趙雨薇，戴月英，甄艷杰，李 煒，沈麗霞

(河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北省神經(jīng)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，以漸進(jìn)性記憶缺失和行為異常為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。引起AD的機(jī)制尚不明確，主要存在諸如氧化應(yīng)激、線粒體損傷、Aβ毒性等假說，Aβ沉積、神經(jīng)炎癥的發(fā)生和氧化應(yīng)激等均會(huì)引起線粒體損傷[2]，線粒體因其能控制細(xì)胞的能量狀態(tài)和細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為在調(diào)節(jié)衰老和與年齡相關(guān)的神經(jīng)元變性中發(fā)揮中央細(xì)胞器作用[3]。線粒體電子因在衰老組織中的運(yùn)輸效率較低，損害ATP的合成從而導(dǎo)致氧化劑產(chǎn)生增加[4]，這種變化可能引起細(xì)胞凋亡而致大腦衰老，造成認(rèn)知功能喪失[5]。以往的研究表明[6]，Aβ誘導(dǎo)破壞膜的性質(zhì)和改變線粒體的動(dòng)力學(xué)，引發(fā)線粒體膜電位的崩潰，誘導(dǎo)釋放因子透過線粒體膜于細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)生凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)AD的發(fā)生和發(fā)展[7]。

槲皮素(quercetin，Que)結(jié)構(gòu)與雌二醇類似，是一種天然的植物雌激素，在改善心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)方面有一定作用[8]。課題組前期研究表明，Que可通過雌激素受體介導(dǎo)信號(hào)通路的激活，減少Aβ25-35毒性損傷的PC12細(xì)胞凋亡[9]。根據(jù)往期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)采用20 μmol·L-1Aβ25-35毒性損傷的PC12細(xì)胞作為AD體外模型，17β-雌二醇(17β-estradiol，17β-E2)與50 μmol·L-1金雀異黃素(genistein，Gen)作為陽性對(duì)照，進(jìn)一步探討Que通過雌激素受體介導(dǎo)線粒體途徑的機(jī)制而抑制Aβ25-35毒性損傷引起的細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 PC12細(xì)胞，中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.1.2藥物與試劑 槲皮素(100081-201610)和金雀異黃素(111704-201703)購于中國藥品生物制品檢定研究所；Aβ25-35(Y0044)購于北京博奧森；Rhodamine 123(C2007)購于碧云天生物技術(shù)；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(BCA法)(BL521A)購于Biosharp公司；琥珀酸脫氫酶(SDH)測(cè)試盒(A022)和超微量Na+,K+-ATP酶測(cè)試盒(A070-2)購于南京建成生物工程研究所；CyTM3-conjugated Affini Pure Goat Anti-Mouse IgG(101887)購于Jackson Immuno Research 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗 IgG(H+L)(4103945)購于 Novus Biologicals 公司；β-action(SC47778)購于聯(lián)科生物公司；17β-雌二醇(ab120657)、雌激素受體完全拮抗劑ICI182,780(ab120131)、anti-Estrogen Receptor alpha antibody(ab32063)、anti-Estrogen Receptor beta antibody(ab3576)、Anti-Bcl-2 antibody(ab59348)、Anti-Bax antibody(ab182733)、Anti-active caspase-3 antibody(ab49822)、重組Anti-Cytochrome C antibody(ab133504)購于美國Abcam公司；

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo 公司)；超速冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS公司)；熒光倒置顯微鏡(Nikon公司)；體視學(xué)顯微鏡(Leica公司)；多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Protein Simple公司)。

1.2 方法

1.2.1線粒體膜電位的測(cè)定 細(xì)胞以每孔1×104的密度接種于培養(yǎng)皿24 h后。實(shí)驗(yàn)分組為Control組、Aβ25-35毒性損傷組、Aβ25-35與17β-E2、Gen、Que(40、60、80 μmol·L-1)分別共孵育組，給藥24 h后，加入37 ℃預(yù)溫育的Rhodamine 123染色液1 mL，作用20 min后；DAPI復(fù)染，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。

