楊棒棒，周 佳，屈建航，李春雨，羅 宇

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

天然多糖由10個以上單糖分子通過糖苷鍵連接而成，呈長鏈態(tài)、聚合狀，是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的碳水化合物[1]。多糖具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、促進細(xì)胞增殖[4]、抗輻射[5]、降血脂[6]、促進腸道菌群平衡和抑制炎癥[7-8]等生理功能，此外，也參與生物體細(xì)胞識別等一系列生命活動，組成動物或植物的細(xì)胞骨架，如纖維素和幾丁質(zhì)等[9]。目前，天然多糖主要來源于植物和微生物，微生物具有發(fā)酵條件易控、生長周期短、不受季節(jié)和蟲害影響等優(yōu)點，因此微生物多糖在生產(chǎn)、應(yīng)用等方面具有廣闊的前景[10]。

微生物多糖分為胞外多糖、胞內(nèi)多糖及結(jié)構(gòu)多糖[11]。胞外多糖(extracellular polysaccharides, EPS)是一些特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的一種高分子水溶性物質(zhì)，部分胞外多糖具有保濕和乳化的功能特性[12-13]。Sun等[14]發(fā)現(xiàn)Paenibacillussp.產(chǎn)的胞外多糖在相對濕度43%時，保濕率與透明質(zhì)酸相近，使其可能成為化妝品行業(yè)中較昂貴的透明質(zhì)酸的良好替代品。Zhao等[15]從PseudomonasfluorescensPGM37提取的胞外多糖其保濕性優(yōu)于甘油，略低于透明質(zhì)酸。范熠等[16]研究發(fā)現(xiàn)，菌株BacillusamyloliquefaciensLPL061發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對食用油乳化效果較好，乳化指數(shù)50%以上。Riaz Rajoka等[17]發(fā)現(xiàn)Lactobacillusrhamnosus產(chǎn)生的胞外多糖經(jīng)分離、純化后乳化活性為23%～45%。以上研究表明，部分天然微生物胞外多糖具有保濕和乳化特性，并且已經(jīng)引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。

微生物胞外多糖來源廣泛，具有不同的功能特性，但微生物多糖產(chǎn)量的提高和功能的探索，仍是當(dāng)前該研究領(lǐng)域的前提和關(guān)鍵。作者通過對實驗室自主分離、篩選和鑒定的細(xì)菌新種RufibactersediminisH-1的研究，發(fā)現(xiàn)該菌株可以產(chǎn)生胞外多糖，探究了該菌的最佳產(chǎn)糖條件、胞外多糖的保濕和乳化性能，以期為深化天然微生物多糖的認(rèn)識及應(yīng)用開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院環(huán)境微生物實驗室自主分離篩選和鑒定的細(xì)菌新種RufibactersediminisH-1T(= CGMCC 1.162 89T=NBRC 113030T)[18]，以下簡稱菌株H-1。

1.1.2 培養(yǎng)基

R2A培養(yǎng)基：酵母浸粉 0.50 g/L、胰蛋白胨 0.50 g/L、葡萄糖 0.50 g/L、酪蛋白水解物 0.50 g/L、可溶性淀粉 0.50 g/L、 K2HPO4·3H2O 0.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉 0.30 g/L，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉13.50 g/L，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 主要試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白、丙酮酸鈉、瓊脂粉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。5%苯酚：稱取5 g苯酚，蒸餾水定容至100 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；VS-840-2潔凈工作臺、BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋、BSD-YX2400智能精密搖床：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RCD-1A高速勻漿機：常州市億能實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株H-1的發(fā)酵培養(yǎng)

挑取菌株H-1新鮮菌落接種于R2A培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，用作種子液。將種子液以5%(V/V)的接種量繼續(xù)接入R2A培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)糖。

1.3.2 生長曲線和產(chǎn)糖曲線測定

參照文獻[19]的方法，分別在0、13、30、33、37、48、54、58、61、72、78、84 h取樣，在600 nm處測定吸光度，繪制生長曲線，同時取適量樣品，測定多糖產(chǎn)量并繪制產(chǎn)糖曲線。采用硫酸-苯酚法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 單因素試驗

以R2A培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(初始pH 7、裝液量100 mL/250 mL、接種量5%、溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、發(fā)酵時間54 h)，分別測定菌株H-1在不同碳源(蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、棉籽糖)、氮源(酵母浸粉、酪蛋白、胰蛋白胨、尿素、NaNO3)、初始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、接種量(1%、3%、5%、10%、15%)和不同發(fā)酵溫度(10、20、28、37、45 ℃)下的胞外多糖產(chǎn)量。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，篩選出對菌株H-1產(chǎn)胞外多糖影響顯著的因素作為自變量，通過Box-Behnken的中心組合設(shè)計進行響應(yīng)面試驗。

