顧旭東 郭宏宇 儲(chǔ)祥薔

（1.中國(guó)工程物理研究院研究生院 100193；2.中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所 100049；3.散裂中子源科學(xué)中心 523803）

蛋白質(zhì)是美妙生命世界的基礎(chǔ)，承擔(dān)了生物體內(nèi)絕大多數(shù)的工作，其表現(xiàn)出的多樣性與專(zhuān)一性彰顯了大自然的深?yuàn)W與智慧。然而，要真正理解生命的奧秘，就要揭開(kāi)蛋白質(zhì)這一復(fù)雜生物大分子的神秘面紗。蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域雖然存在重大的機(jī)遇，但也面臨巨大的挑戰(zhàn)①。蛋白質(zhì)是由約20種氨基酸組成的肽鏈經(jīng)過(guò)折疊、組裝構(gòu)成的具有多級(jí)結(jié)構(gòu)的生物大分子?？臻g結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)的功能具有決定性作用，但是僅依靠蛋白質(zhì)的靜態(tài)結(jié)構(gòu)并不能完全理解蛋白質(zhì)的工作機(jī)理。這是因?yàn)榘ㄕw柔性、結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng)、局部受限運(yùn)動(dòng)在內(nèi)的蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)行為也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的功能起到重大的影響。因此，從靜態(tài)結(jié)構(gòu)-動(dòng)力學(xué)行為-生物學(xué)功能相互關(guān)聯(lián)的角度去研究蛋白質(zhì)，可以加深對(duì)蛋白質(zhì)分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)，并已成為研究者之間的共識(shí)②③。在蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的研究中，中子散射憑借許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)占據(jù)了不可替代的地位。

中子在蛋白質(zhì)研究中最大的優(yōu)勢(shì)在于中子對(duì)氫元素的高度敏感性。氫原子是蛋白質(zhì)中數(shù)目最多的原子，參與形成的氫鍵深刻地影響著蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)方式。然而氫原子只有一個(gè)電子，很難被X 光、電子等實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)到。不同的是，中子直接被原子核散射，對(duì)氫原子有非常好的響應(yīng)。氫原子對(duì)中子的非相干散射截面比生物體系中常見(jiàn)的其他原子高一個(gè)數(shù)量級(jí)④。非相干散射信號(hào)本質(zhì)上反映了原子的自相關(guān)性，因而非常適合動(dòng)力學(xué)的研究。此外，中子具有分辨同位素的能力且對(duì)氫和氘的散射截面差異巨大。用氘原子取代蛋白質(zhì)或溶劑中的氫原子給實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了一個(gè)新的自由度，并且蛋白質(zhì)的部分氘代技術(shù)已使得研究特定位點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)成為可能。中子因其高穿透力、電中性、低能量的特點(diǎn)，相較于X光和冷凍電鏡，更易在不破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的前提下完成對(duì)其結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)的原位探測(cè)。

蛋白質(zhì)在不同時(shí)間空間尺度上的變化過(guò)程可用不同的中子散射技術(shù)進(jìn)行研究，如圖1 所示。發(fā)生在納秒到微秒時(shí)間尺度和原子到分子空間尺度的結(jié)構(gòu)域動(dòng)力學(xué)過(guò)程，可以通過(guò)中子自旋回波技術(shù)研究；發(fā)生在皮秒到納秒時(shí)間尺度上的分子內(nèi)部的弛豫運(yùn)動(dòng)，可以用準(zhǔn)彈性中子散射技術(shù)研究；發(fā)生在飛秒到皮秒時(shí)間尺度的原子振動(dòng)帶來(lái)的聲子激發(fā)，可以用非彈性中子散射技術(shù)觀測(cè)。這些不同空間尺度上的動(dòng)態(tài)過(guò)程共同實(shí)施促成了蛋白質(zhì)的功能，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)選擇合適的實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)研究不同時(shí)間尺度的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

圖1 用以研究蛋白質(zhì)不同時(shí)間空間尺度結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)信息的中子散射技術(shù)⑤