1.2.2SDH的測(cè)定 細(xì)胞以1×108L-1密度將接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)分組為Control組、Aβ25-35毒性損傷組、Aβ25-35與17β-E2、Gen、Que(40、60、80 μmol·L-1)分別共孵育組和雌激素受體完全拮抗毒性損傷組。按說明書提取分離各組線粒體，獲取各組線粒體懸液，按照SDH測(cè)試盒測(cè)定線粒體SDH活力。

1.2.3Na+,K+-ATP 酶活力的測(cè)定 細(xì)胞以1×108L-1密度將接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)分組同“1.2.2”，按照Na+,K+-ATP酶測(cè)試盒測(cè)定線粒體Na+,K+-ATP酶活力。

1.2.4Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白 細(xì)胞分組同“1.2.2”，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量各組蛋白，制膠，上樣，BIO-RAD凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，室溫封閉液封閉2 h后，加入一抗 β-actin(1 ∶500)、雌激素受體 α / β(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶2 000)、caspase-3(1 ∶600)、Cytochrome C(1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜。TBST進(jìn)行清洗3次(每次10 min)。室溫孵育二抗(Goat anti-mouse IgG/HRP，1 ∶4 000)2 h。TBST 進(jìn)行清洗3次(每次10 min)，使用ECL曝光顯影后，分析各組條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 Que 對(duì)線粒體膜電位的影響與正常對(duì)照組相比，毒性損傷組熒光較強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與毒性損傷組相比，Aβ25-35+17β-E2、Aβ25-35+Gen、Aβ25-35+Que(60 μmol·L-1)組熒光強(qiáng)度均明顯降低(P<0.01)(Fig 1A，B)。表明Que 可改善Aβ25-35毒性損傷造成的PC12細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低，作用與陽性藥17β-E2和Gen效果相似。

Fig 1 Effect of Que and Aβ25-35 on mitochondrial membrane potential in PC12 cells(×600)A:Fluorescence of mitochondrial membrane potential of PC12 cells; B: Quantification of the mitochondrial membrane potential mean fluorescent n=4). **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs Aβ25-35

2.2 Que對(duì)毒性損傷的PC12細(xì)胞線粒體影響

2.2.1Que對(duì)線粒體SDH酶活力的影響 如Fig 2A中所示，與正常組相比，Aβ25-35毒性損傷組 SDH 活力水平明顯減少(P<0.01)。低中高劑量濃度的 Que(40、60和80 μmol·L-1)和 Aβ25-35共孵育24 h后的細(xì)胞 SDH 活力水平與毒性損傷組相比明顯增加(P<0.01)。提示Que可提高PC12損傷細(xì)胞的線粒體琥珀酸脫氫酶活力，效果與17β-E2和Gen相似。

Fig 2 Effect of Que on SDH activity on PC12 n=4)A: Effect of Que on PC12 cell SDH activity injured by Aβ25-35 toxicity. B: Effect of Que on PC12 cell SDH activity pretreated with ICI182,780. *P<0.05,**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs Aβ25-35; △△P<0.01 vs Aβ25-35+Que(60 μmol·L-1)

含有ICI182,780抑制劑預(yù)處理組中，Aβ25-35+ICI182,780+Que組細(xì)胞的線粒體琥珀酸脫氫酶活力與Aβ25-35+Que相比明顯被抑制(P<0.01)(Fig 2B)，表明在Que提高PC12損傷細(xì)胞的線粒體 SDH 酶活力過程中，具有ER受體通路的參與。

2.2.2Que對(duì)線粒體Na+,K+-ATP酶活力影響 如Fig 3A中所示，Aβ25-35+Que(40、60和80 μmol·L-1)組Na+,K+-ATP活力分別為(1.38±0.03)U·mgprot、(1.71±0.04)U·mgprot和(1.28±0.05)U·mgprot，與毒性損傷組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明，Que 可提高毒性損傷的PC12細(xì)胞內(nèi)線粒體Na+,K+-ATP酶活力，效果與17β-E2和Gen相似。

