劉 悅，張 燦，高玲玲，張康逸，閆美慧，張國治*

1．河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001 2．河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002

老面是選用小麥粉、大米、玉米粉、麩皮等谷物作為基底，以一定比例與水混合，經(jīng)過自然發(fā)酵風干后形成，在北方大多沿用傳統(tǒng)老面酵頭發(fā)酵技術(shù)，賦予饅頭獨特的質(zhì)地和濃郁的風味，深受消費者的喜愛[1]。風味作為饅頭的重要感官屬性之一，直接決定了消費者對食品的選擇。

發(fā)酵米面制品中風味物質(zhì)的形成主要有以下4種途徑：脂肪氧化、熱處理、微生物代謝及酶系生物轉(zhuǎn)化[2]。老面面團具有復雜的生化體系，饅頭風味物質(zhì)的形成離不開微生物的代謝參與。老面發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌的單一作用或相互作用會產(chǎn)生風味化合物[3]。研究表明老面面團的發(fā)酵過程可有效降低脂肪氧化，一些乳酸菌可還原脂肪氧化化合物為相應的醇類物質(zhì)[4-6]。酵母菌主要產(chǎn)生醇類物質(zhì)，乳酸菌則通過代謝作用產(chǎn)生酸類、呋喃類及少量醚類物質(zhì)[7-8]。Ripari等[9]還發(fā)現(xiàn)乳酸菌可代謝生成2-戊基呋喃、己酸、己醇以及酯類等風味物質(zhì)。Plessas等[10]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)生多種酯類化合物，乳酸菌的繁殖與酯類物質(zhì)的生成具有相關(guān)性。此外，Stadie等[7,11]研究表明，老面發(fā)酵面團中菌群間的相互競爭與促進對風味物質(zhì)的形成有較大關(guān)聯(lián)，環(huán)境的變化使得微生物產(chǎn)酶量與酶活性發(fā)生變化，從而影響香氣化合物的產(chǎn)生。

目前，對于老面饅頭的風味、微生物多樣性以及不同類型老面對饅頭風味的影響研究較多，然而，對其發(fā)酵過程中微生物菌群代謝作用與揮發(fā)性物質(zhì)間的關(guān)系研究相對較少。因此，作者基于老面對饅頭風味的影響，旨在通過傳統(tǒng)培養(yǎng)、高通量測序結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)，分析發(fā)酵過程中菌群的動態(tài)變化與風味物質(zhì)間的相關(guān)性，進而探索老面饅頭風味形成機制，為面制品風味發(fā)酵研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

特一粉：河南金苑糧油有限公司；高活性干酵母、饅頭改良劑：安琪酵母股份有限公司；老面(原料為玉米面、面粉、米酒及甜瓜曲)：新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)憶味土特產(chǎn)；雙效泡打粉：桂林市紅星化工有限責任公司；白糖：廣州福正東海食品有限公司；仲辛醇：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖：天津市風船化學試劑科技有限公司；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 儀器

MP 5002 電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HM 740海氏廚師機：青島漢尚品牌管理有限公司；FJ-YH面包醒發(fā)箱：廣東樂創(chuàng)電器有限公司；GC-7890A氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司；50/20 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭：美國色譜科公司；YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；PB-10酸度計：德國賽多利斯有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵面團的制備

L樣品：復配老面面團(DY(dough yield)=面團質(zhì)量×100/面粉質(zhì)量=153；水分含量39.9%)。和面(將面粉100 g、酵母1 g、泡打粉0.25 g、改良劑0.25 g、白砂糖0.25 g及老面水0.25 g混勻)→醒發(fā)(35 ℃，RH 85%，40 min)→取樣(醒發(fā)0、10、20、30、40 min時稱取)→裝袋，-40 ℃凍存。