準(zhǔn)彈性中子散射技術(shù)廣泛使用背散射譜儀研究蛋白質(zhì)體系的動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。中子背散射譜儀(NBS)具有高能量分辨率以及與蛋白質(zhì)局部弛豫運(yùn)動(dòng)相當(dāng)?shù)挠^測(cè)時(shí)間窗口(ps-ns)。蛋白質(zhì)在這一時(shí)間尺度上的弛豫運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為與分子活性高度相關(guān)⑥。國(guó)際上已有的中子背散射譜儀包括：澳大利亞核科學(xué)和技術(shù)組織(ANSTO)的EMU(圖2)，法國(guó)勞厄-朗之萬(wàn)研究所(ILL)的IN13 和IN16B，德國(guó)尤利希中子科學(xué)中心(JCNS)的SPHERES，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局中子研究中心(NCNR)的高通量背散射譜儀(HFBS)，美國(guó)橡樹(shù)嶺國(guó)家實(shí)驗(yàn)室(ORNL)的BASIS，英國(guó)散裂中子源(ISIS)的IRIS，日本加速器研究中心(J-PARC)的DNA 等。背散射譜儀的數(shù)量在全球范圍內(nèi)仍顯得稀少，這使得其實(shí)驗(yàn)機(jī)時(shí)成為一種寶貴的研究資源。幸運(yùn)的是位于東莞的中國(guó)散裂中子源(CSNS)正在籌建中國(guó)第一臺(tái)中子背散射譜儀，這將大幅推動(dòng)國(guó)內(nèi)中子科學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。

圖2 EMU譜儀現(xiàn)場(chǎng)照片⑦

一、背散射譜儀的原理

中子準(zhǔn)彈性散射通過(guò)記錄中子被樣品散射前后的波矢變化(圖3)和能量轉(zhuǎn)移來(lái)獲得樣品的空間和運(yùn)動(dòng)信息。一般通過(guò)不同位置的3He探測(cè)器記錄散射前后中子出射方向相對(duì)入射方向的變化來(lái)獲得波矢轉(zhuǎn)移Q，而能量轉(zhuǎn)移通過(guò)記錄入射和出射的中子波長(zhǎng)來(lái)獲得。

圖3 波矢轉(zhuǎn)移示意圖

在脈沖中子源上大多使用飛行時(shí)間技術(shù)確定中子波長(zhǎng)，在反應(yīng)堆源上大多使用布拉格衍射(如下式)確定中子波長(zhǎng)

背散射譜儀高分辨率的實(shí)現(xiàn)利用了布拉格衍射束的波長(zhǎng)擴(kuò)散Δλ隨散射角2θ增大至180°而減小的事實(shí)，正如下式的布拉格定律的誤差傳遞公式所顯示的那樣⑧。

公式中d表示晶面間距。在背散射情況下，θ接近90°，散射角帶來(lái)的誤差接近于0，因而能量分辨率最高。包括HFBS，Emu 在內(nèi)的大多數(shù)背散射譜儀使用了曲面Si(111)晶體作為入射中子的單色器和出射中子的能量分析器，這樣可以實(shí)現(xiàn)小于1μeV的能量分辨率⑨。如果使用平面Si(111)晶體，可進(jìn)一步提高分辨率，但會(huì)犧牲通量并且導(dǎo)致分辨率譜線(xiàn)偏離高斯分布。在ILL的IN16B上也提供了GaAs作為進(jìn)一步提高分辨率的選項(xiàng)⑩。

圖4以NCNR的HFBS譜儀為例展示了背散射譜儀的原理。經(jīng)過(guò)多普勒單色器的能量為E=E0+ΔE的入射中子被樣品散射后，垂直入射到分布于球形空間的單晶分析陣列，根據(jù)布拉格定律只有能量為的中子被分析晶體反射，其余能量的中子穿過(guò)分析器被后方的吸收材料吸收。被分析器反射后的中子被樣品附近的探測(cè)器收集到。由此可以測(cè)得中子能量轉(zhuǎn)移為ΔE，散射矢量Q可以由入射波長(zhǎng)和散射角度算出。由背散射譜儀的工作原理可知，背散射譜儀在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)只能探測(cè)一個(gè)能量轉(zhuǎn)移的信號(hào)。為了得到能量轉(zhuǎn)移譜，需要隨時(shí)間改變?nèi)肷渲凶拥哪芰浚诜磻?yīng)堆源上這項(xiàng)工作由多普勒單色器完成。多普勒單色器使用與分析器相同的單晶，在靜止條件下，分析器反射的中子能量為E0，此時(shí)得到的是彈性散射信號(hào)。通過(guò)改變晶體溫度以改變晶面間距d或是將多普勒單色器沿束流方向做周期性機(jī)械運(yùn)動(dòng)，可以調(diào)制反射中子的能量為E=E0+ΔE。背散射譜儀探測(cè)能量覆蓋的范圍±ΔEmax取決于多普勒單色器可以提供的移動(dòng)速度或溫度范圍⑦。

圖4 背散射譜儀HFBS原理示意圖?

