張 新，潘 麗*，常振剛，郭曉引，李雪琴*

1.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001 2.河南金谷實業(yè)發(fā)展有限公司，河南 鄭州 450003

蝦青素是一種廣泛存在于自然界中的天然類胡蘿卜素，具有抗炎[1]、抗氧化[2]以及增強免疫力[3]等多種生理功能，但其具有水溶性低、穩(wěn)定性差等[4]特點，故生物利用率不高，在實際應用中受到較多限制。為了提高蝦青素的水溶性、穩(wěn)定性以及生物利用率，研究者采用多種手段將其包埋，脂質體是常用的方法之一[5-6]。

脂質體是一種類似于細胞膜的閉合囊泡狀結構，對包埋的功能因子具有運轉、保護、靶向和緩釋等作用[7-8]。目前通常以膽固醇來穩(wěn)定脂質體膜[9-12]，但攝入過多的膽固醇會引起心腦血管疾病、動脈粥樣硬化等多種健康問題[13-14]。植物甾醇具有抗癌、抗炎以及降低膽固醇等多種生理功能，其結構與膽固醇相似，同樣可以對脂質體膜的穩(wěn)定性進行干預，研究發(fā)現以植物甾醇取代膽固醇構建的脂質體既可以避免膽固醇的負面效應，還能調控脂質體穩(wěn)定性[15-18]，但植物甾醇不溶于水，在油相中的溶解度也不高，不易被人體消化利用，而且熔點較高，從而限制了它的應用范圍[19]。植物甾醇酯是由植物甾醇和脂肪酸通過酯化反應制得，兼具植物甾醇和脂肪酸多重生理功效，并且脂溶性也得到了提高[20-21]。將植物甾醇酯代替膽固醇應用到負載脂溶性生物活性物質的脂質體構建中的研究尚未見報道。作者以大豆磷脂為主要膜材，運用薄膜-超聲法構建蝦青素-植物甾醇亞麻酸酯復合脂質體，優(yōu)化制備復合脂質體的最佳工藝條件，探討利用脂質體同時運載多種生物活性物質的可行性，為新型運載體系的研究開發(fā)提供技術手段和新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆磷脂(純度98%)：沈陽天峰生物制藥有限公司；蝦青素(純度98%)：上海研域商貿有限公司；植物甾醇亞麻酸酯(純度96%)：實驗室自制；三氯甲烷、石油醚(沸程30～60 ℃)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；吐溫80：化學純，天津市鼎盛鑫化工有限公司。

1.2 儀器與設備

AUY120電子分析天平：島津國際貿易(上海)有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；JY92-IIN超聲乳化分散器：寧波新芝生物科技股份有限公司；TG16-WS高速臺式離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合脂質體的制備

采用薄膜-超聲法[22]：稱取200 mg磷脂和一定量的植物甾醇亞麻酸酯、蝦青素，加三氯甲烷溶解。50 ℃避光旋蒸除去三氯甲烷，然后加入含有吐溫80的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行洗膜，使其形成脂質體混懸液，并于冰水浴中探針式超聲4 min(180 W，開5 s，關5 s)，得到蝦青素-植物甾醇亞麻酸酯復合脂質體。

1.3.2 蝦青素標準曲線的建立

準確稱取1.0 mg 蝦青素標準品，加三氯甲烷溶解并轉移至100 mL容量瓶中定容。用移液管分別移取1、2、3、4、5、6 mL蝦青素標準溶液并稀釋至25 mL，配制一系列梯度濃度的蝦青素溶液，在蝦青素溶液最大吸收波長(492 nm)處分別測定吸光度。以蝦青素濃度為x軸，吸光度為y軸繪制標準工作曲線，標準曲線方程為y=0.140 3x-0.000 9,R2=0.999 9。

1.3.3 蝦青素包封率的測定

準確移取一定量的蝦青素-植物甾醇亞麻酸酯復合脂質體于50 mL圓底燒瓶內，加入適量石油醚并于30 ℃水浴攪拌，萃取游離蝦青素。10 min后進行離心，并吸取上清液。重復上述步驟至上清液澄清，合并上清液后旋蒸除去石油醚，用三氯甲烷定容至10 mL容量瓶中，于492 nm處測定吸光度。

