馮 坤，孫 聰，梁少華

河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

人乳脂肪是新生兒發(fā)育的主要能量來源，對嬰幼兒的生長起促進作用。在母乳中，脂肪以乳脂肪球(MFG)的形式穩(wěn)定存在，其核心為甘油三酯(TAG，約占總脂質的98%)[1]，外部由具有三層結構的薄膜包被，是一種主要由極性物質(如磷脂和蛋白質)組成的具有特殊功能的天然膜，被稱為乳脂肪球膜(MFGM)[2]。MFGM作為一種油水界面物質，能夠參與脂肪的消化、吸收和代謝過程[3]，有助于嬰兒認知和免疫功能的提高[4]，對生長發(fā)育至關重要。

嬰兒配方奶粉作為母乳的替代品，其發(fā)展趨勢是全面模擬人乳脂的組成、結構和營養(yǎng)特性，與人乳脂相似至關重要[5]。目前，市售嬰兒配方奶粉多采用植物油復合調配，依靠酪蛋白、乳清蛋白或卵磷脂等乳化劑，經(jīng)過熱處理、均質等一系列加工過程，形成粒徑較小(0.3～0.8 μm)的脂滴，表面主要由酪蛋白和乳清蛋白覆蓋。研究表明，盡管嬰兒配方奶粉中的脂滴具有更小的脂肪顆粒，但母乳中的脂肪更容易被水解[6]。這種與母乳MFGM組成的差異影響了脂肪在嬰兒胃腸道的消化代謝[7]。研究表明，MFGM中的極性脂組分可通過靜電相互作用促進脂肪酶的定向和吸附，從而促進嬰兒對人乳脂的高效消化[8]。

近些年來，人們致力于研究影響嬰兒消化的因素，大多集中于甘油三酯(TAG)結構及脂肪球粒徑等。Fave等[9]發(fā)現(xiàn)不同TAG結構影響脂質消化后產(chǎn)物的釋放和吸收，TAG結構對脂質消化的影響主要取決于其作用機制；Garcia等[10]發(fā)現(xiàn)小粒徑(1.7 μm)天然脂肪球在消化時的水解率約為大脂肪球(6.6 μm)的2倍，原因是小脂肪球的表面積更大，增大了酶的接觸面積?，F(xiàn)有的研究極少關注脂滴界面組分在消化過程中發(fā)揮的積極作用。

為了探究脂滴的界面組成對嬰兒消化的影響，作者以牛乳來源的酪乳粉為原料，提取并濃縮得到乳極性脂(MPL)，分別以MPL和酪蛋白酸鈉(CN)為乳化劑構建不同界面組成的脂滴，采用嬰兒胃腸道體外消化模型，分析消化過程中乳脂消化速率和消化產(chǎn)物的變化，為開發(fā)具有極性脂界面的脂滴提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

酪乳粉：新西蘭恒天然有限公司；INFAT?嬰兒專用油脂(OPO：21.21%；C16∶ 0：20.45%；C18∶ 1：36.67%；C18∶ 2：23.28%)：浙江杭州貝因美有限公司。

酪蛋白酸鈉(CN)、氘代氯仿(CDCl3)、磷酸三苯酯(TPP)：上海麥克林生化試劑有限公司；米根酶脂肪酶(500 U/mg)、胃蛋白酶(695 U/mg)、胰液素：上海西格瑪奧德里齊貿(mào)易有限公司；牛膽鹽(膽酸≥70%):北京索萊寶科技有限公司；氯仿、甲醇、丙酮、乙醚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na+)等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890A氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；AVANCE Ⅲ HD 500 M 超導核磁共振波譜儀(NMR)：瑞士Bruker公司；Marvern Z90激光粒度電位測定儀、Mastersizer 3000 激光粒度儀：英國馬爾文儀器有限公司；ULTRA-TURRAX T10高速剪切乳化機、恒溫磁力加熱攪拌器：德國IKA公司；LD5-10臺式低速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酪乳粉中脂肪的提取