Fig 3 Effect of Que on Na+,K+-ATPase activity on PC12 n=4)A: Effect of Que on PC12 cell Na+,K+-ATPase activity injured by Aβ25-35 toxicity. B: Effect of Que on PC12 cell Na+,K+-ATPase activity pretreated with ICI182,780. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs Aβ25-35; △△P<0.01 vs Aβ25-35+Que(60 μmol·L-1)

含有ICI182,780抑制劑預(yù)處理組中，Aβ25-35+ICI182,780+Que 組細(xì)胞線粒體的Na+，K+-ATP 酶活力與Aβ25-35+Que組相比被明顯抑制(P<0.01)(Fig 3B)，表明ER受體通路的阻斷影響了Que 對(duì) Na+,K+-ATP酶活力的保護(hù)。

2.3 Western blot 檢測(cè) ERα、ERβ 以及 Bcl-2、Bax、active-caspase-3 與 Cytochrome C蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比，毒性損傷組明顯下調(diào)ERα表達(dá)(P<0.01)，陽性藥(17β-E2、Gen)和Que分別與Aβ25-35共同孵育后，均明顯升高了ERα表達(dá)(P<0.01)，而毒性損傷組和藥物(17β-E2、Gen和Que)+Aβ25-35共同孵育后ERβ蛋白組間表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)(Fig 4A，B，C)。藥物(17β-E2、Gen和Que)+Aβ25-35組與毒性損傷組相比，上調(diào)了Bcl-2表達(dá)(P<0.05)(Fig 5A，B)，下調(diào)Bax、active-caspase-3 與Cytochrome C蛋白的表達(dá)(P<0.05)(Fig 5A、C，F(xiàn)ig 5A、E，F(xiàn)ig 5A、F)，提高了Bcl-2 / Bax蛋白表達(dá)比率(P<0.01)(Fig 5A、D)。使用ICI182,780抑制劑進(jìn)行干預(yù)進(jìn)一步探討Que神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35+Que(60 μmol·L-1)組與毒性損傷組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)(Fig 6A，B)，Bax、active-caspase-3與Cytochrome C蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)(Fig 6A、C，F(xiàn)ig 6A，E，F(xiàn)ig 6A，F(xiàn))，且Bcl-2 / Bax比率上升(P<0.01)(Fig 6A、D)；而ICI182,780+Aβ25-35組和ICI182,780+Aβ25-35+Que組與毒性損傷組相比線粒體凋亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示Que可通過激活經(jīng)典雌激素受體，抑制線粒體凋亡途徑關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。

Fig 4 Effect of Que and Aβ25-35 on protein levels of ERα and ERβ in PC12 n=3)A: Detection of protein levels of ERα and ERβ by Western blot; B: Quantification analysis of ERα level; C: Quantification analysis of ERβ level. *P<0.05 vs control; ##P<0.01 vs Aβ25-35

Fig 5 Effect of Que and Aβ25-35 on protein levels of Bcl-2, Bax, active-caspase 3 and cytochrome C in PC12 n=3)1： Control； 2：Aβ25-35； 3：17β-E2; 4: Gen; 5: Que/40 μmol·L-1; 6: Que/60 μmol·L-1; 7: Que/80 μmol·L-1. A: Detection of protein levels of Bcl-2, Bax, active-caspase 3 and Cytochrome C by Western blot; B: Quantification analysis of Bcl-2 level; C: Quantification analysis of Bax level; D: Quantification analysis of Bcl-2/Bax level; E: Quantification analysis of active-caspase- 3 level; F: Quantification analysis of cytochrome C level. *P<0.05，**P<0.01 vs control; #P<0.05，##P<0.01 vs Aβ25-35

