斷胃癌的新型分子標(biāo)記物，用于早期胃癌的篩查具有重要的臨床意義[3]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為細(xì)胞主動分泌的膜囊泡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等多方面發(fā)揮重要作用[4]。miRNAs 是真核生物中調(diào)控mRNA 功能的非編碼單鏈小分子RNA[5]，目前認(rèn)為外泌體miRNAs 在血液中與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)體結(jié)合存在，以保護(hù)其被RNA 酶降解，故可通過抽取外周血檢測外泌體miRNAs，為胃癌的篩查及診斷提供新的思路[6]。本研究對胃癌患者及健康人血清外泌體miRNAs進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，初步探討差異性miRNAs 聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物在胃癌診斷中的價值，以期實(shí)現(xiàn)胃癌的早期診斷，從而改善預(yù)后，提高總體生存率。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

胃癌組：回顧性收集2020 年4 月至2021 年4 月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院初治的46 例胃癌患者的臨床病例資料、腫瘤標(biāo)志物檢測結(jié)果及全血標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡≥18 歲，ECOG 評分≤2 分；2）經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)為胃腺癌；3）既往沒有接受過化療和（或）放療的初治胃癌患者；4）心臟、肝臟、腎臟等重要臟器功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并除胃癌以外的其他系統(tǒng)惡性腫瘤；2）預(yù)計(jì)生存時間＜3 個月。

對照組：收集同時期性別和年齡與胃癌組相匹配的健康體檢者全血標(biāo)本20 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）無糖尿病、高血壓等慢性疾?。?）無惡性腫瘤病史及惡性腫瘤家族史；3）無心臟、肝臟、腎臟等重要臟器功能障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）既往有慢性消化系統(tǒng)疾病病史；2）合并幽門螺桿菌感染。

上述所有病例均經(jīng)研究對象本人及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本收集及外泌體提取 收集對照組和胃癌組患者首次用藥前的清晨空腹全血，在抗凝管中室溫下進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為4 000 rpm，15 min，取出紅細(xì)胞沉淀，取上清于-80℃冰箱中保存，以用于后續(xù)研究。取上述血清1 mL，加入外泌體分離試劑250 μL。混勻后置于4℃，以轉(zhuǎn)速12 000 g 離心20 min，靜置2 h。棄上清，所得沉淀用100 μL PBS 重懸，即外泌體。分裝后置于-80℃保存。

1.2.2 電鏡觀察外泌體的形態(tài) 吸取10 μL 外泌體于990 μL 的PBS 溶液中，充分混勻，再次吸取稀釋后的樣品20 μL，滴加到電鏡銅網(wǎng)上，10 min 后將銅網(wǎng)側(cè)面的液體吸干，加入10 μL 濃度為20 g/L 磷鎢酸于銅網(wǎng)上，室溫下負(fù)染1 min，繼續(xù)吸干多余的液體，晾干后將銅網(wǎng)放于槽中使用透射電鏡觀察。

1.2.3 Western blot 檢測外泌體標(biāo)志蛋白的表達(dá) 提取外泌體蛋白質(zhì)，檢測蛋白濃度，隨后進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜等步驟，置于含5%脫脂牛奶中封閉，TBST 洗滌3 次。將膜與一抗稀釋液孵育（1∶50 000 稀釋的抗CD9 抗體、1∶20 000 稀釋的CD63 抗體、1∶2 000 稀釋的CD81 抗體），4℃過夜，再加入1∶5 000 稀釋的二抗室溫孵育，暗室顯影。

1.2.4 血清外泌體總RNA 的提取及miRNAs 測序

從胃癌組及對照組中，各隨機(jī)抽取4 例血清樣本，嚴(yán)格按照外泌體RNA 提取試劑盒說明書提取血清外泌體RNA，將獲得的純化的miRNAs，送由上?？党缮锕?，行文庫構(gòu)建及測序分析，篩選出兩組差異表達(dá)倍數(shù)＞2 且P＜0.01 的外泌體miRNAs。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR 檢測miRNAs 表達(dá) 取2 μL RNA 樣品，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μL cDNA 模板，在20 μL 反應(yīng)體系內(nèi)行PCR 反應(yīng)，預(yù)變性95℃ 10 min 為1 個循環(huán)，變性95℃10 s，退火60℃ 20 s。于LightCycler 480 熒光定量PCR 儀擴(kuò)增40 個循環(huán)后收集數(shù)據(jù)。引物序列見表1，每個樣本重復(fù)檢測3 次，取平均值作為結(jié)果。

表1 miRNAs 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。研究中的數(shù)值均以±s表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；雙變量的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析外泌體miRNAs 及CA72-4 在胃癌診斷中的價值。所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定α=0.05，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

胃癌組納入患者46 例，其中男性26 例，女性20 例；年齡42～77 歲，根據(jù)第8 版TNM 分期進(jìn)行分期，其中Ⅰ期10 例，Ⅱ期13 例，Ⅲ期12 例，Ⅳ期11 例；分化程度：高、中、低分化分別為11 例、16 例、19 例；腫瘤位于胃底賁門11 例，胃體20 例，胃竇15 例。對照組納入標(biāo)本20 例，其中男性11 例、女性9 例；年齡35～70 歲。