取4.5 g酪乳粉于燒杯中，加入30 mL 45 ℃水(煮沸后冷卻),完全溶解，采用氯仿-甲醇法提取酪乳粉中的脂肪[11]。

1.3.2 乳極性脂的濃縮

采用丙酮萃取法進一步濃縮所提取脂肪中的乳極性脂：向脂肪中加入10倍體積的丙酮，充分攪拌后，放入4 ℃冰箱中過夜，靜置分層。取下層固體，經(jīng)旋轉蒸發(fā)、氮吹后得乳極性脂濃縮物，放入-20 ℃冰箱中儲存。

1.3.3 乳極性脂中磷脂的組成及含量測定

參考文獻[12]的方法制備所需溶劑。精確稱取約5 mg的TPP，溶于50 mL CDCl3中作為內標溶液；制備0.2 mol/L pH 7.0的EDTA-Na+溶液，用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至7.0。

樣品處理：稱取濃縮后的乳極性脂樣品200 mg于15 mL離心管中，依次加入0.5 mL 甲醇、0.5 mL 0.2 mol/L EDTA-Na+溶液和0.5 mL 含有TPP的CDCl3溶液，充分混合至所有樣品溶解后離心(4 000 r/min，5 min)，吸取500 μL下層清液至核磁管中進行分析。核磁共振的參數(shù)設置參照文獻[13]的方法。

1.3.4 乳液的制備

乳液由水相和油相(INFAT?嬰兒專用油脂)組成。將乳化劑(CN、MPL)均勻分散在磷酸鹽緩沖液中，充分攪拌溶解后，放入4 ℃冰箱中過夜。將油相以8%(質量比)與水相混合后，使用高速剪切乳化機在9 000 r/min下預混3 min，然后以26 000 r/min剪切3 min，分別制備以蛋白、MPL包被的脂滴(CN組、MPL組)。

1.3.5 粒徑和電位的測定

樣品稀釋100倍后采用激光粒度儀在25 ℃測定粒徑；樣品稀釋10倍后采用激光粒度電位儀進行電位的測定。

1.3.6 體外消化模型的建立

基于文獻[14]的方法，稍做修改，建立嬰兒胃腸道體外消化模型。

模擬胃液的配制：在100 mL去離子水中加入NaCl(2 g/L)和鹽酸(7 g/L)，調節(jié)pH值為5.5。加入胃蛋白酶和米根酶脂肪酶，使其在體系中的終質量濃度為0.4 mg/mL和0.886 7 mg/mL。

模擬腸液的配制：在100 mL磷酸緩沖液中加入NaCl(26.32 g/L)，調節(jié)pH值為6.5。加入胰液素和膽鹽，使其在體系中的終質量濃度為1.6 mg/mL和1.25 mg/mL。

1.3.7 模擬體外消化

胃消化階段：取配制的胃液30 mL與60 mL乳液混合，置于250 mL三頸燒瓶中，迅速調節(jié)體系pH值 為5.5，于37 ℃反應1 h。采用 0.1 mol/L NaOH溶液使混合體系的pH值保持恒定，記錄不同時間消耗NaOH的量，定期取出一部分樣品，并立即加入0.1 mol/L的HCl溶液滅酶，以備后續(xù)分析。

腸消化階段：取經(jīng)胃消化后的樣品40 mL與40 mL腸液混合，置于250 mL三頸燒瓶中，迅速調節(jié)體系pH值為6.5，于37 ℃反應2 h。添加0.1 mol/L NaOH 使混合體系的pH值保持恒定，記錄不同時間消耗NaOH的量，定期取樣后立即加入0.1 mol/L的HCl溶液滅酶，以備后續(xù)分析。

1.3.8 體外消化過程的表征

1.3.8.1 游離脂肪酸釋放量的測定

根據(jù)消化過程中NaOH的消耗量測定樣品中脂肪酸的釋放量。

FFA=V×c×1 000，

式中：FFA為消化過程中游離脂肪酸釋放量，μmol；V為消耗NaOH 的體積，mL；c為NaOH 溶液的濃度，mol/L。

1.3.8.2 粒徑和電位的測定

消化過程中粒徑和電位的測定同1.3.5。

1.3.8.3 脂質組成的分析

乳液消化產(chǎn)物中的脂肪采用氯仿-甲醇法進行提?。喝∠蟮?0 mL樣品，加入30 mL氯仿/甲醇溶液(1∶ 2，V/V)，超聲提取5 min后，加入10 mL氯仿攪拌約1 min，最后再加入10 mL蒸餾水攪拌后靜置20 min。收集靜置后的有機相，用旋轉蒸發(fā)儀去除溶劑，旋蒸后的樣品經(jīng)氮吹后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