Fig 6 Effect of Que and Aβ25-35 on protein levels of Bcl-2, Bax, active-caspase- 3 and cytochrome C in PC12 cells pretreated with ICI182,7801: Aβ25-35/20 μmol·L-1; 2: Que/60 μmol·L-1; 3: ICI/1 μmol·L-1. A: Detection of protein levels of Bcl-2, Bax, active-caspase- 3 and cytochrome C by Western blot; B: Quantification analysis of Bcl-2 level; C: Quantification analysis of Bax level; D: Quantification analysis of Bcl-2/Bax level; E: Quantification analysis of active-caspase- 3 level; F: Quantification analysis of cytochrome C level. *P<0.05，**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs Aβ25-35;△△P<0.01 vs Aβ25-35+Que(60 μmol·L-1)

3 討論

大量研究表明，雌激素通過多種機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但由于雌激素的不良反應(yīng)造成臨床應(yīng)用存在爭議，研究探討雌激素神經(jīng)保護(hù)作用的靶點(diǎn)，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生與發(fā)展機(jī)制，開發(fā)防治神經(jīng)退行性疾病的雌激素受體調(diào)節(jié)劑，從而有可能為臨床上AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治提供新的策略和思路。越來越多的證據(jù)表明，AD患者腦內(nèi)細(xì)胞淀粉樣蛋白沉積出現(xiàn)之前，線粒體功能障礙是認(rèn)知老化和AD發(fā)病的早期事件，線粒體損傷又進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元丟失，加劇AD的進(jìn)展。減輕線粒體功能障礙并提供神經(jīng)保護(hù)作用的藥物有望用于AD治療。因此，改善線粒體損傷成為AD防治需要關(guān)注的問題。我們實(shí)驗(yàn)研究揭示了Que可通過介導(dǎo)ERα作用于線粒體靶點(diǎn)起到神經(jīng)保護(hù)作用，從分子角度為 Que 在治療AD和線粒體途徑凋亡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的潛在應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

由線粒體主導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)為Cytochrome C的釋放，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激產(chǎn)生凋亡信號(hào)，促進(jìn)Bax過表達(dá)，并移位到線粒體膜上，打破線粒體膜電位的平衡，建立釋放因子通道，釋放Cytochrome C，與胞質(zhì)中caspase-9前體結(jié)合形成凋亡體，增強(qiáng)caspase-3活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而激活Bcl-2可以抑制各種刺激引起的caspase-3凋亡途徑和Cytochrome C的釋放，并且Bcl-2 / Bax表達(dá)比值與線粒體膜通透性成正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)表明，Que能夠明顯促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，升高線粒體膜電位，下調(diào)Bax、active-caspase-3的表達(dá)，減少Cytochrome C的釋放，調(diào)控Aβ25-35造成的細(xì)胞凋亡。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Que還可提高毒性損傷的細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)活力和線粒體Na+,K+-ATP酶活力，保證胞內(nèi)能量代謝正常運(yùn)行，維持線粒體環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因序列上含有雌激素反應(yīng)位點(diǎn)，雌激素抑制細(xì)胞凋亡作用可能通過與ER結(jié)合直接促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)[10]。有證據(jù)已表明雌激素可通過介導(dǎo)ER調(diào)節(jié)線粒體功能障礙，以線粒體為靶向抑制H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[11]。為探討Que保護(hù)PC12細(xì)胞免受Aβ25-35造成的線粒體損傷是否通過介導(dǎo)雌激素受體，采用Aβ25-35毒性損傷處理PC12，Western blot 檢測(cè)到毒性損傷組ERα表達(dá)與對(duì)照組相比明顯下調(diào)，Que、17β-E2、Gen和Aβ25-35分別共同孵育后，與Aβ25-35毒性損傷組相比ERα表達(dá)量明顯升高，ERβ 表達(dá)量組間無差異，表明Que可通過與17β-E2、Gen相似的保護(hù)作用機(jī)制，減少Aβ25-35毒性損傷造成的細(xì)胞凋亡；加入ICI182，780抑制劑進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)ICI182，780預(yù)孵育可減弱Que的抗凋亡作用，以及扭轉(zhuǎn)Que對(duì)線粒體功能的保護(hù)和線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。