A樣品：酵母發(fā)酵面團(DY 153，水分含量39.0%)。制作方法參照L樣品，僅和面時未加老面水，其余均保持一致。

1.3.2 發(fā)酵面團微生物檢測

1.3.2.1 微生物的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)與保存

參照GB 4789.2—2016測定發(fā)酵面團中菌落總數(shù)，對平板培養(yǎng)中優(yōu)勢單菌落進行純化培養(yǎng)，-40 ℃保存。

1.3.2.2 微生物群落鑒定

參考邢小龍[12]的方法，菌株活化后采用DNA試劑盒提取細菌的DNA，進行菌種鑒定。

1.3.2.3 高通量序列分析

1.3.3 面團pH值、總酸度和還原糖含量的測定

參考Liu等[14]的方法測定發(fā)酵面團的pH值及總酸度(TTA)；采用3, 5-二硝基水楊酸法[15]測定發(fā)酵面團的還原糖(RS)含量。

1.3.4 發(fā)酵面團風味物質(zhì)的測定與分析

采用GC-MS測定，內(nèi)標物為仲辛醇(200 mg/L)，參數(shù)設(shè)置參照馮濤等[16]的方法，并稍加改動。

樣品前處理：稱取面團3 g，加入10 μL 200 mg/L仲辛醇為內(nèi)標物，老化30 min，吸附30 min，解吸6 min，進樣檢測。

色譜條件：色譜毛細管柱為DB-5MS(60 mm×0.32 mm, 1 μm)；起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至180 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。載氣流量0.8 mL/min，壓力3.29×104Pa，進樣口250 ℃，運行41 min。

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～450 m/z，溶劑延遲3 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用Origin 8.0、Tukey’s、Hiplot分別進行制圖、顯著性差異和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)發(fā)酵面團中菌落總數(shù)的鑒定及理化指標測定

2.1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)分離細菌鑒定結(jié)果

由表1可知，A樣品菌落總數(shù)從初始的5.6×107CFU/g升至3.2×108CFU/g，L樣品從6.4×107CFU/g升至5.8×108CFU/g。A樣品中有桿菌屬和球菌屬，分別為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、檸檬色短小桿菌(Curtobacteriumcitreum)及腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)，并且隨著發(fā)酵的進行，腐生葡萄球菌逐漸成為優(yōu)勢物種，而檸檬色短小桿菌在20 min后逐漸被其他種群取代。添加老面后與未添加對比發(fā)現(xiàn)，有膠紅酵母屬(Mucilaginosaisolate)生長繁殖，并且菌屬逐漸增多，檸檬色短小桿菌成為優(yōu)勢菌種，與張國華[17]的研究結(jié)果一致。檸檬色短小桿菌多存在于小麥制品及水稻種子中，由于老面發(fā)酵工藝經(jīng)過玉米、小麥等雜糧混合后接種米酒等發(fā)酵培養(yǎng)，體系富含多種乳酸菌、醋酸菌，與A樣品相比，發(fā)酵力相對較弱，但發(fā)酵過程中的菌種代謝產(chǎn)生更多醛、酮、酯類等風味物質(zhì)，使得蒸制饅頭口感質(zhì)地細膩，味道香醇可口[18]。

2.1.2 發(fā)酵面團還原糖含量、總酸度、pH值的變化

面團發(fā)酵中的糖類物質(zhì)來源分為3類：面團多樣微生物分解中利用自身或發(fā)酵所產(chǎn)生；面團中所含淀粉酶水解淀粉后產(chǎn)生；代謝所產(chǎn)生的熱量影響面團體系糖平衡后產(chǎn)生[19]。由圖1a可知，A樣品RS變化呈現(xiàn)波動趨勢，在發(fā)酵10 min時達到最大值，L樣品呈先降低又升高而后降低的趨勢，在發(fā)酵20 min時達到峰值(1.13 g/100 g)，由于面粉中富含淀粉酶，在微生物生長至對數(shù)期時，淀粉酶活及水解能力最高，隨著細菌豐度、多樣性增加，RS生成速率高于消耗速率，導致RS含量增加，與李志建等[20]的研究結(jié)果一致。添加老面后，微生物體系多樣性增加，菌種利用面團氧氣進行有氧呼吸生成醋酸、CO2等酸性物質(zhì)，面團產(chǎn)氣能力逐漸增強，pH值降低。由圖1b可知，隨著面團酸性增強，嗜酸微生物乳酸菌、醋酸菌逐漸增多，L樣品pH值降到最低值(5.02)，此時還原糖含量為1.17 g/100 g。

表1 基于 16S rRNA 基因測序的細菌菌種鑒定Table 1 Identification of bacterial strains based on 16S rRNA gene sequencing CFU/g

圖1 面團發(fā)酵過程中RS含量、TTA及pH值的變化Fig.1 Changes of RS and TTA content and pH value during dough fermentation