甘油酯組成分析：正己烷溶解提取出的脂質，進氣相色譜分析。采用Agilent DB-1HT 色譜柱(30.0 m×250 μm×0.1 μm )，進樣口溫度350 ℃，氫火焰離子化檢測器溫度400 ℃，載氣為氮氣，流速15.0 mL/min，分流比5.0。初始溫度100 ℃，保留1 min；50 ℃/min 升溫至220 ℃，保留2 min；15 ℃/min升溫至290 ℃，保留2 min；40 ℃/min升溫至320 ℃，保留6 min；20 ℃/min升溫至360 ℃，保留16 min。

脂肪酸組成分析：分離后的游離脂肪酸(FFA)采用三氟化硼-甲醇法進行甲酯化處理，分離后的單甘酯(MAG)采用簡易甲酯化方法進行處理。采用氣相色譜儀分析脂肪酸組成：SGC BXP-70毛細管柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，氫火焰離子化檢測器溫度260 ℃，載氣為氮氣，流速1.0 mL/min，分流比1∶50。初始溫度170 ℃，以2 ℃/min升溫至210 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018軟件制圖。

2 結果與討論

2.1 乳極性脂中磷脂的組成與含量

表1為酪乳粉總脂和濃縮乳極性脂中3種主要磷脂組分的含量，酪乳粉中鞘磷脂(SM)含量較高，與文獻[15]結果相一致。經(jīng)丙酮濃縮后，磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰膽堿(PC)、SM含量均有增加，總含量達30.5%，結合文獻[10,16-17]可知，此樣品可作為具有乳極性脂界面脂滴的原料。

表1 酪乳粉總脂及濃縮乳極性脂中主要 磷脂組分含量Table 1 Main phospholipid components in total fat of buttermilk powder and concentrated milk polar fat %

2.2 乳液的初始粒徑

表2是以CN和MPL為乳化劑制備脂滴的平均粒徑D[4,3]、D[3,2]和比表面積。脂滴的粒徑是影響嬰兒消化的關鍵因素之一[18]，因此，本研究所制備的脂滴的粒徑較為相近，以CN和MPL為界面的脂滴平均粒徑D[4,3]分別為10.1 μm和10.4 μm，D[3,2]分別為3.72 μm和3.57 μm。

表2 脂滴的初始粒徑及比表面積Table 2 Initial particle size and specific surface area of the lipid droplets

2.3 消化過程表征

2.3.1 消化過程中粒徑的變化

通過模擬嬰兒腸胃道消化環(huán)境，對兩種具有不同界面組成的脂滴進行體外消化，消化過程中D[3,2]的變化如圖1所示。

圖1 消化過程中脂滴D[3,2]的變化Fig.1 Changes in D[3,2] of lipid droplets during digestion

由圖1可知，在胃消化初期(20 min)，兩種脂滴的平均粒徑均有所增大，這是由于在胃蛋白酶和胃脂酶的共同作用下，脂肪球發(fā)生聚集，粒徑變大，同時脂解反應釋放出的游離脂肪酸附著在脂滴表面使聚集加劇。在模擬胃液消化過程中，隨著反應的進行，兩組脂滴的平均粒徑均呈增大趨勢，其中MPL組脂滴的平均粒徑均大于CN組脂滴。在模擬腸液消化過程中，隨著pH值的回升及膽鹽的加入，聚集的脂滴重新分散。脂滴平均粒徑先減小后逐漸趨于平穩(wěn)，表明隨著反應的進行脂肪酶被消耗，脂滴表面的物質不再發(fā)生變化，平均粒徑趨于穩(wěn)定。圖2為兩種脂滴在胃、腸消化過程中的粒徑分布，與CN組相比，MPL組脂滴在胃消化過程中出現(xiàn)了較大的粒徑峰，這可能是因為由小分子磷脂形成的界面比其他乳化劑形成的界面涂層抗聚集能力差[19]。MPL組中的粒徑峰在腸消化過程中不斷減小，表明MPL組中的脂滴能夠更加持續(xù)、平穩(wěn)地進行消化。