1.3.4 單因素試驗

以包封率為考察指標，分別研究植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比(5%、10%、15%、20%、25%)、吐溫80用量(40、60、80、100、120 mg)、PBS的pH值(6.2、6.6、7.0、7.4、7.8)、水相與有機相體積比(2/1、3/1、4/1、5/1、6/1)以及磷脂與蝦青素質量比(40/1、50/1、60/1、70/1、80/1)對復合脂質體包封率的影響。

1.3.5 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，依據Box-Behnken中心組合設計原理，以復合脂質體的包封率為響應值，選擇合適的因素與水平設計響應面優(yōu)化試驗，確定最佳制備工藝。

1.4 數據處理與分析

所有試驗至少重復3次，結果取平均值，采用Origin 8作圖，采用SPSS 23進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比對復合脂質體包封率的影響

在制備脂質體過程中加入一定量的膜調節(jié)劑能夠改善脂質雙分子層結構的特性，提高脂質體的穩(wěn)定性[23]。固定PBS的pH值為7.4，水相與有機相體積比5/1，吐溫80用量100 mg，磷脂與蝦青素質量比50/1，考察植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比對包封率的影響。由圖1可知，隨著植物甾醇亞麻酸酯與磷脂的質量比的增大，脂質體的包封率先增高后降低。在植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比為10%時，包封率最大，為(95.32±0.11)%。適量的植物甾醇亞麻酸酯可與磷脂相互作用，使脂質膜結構更緊密，芯材不易泄露，從而提高蝦青素的包封率[24]。當植物甾醇亞麻酸酯過量時，可能占據了囊泡一定的空間，使得包封率下降。

圖1 植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比對 復合脂質體包封率的影響Fig.1 Effect of the mass ratio of phytosterol linolenic acid ester to phospholipids on the encapsulation efficiency of complex liposomes

2.1.2 PBS的pH值對復合脂質體包封率的影響

固定其他條件，考察PBS的pH值對復合脂質體包封率的影響。由圖2可知，隨著PBS 的pH值的增大，包封率先升高而后又降低，在pH 7.4時達到最大,為(95.12±0.45)%。隨著pH值繼續(xù)增大，包封率降低。原因可能是在強酸或強堿環(huán)境下，磷脂的水解常數增大而發(fā)生水解，脂質體囊泡遭到破壞，導致芯材滲漏，而在pH 7.4時，酸堿性適宜，有利于脂質體穩(wěn)定[25]。

圖2 pH值對復合脂質體包封率的影響Fig.2 Effect of pH value on the encapsulation efficiency of complex liposomes

2.1.3 水相與有機相體積比對復合脂質體包封率的影響

固定其他條件，考察水相與有機相的體積比對包封率的影響。由圖3可知，當水相與有機相體積比增大時，復合脂質體的包封率也隨之增大，在體積比為4/1時，復合脂質體的包封率達到最大，為(94.28±0.04)%，之后隨著水相與有機相體積比的增大，包封率呈現下降趨勢。這可能是因為有機相的量過小時，不能完全將磷脂等膜材全部溶解，導致包封率不高；而大量的有機相存在時，不利于脂質體囊泡的形成，使包封率降低[26]。

圖3 水相與有機相體積比對復合脂 質體包封率的影響Fig.3 Effect of the volume ratio of water phase to organic phase on the encapsulation efficiency of complex liposomes

2.1.4 吐溫80用量對復合脂質體包封率的影響

固定其他條件，考察吐溫80用量對復合脂質體包封率的影響。由圖4可知，隨著吐溫80用量的增多，復合脂質體包封率也逐漸上升，當用量為100 mg時包封率達到最大，為(94.41±0.10)%，之后隨著吐溫80用量的持續(xù)增多，包封率出現下降趨勢。作為表面活性劑，吐溫80能夠影響磷脂分子兩端的運動，適量的加入可以平衡脂質體膜的表面張力，使芯材不易滲漏[27]。吐溫80用量從40 mg增至120 mg時，包封率為91.61%～94.41%，與其他因素相比，變化范圍較小，表明吐溫80用量對包封率的影響相對較小。

圖4 吐溫80的用量對復合脂質體 包封率的影響Fig.4 Effect of Tween 80 dosage on the encapsulation efficiency of complex liposomes