在散裂中子源上，由于束流本身帶有能量展寬的脈沖信號(hào)，可用長(zhǎng)導(dǎo)管分離不同速度的中子并通過(guò)飛行時(shí)間計(jì)算出能量。由于調(diào)制入射中子能量方式的差異，通常飛行時(shí)間中子背散射譜儀(TOF-NBS)會(huì)有更大的測(cè)量能量范圍?。圖5 展示了英國(guó)散裂中子源上的TOF-NBS譜儀IRIS的布局示意圖。

圖5 英國(guó)散裂中子源上的TOF-NBS譜儀IRIS的布局示意圖?

二、數(shù)據(jù)分析原理

(1)能域分析：

中子背散射譜儀得到的信號(hào)是中子計(jì)數(shù)關(guān)于能量轉(zhuǎn)移ΔE和散射矢量Q的函數(shù)，通過(guò)空樣品皿矯正、探測(cè)器效率矯正、對(duì)Q和ΔE按需求重新分組(rebin)、歸一化等步驟，可以獲得動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子S(Q，ω)，其中ω與能量轉(zhuǎn)移ΔE的關(guān)系為ΔE=?ω。動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子包含了樣品的空間約束和動(dòng)力學(xué)在內(nèi)的信息?。背散射譜儀的能量分辨率在μeV 量級(jí)，能量轉(zhuǎn)移的范圍可從μeV到meV，對(duì)應(yīng)的時(shí)間尺度為皮秒到納秒，這個(gè)尺度主要觀測(cè)的是蛋白質(zhì)的局部弛豫運(yùn)動(dòng)，例如蛋白質(zhì)主鏈和側(cè)鏈的擴(kuò)散和旋轉(zhuǎn)，這些運(yùn)動(dòng)信息是蛋白質(zhì)的固有特征，與蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)息息相關(guān)。

為了深入分析動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子中的信息，通常的處理方法是將S(Q，ω)拆分成兩部分的貢獻(xiàn)：

其中A(Q)被稱(chēng)為彈性非相干結(jié)構(gòu)因子(EISF)，提供了實(shí)驗(yàn)觀測(cè)的時(shí)間窗口內(nèi)原子所受空間約束的信息。這些原子不與中子發(fā)生能量交換或其運(yùn)動(dòng)不在時(shí)間觀測(cè)窗口內(nèi)，因此反映在動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子中的貢獻(xiàn)是一個(gè)代表彈性散射的δ函數(shù)。由于背散射能譜觀測(cè)到的主要是氫的非相干信號(hào)，因此描述EISF 的模型通?？紤]了一個(gè)原子在特定約束條件下的運(yùn)動(dòng)，比如在無(wú)法穿透的球殼中的自由擴(kuò)散，拋物線(xiàn)勢(shì)，在圓上的特定位點(diǎn)的跳躍等。L(Γ，ω)包含了時(shí)間窗口內(nèi)所有運(yùn)動(dòng)原子的信息，通?？梢杂靡粋€(gè)或多個(gè)洛倫茲函數(shù)來(lái)描述。洛倫茲函數(shù)的半高半寬(HWHM)Γ(Q)稱(chēng)為有效弛豫常數(shù)。在原子做最簡(jiǎn)單的菲克擴(kuò)散的情況下，有Γ∝Q2。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中的原子處在一個(gè)復(fù)雜的能量景觀下，Γ的形式也會(huì)發(fā)生顯著的變化，為此有許多模型被提出，包括跳躍擴(kuò)散模型?，在高斯勢(shì)阱中的擴(kuò)散模型?，拉伸指數(shù)衰減模型KWW函數(shù)?等。

(2)時(shí)域分析：

將動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子S(Q，ω)作ω →t的傅里葉變換到時(shí)域(圖6)，可以獲得中間散射函數(shù)(Intermediate scattering function，ISF)F(Q，t)，ISF 是一種密度-密度關(guān)聯(lián)函數(shù)，它的物理含義表示了氫原子在t時(shí)刻的位置與它自身在0時(shí)刻的位置的關(guān)聯(lián)性。這一函數(shù)為研究者揭示蛋白質(zhì)分子弛豫動(dòng)力學(xué)提供了重要工具。值得一提的是，中間散射函數(shù)可以通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬直接獲得，這使得背散射譜儀的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以方便地與模擬結(jié)果聯(lián)系起來(lái)。

圖6 飛行時(shí)間中子背散射(TOF-NBS)譜儀BASIS上測(cè)得的能域數(shù)據(jù)(a)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)因子S(Q，ω)可以通過(guò)傅里葉變換轉(zhuǎn)換成時(shí)域中的中間散射函數(shù)ISF(b)?