2.3.2 消化過程中Zeta-電位的變化

圖3為CN組和MPL組脂滴在消化過程中Zeta-電位的變化，CN組和MPL組脂滴的初始電位(0 min)分別為-35.47、-57.08 mV，這種高強度的負電荷在液滴之間產(chǎn)生了較強的排斥力，從而阻止它們聚集。在整個消化過程中，MPL組脂滴的Zeta-電位絕對值始終大于CN組，其可能與MPL自身的化學基團有關，如磷酸基團、羧基基團和氨基基團[20]。胃消化初期，兩組乳液脂滴的Zeta-電位絕對值顯著降低，其脂滴表面的靜電斥力不足以穩(wěn)定分散，這也部分解釋了在胃消化時期由于脂滴聚集造成粒徑增大的現(xiàn)象。

在腸消化初期，兩組脂滴的Zeta-電位均呈現(xiàn)顯著增加的現(xiàn)象，這與文獻報道相一致[21-22]。當脂滴與模擬腸液混合后，膽鹽會置換脂滴原有的界面，造成電位的增加。此外，脂肪酶不斷吸附在脂滴表面并水解TAG，形成的水解產(chǎn)物(如FFA和MAG)在界面的積累，也會造成表面電荷的增加[23]。MPL組脂滴的Zeta-電位絕對值始終高于CN組，表明以MPL為界面的脂滴在腸消化過程中脂滴之間的靜電斥力較強，有利于消化反應的進行。

圖2 脂滴在消化過程中的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of lipid droplets during gastric and intestinal digestion

圖3 脂滴在消化過程中的Zeta-電位Fig.3 Zeta-potential of lipid droplets during digestion

2.3.3 游離脂肪酸的釋放動力學

圖4為兩種脂滴嬰兒體外胃腸道消化過程中的脂肪酸釋放量。在胃消化過程中，相較于CN組，MPL組脂滴釋放更多的脂肪酸。在消化初期(0～10 min)，脂肪酸釋放速率較快，因為消化初期的底物濃度較大，與脂肪酶充分接觸。隨著反應的進行，脂肪酸釋放率降低，表明隨著反應的進行，脂肪酶逐漸被消耗，降低了脂解速率[11]。消化30 min后，MPL組脂滴表現(xiàn)出較高的脂肪酸釋放速率及釋放量，表明以MPL為界面組分的脂滴具有更好的消化特性。

圖4 脂滴在消化過程中的脂肪酸釋放量Fig.4 Fatty acid release amount of lipid droplets during digestion

由圖4可知，在腸消化初期，CN組與MPL組脂滴均表現(xiàn)出較高的脂肪酸釋放速率，這是由于反應初期底物濃度較高，并且膽鹽具有較高的表面活性，脂肪酶被迅速吸附到界面進行水解。此外，膽鹽的存在可以有效清除胃消化結束時附著在脂滴表面的脂解產(chǎn)物，從而增加脂肪酶與脂滴接觸的表面積。當進入腸消化初期(60～70 min)時，CN組脂滴的消化速率高于MPL組。在消化80 min后，MPL組具有較高的脂肪酸釋放率，這可能是由于胰液素是一種混合消化酶，其含有的磷脂酶和膽鹽對磷脂的水解具有協(xié)同作用[24]，從而使TAG核心更快地暴露在界面，增加酶與底物的接觸面積。隨著反應的進行，兩種脂滴的釋放趨勢逐漸平緩，這是由于反應不斷消耗脂肪酶和不斷釋放FFA、MAG和甘油二酯(DAG)等活性物質，其吸附在脂滴表面會抑制反應的進行。MPL組脂滴的脂肪酸釋放量高于CN組，這一結果與Zeta-電位結果相一致。