1.3.5 多糖的保濕性

分別稱取胞外多糖、甘油和透明質(zhì)酸0.20 g，加入5 g蒸餾水均勻濕潤，于干燥器中25 ℃恒溫放置，定時稱量樣品質(zhì)量，水分殘留率為放置后樣品中水分質(zhì)量與放置前樣品中水分質(zhì)量的比值[20]。

1.3.6 多糖的乳化性

將制備的胞外多糖配成5 g/L的溶液，吐溫80作為陽性對照，等量的疏水性底物(橄欖油、汽油、大豆油、菜籽油或二甲苯)與EPS以3∶ 2(V/V)混合，高速勻漿機劇烈旋轉(zhuǎn)2 min，室溫靜置12、24、36、48 h，乳化率為乳化層體積與總體積的比值[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗設(shè)置3組平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.0軟件作圖，SPSS 26對單因素試驗結(jié)果進行方差分析，Design Expert 11對響應(yīng)面試驗進行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及菌株生長、產(chǎn)糖曲線

根據(jù)硫酸-苯酚法測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y=0.012 5x+0.011 4，R2=0.999 7。

如圖1所示，0～33 h 菌株H-1生長迅速，胞外多糖產(chǎn)量逐漸增加，33 h時生長量達到峰值，進入穩(wěn)定期，54 h時胞外多糖產(chǎn)量最高，為29.46 mg/L，之后多糖產(chǎn)量下降。菌株H-1最佳發(fā)酵產(chǎn)糖時間為54 h。

圖1 菌株H-1的生長與產(chǎn)糖曲線Fig.1 Growth and sugar production curve of strain H-1

2.2 單因素試驗

2.2.1 碳源對菌株H-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

碳源對菌株H-1胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖2。由圖2a可知，菌株H-1發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基中其他組分不變時，海藻糖與另外4種碳源的多糖產(chǎn)量差異顯著(P<0.05)，其胞外多糖產(chǎn)量最高，為47.43 mg/L；由圖2b可知，隨著海藻糖質(zhì)量濃度的增大，胞外多糖產(chǎn)量先升高再下降，當(dāng)海藻糖質(zhì)量濃度為2 g/L時，胞外多糖產(chǎn)量為123.49 mg/L，與其他組差異顯著(P<0.05)。碳源對菌株生物量及胞外多糖產(chǎn)量具有顯著影響，與以往報道相似[22]。耿曉琦等[23]對透明顫菌研究發(fā)現(xiàn)，以海藻糖為碳源時，胞外多糖產(chǎn)量為180 mg/L。蔡靜靜[24]研究菌株BF66-16的胞外多糖，發(fā)現(xiàn)糖產(chǎn)量隨蔗糖質(zhì)量濃度增大先升高再下降，與本研究中海藻糖質(zhì)量濃度對胞外多糖產(chǎn)量的影響趨勢相似。

2.2.2 氮源對菌株H-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

氮源對菌株H-1胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖3。由圖3a可知，酵母浸粉與其他氮源的多糖產(chǎn)量差異顯著(P<0.05)，以酵母浸粉為初始氮源時，多糖產(chǎn)量最高，為35.25 mg/L；如圖3b所示，當(dāng)酵母浸粉質(zhì)量濃度偏低時，H-1多糖產(chǎn)量相對較低，酵母浸粉質(zhì)量濃度過高，會對產(chǎn)糖產(chǎn)生負(fù)面影響，因此，菌株H-1最適產(chǎn)糖的氮源質(zhì)量濃度為1.50 g/L，此時多糖產(chǎn)量為39.80 mg/L。酵母浸粉質(zhì)量濃度對菌株H-1產(chǎn)糖的影響規(guī)律在內(nèi)生真菌鏈格孢屬中也有報道[25]。與無機氮源相比，有機氮源更有利于菌株的產(chǎn)糖發(fā)酵，在無機氮源中，“N·O”類最不易被利用，供能后生成的硝態(tài)氮對菌株有一定毒害作用，會對菌株的生物量和胞外多糖產(chǎn)量產(chǎn)生抑制作用[26]。

圖2 碳源對菌株H-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of carbon sources on the yield of EPS of strain H-1

圖3 氮源對菌株H-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on the yield of EPS of strain H-1

圖4 溫度、pH值和接種量對菌株H-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of temperature, pH value and amount of inoculation on the yield of EPS of strain H-1