2.2 發(fā)酵面團高通量測序鑒定細菌群落多樣性差異

2.2.1 樣本群落多樣性及豐度分析

由圖2a、2b可知，Rarefaction和 Shannon[21]曲線都趨于平坦，證明結(jié)果足以覆蓋所有的菌種信息。由圖2c可知，2種樣品曲線陡峭，表明物種分布不均勻，且物種之間的豐度存在差異。

2.2.2 α多樣性指數(shù)分析

由表2可知，Coverage指數(shù)均大于0.999，表明結(jié)果可反映樣品中的真實情況。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)在A樣品中呈先升高后降低趨勢，在L樣品中呈先降低再升高趨勢，說明在發(fā)酵過程中面團內(nèi)物種的豐度可能是隨著發(fā)酵進行而波動的，老面面團中的乳酸菌在最適生長條件下生長繁殖，一些適宜在較低溫、中性環(huán)境下生長的菌屬逐漸消亡。

表2 發(fā)酵面團樣品中細菌 α 多樣性分析Table 2 Analysis of bacterial α diversity in yeast dough samples

Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)反映發(fā)酵過程中物種多樣性變化趨勢，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，多樣性種類不確定性越大，表明物種多樣性高。 結(jié)合表1可知，在發(fā)酵初期，隨著菌落總數(shù)的升高，物種多樣性有所降低，隨發(fā)酵面團pH值降低及溫度緩慢升高，一些耐酸、耐熱菌屬逐漸增多。發(fā)酵后期，細菌生長從對數(shù)期進入穩(wěn)定期，生長速率不變，菌落總數(shù)呈比例升高，多樣性增加，某些菌種在適宜條件下成為優(yōu)勢菌，有些菌群逐漸消亡，以此消彼長的狀態(tài)維持細菌總數(shù)的平穩(wěn)。

2.2.3 細菌群落組成分析

在目和屬水平上物種豐度前10的群落組成見圖3。由圖3a可知，從目水平看，乳桿菌目(Lactobacillales)和擬桿菌目(Bacteroidales)在添加老面的體系中占優(yōu)勢地位，乳桿菌目相對豐度7%，在未添加老面的體系中幾乎未檢出。L30的擬桿菌目相對豐度達到峰值10%，可能與老面體系中添加米酒酒曲后還原糖含量降低有關(guān)。張海燕等[22]在研究中檢測出與試驗相同的葉綠體序列，并提出原因可能是過程中添加曲種或發(fā)酵、干制時環(huán)境所帶來。劉同杰等[23]通過對傳統(tǒng)酸面團鑒定，發(fā)現(xiàn)乳桿菌目為其中關(guān)鍵微生物，與圖3a結(jié)果類似。寧亞麗等[24]研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌為酒曲中的優(yōu)勢細菌，對酸味的產(chǎn)生有重要作用。由圖3b可知，添加老面后，L樣品中出現(xiàn)新的乳酸桿菌(Lactobacillus)，且隨時間延長，保持較高相對豐度，在10%左右波動，可將乳酸桿菌看作L面團中的優(yōu)勢菌屬。在酸面團發(fā)酵過程中乳酸桿菌常被發(fā)現(xiàn)，并與檸檬色短小桿菌等細菌相互促進[25-26]。