2.1 血清外泌體鑒定結(jié)果

兩組血清外泌體提取后，通過透射電鏡觀察形態(tài)（圖1A）：呈囊泡狀，直徑約50～150 nm，形態(tài)基本相似，為橢圓形，呈雙層膜結(jié)構(gòu)。囊泡邊緣電子密度較高，顆粒感明顯。本研究采用Western blot 檢測外泌體標(biāo)記物表達(dá)，進(jìn)行外泌體鑒定。提示：血清外泌體特異性蛋白CD9、CD63、CD81 表達(dá)顯著升高（圖1B）。

2.2 血清外泌體miRNAs 測序結(jié)果

胃癌組及對照組各隨機(jī)抽取4 例血清樣本，進(jìn)行血清外泌體miRNAs 測序分析，變化倍數(shù)＞2 代表差異表達(dá)，在胃癌組和對照組血清外泌體中，表達(dá)差異顯著的miRNAs 共376 個，上調(diào)miRNAs 219 個，下調(diào)157 個。以差異性表達(dá)最顯著的25 個miRNAs 作聚類分析（圖2A）：紅色代表胃癌組血清中表達(dá)升高，綠色為表達(dá)降低。最終篩選出差異性表達(dá)最顯著的10個miRNAs（圖2B）：miR-1 246、miR-96-5p、miR-202-3p、miR-26a-5p、miR-1 323 表 達(dá) 上 調(diào)，miR-28-3p、miR-124a、miR-129-2、miR-146a、miR-877-5p 表達(dá)下調(diào)。

2.3 qRT-PCR 定量驗(yàn)證血清外泌體miRNAs 結(jié)果

選取上調(diào)的5 個miRNAs 作為研究對象，針對上述miRNAs，設(shè)計(jì)其上下游引物，并在46 例胃癌患者血清和20 例健康人群血清中行qRT-PCR 檢測進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果為miR-26a-5p、miR-1 323、miR-202-3p、miR-96-5p 在胃癌組血清外泌體中的表達(dá)較對照組顯著上調(diào)（圖3），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 驗(yàn)證后的miRNAs 診斷胃癌的效能

胃癌組血清外泌體的miR-26a-5p、miR-1323、miR-202-3p、miR-96-5p 表達(dá)顯著高于對照組，為進(jìn)一步評估m(xù)iRNAs 在胃癌診斷中的價值，采用ROC 曲線進(jìn)行分析，各ROC 曲線如圖4 所示。miR-1323 的靈敏度、特異度及曲線下面積（area under curve，AUC）分別為71.7%、100%、0.908，miR-26a-5p 的靈敏度、特異度及AUC 分別為67.4%、85.0%、0.815，miR-202-3p 的靈敏度、特異度及AUC 分別為30.4%、90.0%、0.570。miR-96-5p 的靈敏度、特異度及AUC分別為19.6%、100%、0.547。

2.5 Spearman 分析診斷胃癌的相關(guān)因素

以胃癌發(fā)生與否為因變量，將胃癌組和正常組的外泌體miR-1 323、miR-26a-5p、miR-202-3p、miR-96-5p表達(dá)水平及CEA、CA199、CA72-4 檢測結(jié)果行Spearman 相關(guān)分析，結(jié)果顯示：miR-26a-5p、miR-1 323 和CA72-4 與胃癌的發(fā)生相關(guān)（P＜0.001），而miR-96-5p、miR-202-3p、CEA、CA199 與診斷胃癌無關(guān)（表2）。

表2 Spearman 相關(guān)分析

2.6 外泌體miR-1 323、miR-26a-5p 聯(lián)合CA72-4 診斷胃癌的價值分析

血清外泌體miR-1 323、miR-26a-5p 表達(dá)水平均可以預(yù)測胃癌發(fā)生，曲線下面積（area under curve，AUC）均＞0.8。CA72-4 是輔助胃癌篩查及診斷的相關(guān)指標(biāo)之一[7]，本研究提示CA72-4 對胃癌診斷具有一定的預(yù)測價值（圖5A），AUC 為0.789，靈敏度為60.9%，特異度為95.0%。miR-26a-5p、miR-1 323、CA72-4 三者聯(lián)合診斷胃癌的AUC 為0.967，明顯高于三者單獨(dú)診斷的AUC（圖5B），且聯(lián)合診斷靈敏度和特異度分別為87.0%、100%，均高于三者單獨(dú)診斷的靈敏度和特異度。

3 討論

胃癌作為消化道常見的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、早期診斷率低、總體生存率低的特點(diǎn)。目前胃癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”為胃鏡活檢病理，由于費(fèi)用高及耐受性較差，難以成為大規(guī)模篩查胃癌的手段。此外，患者的預(yù)后與診治時期關(guān)系密切，早期胃癌相比于進(jìn)展期胃癌，5 年生存率顯著提高。因此，胃癌的早期診斷是改善預(yù)后的關(guān)鍵，探究胃癌的早期篩查及診斷標(biāo)志物具有重要的意義。