在時(shí)域分析中也有一系列模型被提出。由于蛋白質(zhì)和玻璃形成液體在許多方面有著共同的動(dòng)力學(xué)行為，因此可以借用描述液體的模態(tài)耦合理論?(Mode-Coupling Theory，MCT)來(lái)描述蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)行為，這種方法已經(jīng)在多項(xiàng)研究中被證明有效?-?。按照MCT理論，ISF可以用以下漸進(jìn)式擬合：

其中τβ和τα分別是β和α弛豫的特征時(shí)間，分別對(duì)應(yīng)了蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)過(guò)程中的局域運(yùn)動(dòng)和結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng)，中子背散射譜儀的時(shí)間觀測(cè)尺度(ps-ns)通常比α弛豫的時(shí)間尺度(μs－ms)短得多，因此α弛豫項(xiàng)近似為1。從MCT 模型中得到的弛豫時(shí)間是描述蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)，可以幫助我們理解蛋白質(zhì)的作用機(jī)理。

(3)均方位移(MSD)：

在不依賴(lài)模型的分析方法中，利用背散射譜儀的彈性?huà)呙枘Ｊ綄?duì)全體原子均方位移(MSD)進(jìn)行測(cè)量也可以提供關(guān)于內(nèi)部結(jié)構(gòu)所受空間約束的信息。均方位移記錄了蛋白質(zhì)中原子在一段時(shí)間的運(yùn)動(dòng)后偏離初始位置的程度，由于中子準(zhǔn)彈性散射觀測(cè)蛋白質(zhì)主要得到的是氫的非相干信號(hào)，因此實(shí)驗(yàn)所得的MSD代表了所有氫原子運(yùn)動(dòng)距離平方的平均。MSD 可以從德拜沃倫因子(Debye-Waller factor)計(jì)算得出，德拜沃倫因子的表達(dá)式為

實(shí)驗(yàn)中德拜沃倫因子可以通過(guò)計(jì)算彈性散射強(qiáng)度Iel(Q，T，ω=0)和它在低溫極限下的值Iel(Q，T=0，ω=0)的比獲得。

作ln(SH(Q，ω=0))vs.Q2圖，對(duì)小Q部分線(xiàn)性擬合所得的斜率即MSD，只取小Q部分?jǐn)M合是因?yàn)榈掳菸謧愐蜃拥耐茖?dǎo)中含有高斯近似，高斯近似只在小Q范圍內(nèi)成立?。

MSD在生物學(xué)中又稱(chēng)為B因子，可以表征蛋白質(zhì)的不同部分的相對(duì)振動(dòng)?。盡管MSD 得到的信息是平均的，無(wú)法得到底層的動(dòng)力學(xué)信息，但可以借此表征蛋白質(zhì)整體的“柔軟程度”?。MSD提供了一種模型無(wú)關(guān)的監(jiān)測(cè)變化的手段，允許我們實(shí)時(shí)，快速地測(cè)量升溫和降溫過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)信息。這一點(diǎn)彌補(bǔ)了準(zhǔn)彈性散射達(dá)到統(tǒng)計(jì)質(zhì)量的數(shù)據(jù)所需的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的缺陷，為我們提供了一種有力的研究手段。

三、應(yīng)用舉例

隨著中子背散射譜儀在蛋白質(zhì)研究中的強(qiáng)大功能被越來(lái)越多的研究者認(rèn)識(shí)到，近年來(lái)依托背散射譜儀的研究工作在該領(lǐng)域產(chǎn)生了一大批有價(jià)值的研究成果。以下對(duì)幾個(gè)具有前景和參考價(jià)值的工作做些簡(jiǎn)要介紹。

儲(chǔ)祥薔研究組研究了一種來(lái)自深海嗜熱菌的寡聚蛋白?。在NCNR的高通量背散射譜儀(HFBS)和飛行時(shí)間譜儀(DCS)上，他們利用準(zhǔn)彈性中子散射技術(shù)研究了目標(biāo)蛋白在100 ps～2 ns時(shí)間尺度上的弛豫動(dòng)力學(xué)。結(jié)果揭示：該嗜熱蛋白相比于作為對(duì)照物的嗜溫蛋白溶菌酶在高壓條件下具有更好的結(jié)構(gòu)靈活性和快得多的弛豫運(yùn)動(dòng)。這一結(jié)果歸因于嗜熱蛋白的高度對(duì)稱(chēng)和封閉的寡聚結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致高壓條件下嗜熱蛋白的能量景觀的扭曲效應(yīng)與嗜溫蛋白顯著不同(圖7)。這項(xiàng)工作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，相關(guān)研究發(fā)表在2015年的PNAS上。

圖7 嗜熱蛋白(IPPase)和嗜溫蛋白(HEWL)變性相圖及能量景觀示意圖?