2.2.3 溫度、pH值、接種量對菌株H-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

溫度、pH值、接種量對菌株H-1胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖4。菌株H-1產(chǎn)胞外多糖的最佳溫度為28 ℃，相應(yīng)多糖產(chǎn)量為30.13 mg/L(圖4a)；最適pH為7.0，相應(yīng)多糖產(chǎn)量為29.59 mg/L(圖4b)；最適接種量為10%，相應(yīng)多糖產(chǎn)量為30.37 mg/L(圖4c)。培養(yǎng)溫度較低時，細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)速率下降，導(dǎo)致菌體生長代謝緩慢；培養(yǎng)溫度過高，細(xì)胞內(nèi)酶活性受到抑制，使代謝產(chǎn)生的多糖含量降低[27]。初始pH值能夠促使細(xì)胞膜功能改變，使細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，改變細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，從而影響細(xì)胞代謝產(chǎn)物的分泌[28]。唐少軍等[29]對粗毛纖孔菌在不同pH值下培養(yǎng)，當(dāng)初始pH值為6.50時，多糖產(chǎn)量達到1.12 g/L。不同接種量也會對多糖產(chǎn)量產(chǎn)生影響[30]，當(dāng)接種量為4%時，L.plantarumLPC-1 胞外多糖產(chǎn)量最高達到1.67 g/L。

2.3 方差分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過方差分析確定各因素對H-1胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見表1。酵母浸粉質(zhì)量濃度、海藻糖質(zhì)量濃度、接種量、溫度均對菌株H-1產(chǎn)胞外多糖量有極顯著影響。

表1 方差分析Table 1 Analysis of variance

2.4 響應(yīng)面試驗

氮源一般不提供能源，供能后生成的硝態(tài)氮對菌株有一定毒害作用，氮源質(zhì)量濃度過高會抑制胞外多糖的產(chǎn)生，因此最終選取海藻糖質(zhì)量濃度、溫度、接種量進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗。因素與水平見表2，試驗結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels in response surface methodology

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

2.5 響應(yīng)面分析

2.6 驗證試驗

通過響應(yīng)面分析并結(jié)合實際操作，確定H-1菌的最佳產(chǎn)糖條件：發(fā)酵溫度27.5 ℃，接種量8.5%，海藻糖質(zhì)量濃度2.6 g/L，其他條件為酵母浸粉質(zhì)量濃度1.50 g/L、pH 7.0，發(fā)酵時間54 h，預(yù)測多糖產(chǎn)量為138.46 mg/L。該條件下，經(jīng)驗證試驗測得胞外多糖產(chǎn)量為140.49 mg/L。

2.7 多糖的保濕性

由圖5可知，H-1菌株所產(chǎn)的胞外多糖具有良好的保濕率，在24 h內(nèi)保濕率接近甘油和透明質(zhì)酸，48 h時該多糖保濕率仍為82%，而甘油保濕率為83%，透明質(zhì)酸保濕率為80%；隨著時間推移，三者保濕率均逐漸減小，最后趨于穩(wěn)定。

2.8 多糖的乳化性

菌株H-1胞外多糖的乳化性如表5所示，在室溫48 h時，菌株H-1胞外多糖對橄欖油、汽油、大豆油的乳化率分別為92.85%、97.43%和98.57%，均高于吐溫80的乳化率69.43%、67.43%和64.29%，但胞外多糖對二甲苯和菜籽油的乳化率分別為50.28%和34.28%，低于吐溫80的乳化率62.44%和69.43%。以上數(shù)據(jù)表明，胞外多糖對部分烴類和植物油具有乳化作用，但乳化率存在差異。據(jù)Niknezhad等[21]報道，菌株P(guān)antoeasp. BCCS 001 GH的胞外多糖對橄欖油和汽油的乳化率分別為57.80%和44.70%，弱于菌株H-1胞外多糖的乳化率。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for response surface model

圖5 菌株H-1胞外多糖的保濕性Fig.5 Moisturizing properties of EPS

表5 菌株 H-1胞外多糖(5 g/L)對不同類型植物油和烴類的乳化率Table 5 Emulsifying rate of EPS (5 g/L) of strain H-1 on different types of hydrocarbons and vegetable oils %

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面試驗，獲得了菌株RufibactersediminisH-1產(chǎn)胞外多糖的最佳條件，即海藻糖2.6 g/L、酵母浸粉1.50 g/L、K2HPO4·3H2O 0.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉0.30 g/L、pH 7.0、發(fā)酵溫度27.5 ℃、接種量8.5%，在此條件下，胞外多糖的產(chǎn)量進一步提高，為后續(xù)菌株H-1發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的應(yīng)用提供了的依據(jù)。菌株H-1的胞外多糖在水分保持和乳化方面具有一定的開發(fā)價值，但需關(guān)注該多糖的食品安全性。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合多糖的細(xì)胞試驗，探究該多糖的其他活性功能，將會為深化天然微生物多糖的認(rèn)識及應(yīng)用開發(fā)提供借鑒和參考。