2.1.5 磷脂與蝦青素質量比對復合脂質體包封率的影響

蝦青素為親脂性物質，可通過將其包埋于脂質體中從而提高蝦青素的水分散性[22]，因此，膜材與芯材的質量比直接影響脂質體的包封率。固定其他條件，考察磷脂與蝦青素的質量比對復合脂質體包封率的影響。由圖5可知，當磷脂與蝦青素質量比增大時，復合脂質體包封率也逐漸增大，當質量比為50/1時，復合脂質體的包封率達最大，為(93.37±0.03)%，隨著質量比繼續(xù)增加，包封率開始下降。對脂質體囊泡來說，在有限的空間內，蝦青素的量適量增加，脂質體的包封率增大。當囊泡的空間達到飽和后，蝦青素將游離在脂質體囊泡外，導致包封率下降。磷脂與蝦青素質量比從40/1增至80/1時，包封率為90.59%～93.37%，與其他因素相比，變化范圍較小，表明磷脂與蝦青素質量比對包封率的影響相對較小。

圖5 磷脂與蝦青素質量比對復合脂質體 包封率的影響Fig.5 Effect of the mass ratio of phospholipids to astaxanthin on the encapsulation efficiency of complex liposomes

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面設計及分析

在單因素試驗基礎上，以復合脂質體的包封率作為響應值(Y)，選取對包封率影響較大的3個因素，即植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比、PBS的pH值以及水相與有機相體積比作為自變量，進行響應面優(yōu)化試驗,因素與水平見表1。設計方案及結果見表2。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

表2 響應面設計及結果Table 2 Design and results of response surface

2.2.2 響應面交互作用分析

交互作用的強弱一般可通過等高線的形狀直接進行分析，若兩因素交互作用顯著，則等高線呈橢圓形，若兩因素交互作用不顯著則等高線偏圓形。由圖6a可知，當水相與有機相體積比不變時，隨著植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比和PBS的pH值增加，包封率先升高后降低，等高線為橢圓形，說明植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比和PBS的pH值之間的交互作用顯著。由圖6b可知，當PBS的pH值不變時，隨著植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比和水相與有機相體積比的增加，包封率先升高后降低，等高線為橢圓形，說明植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比和水相與有機相體積比之間的交互作用顯著。由圖6c可知，當植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比不變時，隨著PBS的pH值和水相與有機相體積比增大，包封率先升高后降低，等高線偏圓形，說明PBS的pH值和水相與有機相體積比之間的交互作用較弱。

表3 響應面模型的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

圖6 各因素交互作用對包封率影響的響應曲面Fig.6 Response surface of the effects of each factor interactions on encapsulation efficiency

2.2.3 驗證試驗

由Design-Expert 8.0.6軟件進行綜合性分析，得出制備復合脂質體的最優(yōu)工藝條件：植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比11.3%、PBS的pH值7.44、水相與有機相體積比3.8/1，此時，復合脂質體的理論包封率為96.29%。綜合各種因素，最終設定制備復合脂質體的最優(yōu)工藝條件：植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比10%(磷脂200 mg)、PBS的pH值7.4、水相與有機相體積比4/1、吐溫80用量100 mg、磷脂與蝦青素質量比50/1，經3次重復試驗測得設定條件下制備的復合脂質體的包封率為(95.87±0.40)%，與理論包封率相接近，表明該模型的預測效果良好。

3 結論

通過單因素試驗考察植物甾醇亞麻酸酯與磷脂的質量比、吐溫80的用量、PBS的pH值、水相與有機相的體積比以及磷脂與蝦青素質量比對復合脂質體包封率的影響。進行響應面優(yōu)化試驗，方差分析顯示模型擬合程度高，試驗結果可信。最終確定制備復合脂質體的最優(yōu)工藝條件：植物甾醇亞麻酸酯與磷脂質量比10%(磷脂200 mg)、PBS的pH值7.4、吐溫80用量100 mg、水相與有機相體積比4/1、磷脂與蝦青素質量比50/1。在最優(yōu)工藝條件下制得的復合脂質體包封率為(95.87±0.40)%，與理論值較為接近，表明模型的預測效果良好，適用于復合脂質體制備工藝參數的優(yōu)化。