外泌體是細(xì)胞主動分泌的一種直徑約30～100 nm的膜囊泡，最先在哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，后期相關(guān)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，均有外泌體的分泌，且在腹水、血液、腦脊液及細(xì)胞培養(yǎng)液中可以穩(wěn)定存在[8]，外泌體通過釋放miRNAs 和蛋白質(zhì)，完成細(xì)胞間的信息交流[9]。

本研究共收集了20 例健康人和46 例初治胃癌患者的血清標(biāo)本，在胃癌組和對照組中各隨機(jī)抽取4例血清樣本，提取外泌體后，進(jìn)行外泌體miRNAs 測序分析，共篩選出376 個表達(dá)差異的miRNAs，其中胃癌組中表達(dá)上調(diào)的miRNAs 219 個，表達(dá)下調(diào)的miRNAs 157 個。由于上調(diào)的miRNAs 數(shù)量顯著高于下調(diào)的miRNAs，且差異表達(dá)的倍數(shù)越高，則診斷價值越大[10]。因此，本研究選取在胃癌組血清外泌體中表達(dá)上調(diào)最顯著的5 個miRNAs，并通過qRT-PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，排除了miR-1 246。

腫瘤標(biāo)志物CEA、CA199、CA72-4 是篩查胃癌的重要指標(biāo)，本研究中將上述3 個腫瘤指標(biāo)納入胃癌診斷的Spearman 相關(guān)分析中，結(jié)果提示CEA 和CA199 均與胃癌診斷無相關(guān)性。CEA 作為廣譜腫瘤標(biāo)記物，其特異性較低，在胃癌等多種實(shí)體腫瘤中均會顯著升高，CA199 作為胰腺癌的經(jīng)典標(biāo)志物，在胃癌的診斷中也有一定的參考價值。本研究的結(jié)果與既往臨床觀察不一致，可能與收集的胃癌病例數(shù)有限、胃癌患者及正?；颊叩睦龜?shù)不匹配、實(shí)驗(yàn)過程中存在誤差等因素相關(guān)，后續(xù)需要進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本量，并對大樣本進(jìn)行反復(fù)多次的檢測。通過Spearman 相關(guān)分析，CA72-4、miR-26a-5p 和miR-1 323 與胃癌診斷相關(guān)，而本研究對三者均繪制了胃癌診斷預(yù)測的ROC曲線圖，結(jié)果示三者單獨(dú)的AUC 均高于0.5。該結(jié)果提示：在大樣本人群胃癌的篩查中，需高度警惕上述各指標(biāo)的異常情況，并積極采取相應(yīng)的措施，以降低胃癌的漏診率。

針對上述3 個變量，根據(jù)既往研究查看：1）miR-26a-5p 可以通過靶向COL10A1 增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[11]；2）在食管癌研究中，circLARP4 可抑制細(xì)胞增殖，該抑制作用可被miR-1 323 所逆轉(zhuǎn)[12]；3）血清胃蛋白酶原、CA72-4 聯(lián)合胃泌素17 檢測對早期胃癌的篩查和診斷具有較高的敏感性和特異性，具有較高的臨床應(yīng)用價值[13]。除上述3 項(xiàng)研究，另有學(xué)者探討了miR-26a-5p、miR-1 323、CA72-4 與胃癌診斷的相關(guān)性[14-16]。結(jié)合本研究結(jié)果及上述研究，推測三者對胃癌診斷的預(yù)測均有一定的價值。此外，三者聯(lián)合預(yù)測胃癌診斷的AUC 明顯大于三者單獨(dú)預(yù)測。提示外泌體miR-26a-5p 及miR1323 聯(lián)合CA72-4 對胃癌診斷具有更高的臨床價值。

本研究存在一定的局限性，外泌體的鑒定采用標(biāo)記物檢測及電鏡觀察，缺乏粒徑分析結(jié)果。此外，受到樣本量的限制，未分別對早、中、晚期胃癌患者外泌體miRNAs 和胃癌發(fā)生進(jìn)行分析，在后續(xù)研究中，將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，尤其是加強(qiáng)早期病例的收集，并對早、中、晚期患者進(jìn)行分層分析，以期最大程度發(fā)掘miRNAs對早期胃癌的診斷價值。

綜上所述，本研究通過對胃癌患者和健康人的血清外泌體miRNAs 測序驗(yàn)證，以及腫瘤標(biāo)志物的統(tǒng)計(jì)分析，篩選出miR-26a-5p、miR-1 323 和CA72-4 均在胃癌診斷中有一定的價值。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上述三者聯(lián)合診斷胃癌具有更高的價值。由于外泌體miRNAs與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)體結(jié)合，不被RNA 酶降解，具有較高的穩(wěn)定性，因此，相比于胃鏡檢查，聯(lián)合檢測外周血外泌體miRNAs 及CA72-4 更容易被接受用于胃癌的篩查及診斷，具有較好的應(yīng)用前景，有望提高胃癌的早期診斷率。