2.3.4 消化過程中脂解產(chǎn)物的變化

圖5為消化過程中兩種脂滴的甘油酯組成。CN組和MPL組脂滴在胃消化過程中，TAG含量明顯降低，主要轉化為DAG和FFA，生成MAG的量較少，這可能是由于胃脂酶結合在脂滴表面時，更傾向于脂解TAG分子中sn-3位的脂肪酸[25]。在胃消化20 min時，F(xiàn)FA含量顯著增加，隨著反應的進行呈現(xiàn)緩步上升的趨勢。胃消化終點時，CN組和MPL組脂滴中TAG含量分別為22.58%和26.52%，表明胃蛋白酶在CN組脂滴消化過程中發(fā)揮了較大的作用。在腸消化初期(90 min)，TAG和DAG含量明顯下降，F(xiàn)FA含量急劇增加，表明在這個階段TAG和DAG的脂解反應同時進行，生成較多的FFA，這是因為胰脂酶對TAG和DAG的sn-1,3位均具有活性。在腸消化終點，CN組和MPL組脂滴的TAG含量分別為11.22%和8.15%，與之前FFA釋放量結果一致。

圖5 兩種脂滴在消化過程中的甘油酯組成Fig.5 Glyceride composition of two lipid droplets during digestion

2.3.5 消化過程中脂肪酸組成的變化

圖6為兩種脂滴在胃、腸消化終點時所釋放的游離脂肪酸組成。在胃消化終點，CN組和MPL組脂滴釋放的主要脂肪酸為油酸、亞油酸和棕櫚酸，占總脂肪酸的70%以上。其中，油酸含量在CN組和MPL組分別達到40.19%和39.67%，這與所選油相為OPO型專用油脂有關。此外，還有一定的辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸以及亞麻酸釋放。在脂肪酸釋放種類上，CN組與MPL組在胃消化過程中并無顯著差異。在腸消化終點，釋放的主要脂肪酸仍為油酸、亞油酸和棕櫚酸，但MPL組較CN組脂滴釋放較多的游離棕櫚酸。

圖6 胃、腸消化終點的游離脂肪酸組成Fig.6 Free fatty acid composition at the end of gastric and intestinal digestion

圖7為兩種脂滴在胃、腸消化終點時MAG的脂肪酸組成。CN組和MPL組在各階段消化終點釋放的MAG均為月桂酸、棕櫚酸、油酸和亞油酸MAG，其中飽和脂肪酸MAG的含量均低于不飽和脂肪酸MAG。在胃消化終點，CN組與MPL組脂滴釋放的MAG組成并無顯著性差異。在腸消化終點，兩組脂滴釋放的油酸MAG和亞油酸MAG含量降低，棕櫚酸MAG含量增加。CN組釋放了較多的棕櫚酸MAG，而MPL組釋放了較多的月桂酸MAG、油酸MAG和亞油酸MAG。從胃階段到腸階段，兩組脂滴均釋放了較多的飽和脂肪酸MAG，其中CN組脂滴的釋放量更多。

圖7 胃、腸消化終點的單甘酯脂肪酸組成Fig.7 Fatty acid composition of monoglycerides at the end of gastric and intestinal digestion

3 結論

本研究從酪乳粉中提取并濃縮制得MPL，以MPL和CN為乳化劑制備了具有不同界面組成的脂滴，研究了兩者的消化特性。結果表明，在粒徑相近的基礎上，界面組分對脂滴的消化具有一定影響。在整個消化過程中，MPL組脂滴的FFA釋放量高于CN組，脂解程度較高，且MPL組在腸消化過程中的粒徑峰顯著下降，脂滴的脂解程度更高；MPL組脂滴的Zeta-電位處于較高水平，表明其消化過程中的穩(wěn)定程度較高。CN組在消化終點釋放了較多的棕櫚酸單甘酯，而MPL組則釋放了較多的游離棕櫚酸、油酸單甘酯和亞油酸單甘酯。總的來說，以MPL為界面的脂滴具有更好的消化特性，更適合嬰兒的消化。因此，在嬰兒配方奶粉的實際生產(chǎn)中，適當?shù)靥砑覯PL對嬰兒的消化是有益的。值得注意的是，由于體內消化的復雜性，體外消化很難完全模擬嬰兒體內真實的消化情況，因此，需要開發(fā)與體內消化更加相似的消化模型，進一步探究界面組分對嬰兒消化的影響。