2.3 發(fā)酵面團風味物質(zhì)的測定

由表3可知，面團中有21種醇類、42種烴類、30種酯類、2種呋喃類、11種醛類、7種酮類、4種酚類、2種醚類及5種其他類別，共124種風味物質(zhì)，醇類和酯類相對含量較高，可認為是面團發(fā)酵過程中的關(guān)鍵香氣成分。隨著發(fā)酵時間的延長，L面團中醛類風味物質(zhì)略微下降，A面團中烴類略微下降，其余總體基本不變，比較L面團中揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量發(fā)現(xiàn)，適量添加老面后面團的風味物質(zhì)增加，從而提升蒸制后饅頭的風味。醇類在環(huán)境中不穩(wěn)定、易揮發(fā)而較易在香氣檢測中捕獲，面團中醇類物質(zhì)的產(chǎn)生主要源于可發(fā)酵糖源的代謝作用。在面團發(fā)酵后期，體系中酵母菌、乳酸菌通過直接參與代謝或結(jié)合電子受體參與代謝，還原內(nèi)部醛類物質(zhì)為醇類、酸類物質(zhì)，面團體系風味物質(zhì)多樣性增加[27-28]。酯類風味物質(zhì)的產(chǎn)生主要來源于酸類物質(zhì)與醇類物質(zhì)的化學反應，面團發(fā)酵過程中脂肪酸與乙醇作用，使面團產(chǎn)生堅果類及環(huán)狀芳香類氣味[29]。棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯和酞酸二丁酯為老面面團中相對含量較多的特征風味成分，酯類的產(chǎn)生可能來源于發(fā)酵過程中桿菌、酵母菌的生長繁殖，面團中脂肪酸代謝作用增強[30]。面粉中本身含有少量的油脂成分及不飽和脂肪酸，通過氧化反應生成氧化物，發(fā)酵時酵母菌種類及數(shù)量增加，酶作用增強，生成醛、酮類物質(zhì)。醛類物質(zhì)大多具有果類、綠葉草本類等風味；酮類、酚類物質(zhì)大多具有酸味、堅果類、水果類香氣，但其呈香作用弱，在饅頭整體香氣特征中表現(xiàn)不明顯[31-32]。

圖3 目和屬水平的群落組成和相對豐度Fig.3 Community composition and relative abundance at the order and genus levels

表3 面團發(fā)酵過程揮發(fā)性風味物質(zhì)GC-MS分析Table 3 GC-MS analysis of volatile flavor compounds during dough fermentation

續(xù)表3

綜合各類香氣成分的變化可以得出，微生物復雜程度的增加、體系內(nèi)生化反應的進行有利于風味的產(chǎn)生，起主導作用的是酯類、醇類、醛類等風味成分，相對含量存在差異。隨發(fā)酵時間延長，老面面團中酯類物質(zhì)逐漸增多，醇類、醛類物質(zhì)逐漸減少，可能是造成老面饅頭具有特殊香氣的主要原因。添加老面后，面團風味物質(zhì)種類變多，通過物質(zhì)之間相互協(xié)調(diào)，賦予了饅頭獨特的風味和口感。

2.4 發(fā)酵面團揮發(fā)性成分與微生物相關(guān)性分析

由圖4可知，檸檬色短小桿菌與醇類負相關(guān)，與醚類、醛類正相關(guān)；蠟樣芽孢桿菌與醇類、醛類正相關(guān)，與呋喃類負相關(guān)；膠紅酵母與酮類、酯類、醛類正相關(guān)，與烴類、呋喃類負相關(guān)；腐生葡萄球菌與酚類、呋喃類正相關(guān)，與酯類負相關(guān)。由此可見，發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的變化與微生物群落結(jié)構(gòu)的變化具有相關(guān)性，說明微生物改變是影響風味變化的一項重要因素。對面團發(fā)酵過程中的微生物進行調(diào)控，為進一步研究微生物菌群結(jié)構(gòu)對風味物質(zhì)形成的機理提供理論依據(jù)。

圖4 風味物質(zhì)與微生物間相關(guān)性熱圖Fig.4 Heat map of the correlation between flavor components and microorganisms

3 結(jié)論

基于傳統(tǒng)培養(yǎng)和高通量測序?qū)ξ⑸锒鄻有约熬航Y(jié)構(gòu)分析表明，老面的添加提高了發(fā)酵過程中膠紅酵母及檸檬色短小桿菌的菌落數(shù)。微生物多樣性的提高有利于發(fā)酵面團風味的改善。采用GC-MS法共檢測到124種揮發(fā)性風味物質(zhì)，老面的添加使得風味物質(zhì)的種類及數(shù)量增多，酯類、醛類、醇類尤其明顯。與酵母面團相比，老面面團在縮短發(fā)酵時間的同時，能賦予新的風味及增強特征香氣濃度。微生物菌群多樣性與老面饅頭風味相關(guān)性分析表明，微生物菌群多樣性與揮發(fā)性香氣物質(zhì)組成具有顯著相關(guān)性。本研究通過對未添加和添加老面的面團發(fā)酵過程中微生物多樣性及風味物質(zhì)的變化進行比較分析，為進一步研究菌群信息及提升饅頭特征風味和品質(zhì)優(yōu)化提供理論參考，對開發(fā)生產(chǎn)老面饅頭工業(yè)化風味發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。