法國(guó)的Giorgio Schiro 研究小組利用中子準(zhǔn)彈性散射研究了結(jié)合水的平移擴(kuò)散與本質(zhì)無(wú)序蛋白功能實(shí)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性?。結(jié)合水和蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)的關(guān)聯(lián)性已經(jīng)多次被發(fā)現(xiàn)，理解表面結(jié)合水的生物效應(yīng)對(duì)深入刻畫(huà)蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)過(guò)程具有重大意義④。這項(xiàng)工作利用中子散射實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)，研究蛋白質(zhì)和結(jié)合水聯(lián)系中的重要因素氫鍵，實(shí)驗(yàn)是在德國(guó)JSNC 的背散射譜儀SPHERES上完成的。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合水的平動(dòng)成分在240K附近的蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)轉(zhuǎn)變溫度處明顯增加，提出了蛋白質(zhì)表面結(jié)合水的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)功能所需的大振幅運(yùn)動(dòng)的觀點(diǎn)。

2019 年日本的Fujiwara 等在日本加速器研究中心(J-PARC)的材料與生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)施(MLF)的飛行時(shí)間背散射譜儀DNA 上?結(jié)合準(zhǔn)彈性中子散射和小角X 光散射(SAXS)研究了一種可以合成淀粉狀纖維的無(wú)定型蛋白αSyn。αSyn 合成的淀粉狀纖維被認(rèn)為與帕金森病和其他細(xì)胞核病有關(guān)，因此對(duì)αSyn 機(jī)制的研究對(duì)于闡明這些疾病的發(fā)病機(jī)制有重大的意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，αSyn纖維的形成不僅需要局域運(yùn)動(dòng)，而且還需要N、C 端的鏈運(yùn)動(dòng)，使中心NAC結(jié)構(gòu)域暴露。這一研究給開(kāi)發(fā)治療帕金森病的新型藥物帶來(lái)了靈感，不同于此前以NAC區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)的思路，可以選擇蛋白質(zhì)N端和C端作為藥物靶點(diǎn)，通過(guò)抑制鏈端運(yùn)動(dòng)來(lái)阻止淀粉狀纖維的合成。

四、總結(jié)與展望

近年來(lái)，中子背散射譜儀的設(shè)計(jì)、配套軟件以及分析理論都得到進(jìn)一步的發(fā)展，使得準(zhǔn)彈性中子散射實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以惠及更多科研工作者。中子背散射對(duì)氫原子敏感、其觀測(cè)尺度與蛋白質(zhì)局部弛豫相匹配、又具有無(wú)損原位觀測(cè)的能力，這些特點(diǎn)使得中子背散射技術(shù)在蛋白質(zhì)研究上具有其他實(shí)驗(yàn)手段不具備的突出優(yōu)勢(shì)。中國(guó)的第一臺(tái)中子背散射譜儀作為散裂中子源二期工程的一部分已列入國(guó)家十四五規(guī)劃，有望在2025 年建成。可以預(yù)見(jiàn)CSNS的中子背散射譜儀將驅(qū)動(dòng)我國(guó)相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)入快車(chē)道。利用中子背散射譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)相關(guān)的研究，預(yù)期在以下幾個(gè)方向?qū)⑷〉弥匾M(jìn)展：(1)中子準(zhǔn)彈性散射技術(shù)和氘代技術(shù)結(jié)合研究蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，例如藥物分子的定向投放酶?，與底物的特異性結(jié)合等；(2)蛋白質(zhì)表面結(jié)合水動(dòng)態(tài)過(guò)程與功能的關(guān)聯(lián)性研究；(3)中子背散射譜儀與自旋回波、飛行時(shí)間譜儀結(jié)合研究蛋白質(zhì)全時(shí)間尺度的動(dòng)態(tài)過(guò)程，有助于闡述蛋白質(zhì)的工作機(jī)理。