曹榮耀，謝巖黎，劉 晨，程思忠

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

脫氧雪腐鐮刀烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素(vomitoxin)，是由禾谷鐮刀菌和雪腐鐮刀菌等一系列真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，屬于B類單端孢酶烯族毒素[1-2]。DON廣泛存在于玉米、小麥、大豆等糧食作物中，是常見的真菌毒素之一[3-4]。DON通過影響免疫細(xì)胞增殖從而降低機(jī)體的免疫力，同時(shí)能夠抑制DNA、RNA和部分蛋白質(zhì)的合成，使人和動(dòng)物中毒，引起人體免疫抑制、貧血等癥狀，也能造成家畜嘔吐、生殖紊亂和生長緩慢等現(xiàn)象[5-6]。目前世界上至少37個(gè)國家和組織制定了DON的限量標(biāo)準(zhǔn)[7]，GB 2761—2017 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中規(guī)定了谷物及其制品中DON的含量不能超過 1 mg/kg。因此采取有效的脫毒方法對糧食、飼料安全以及人和動(dòng)物的健康具有重要意義。

當(dāng)前，DON的脫毒方法主要包括物理、化學(xué)和生物降解法[8]。目前已知的物理吸附法對DON的吸附效果不佳，甚至?xí)?dǎo)致谷物和飼料中營養(yǎng)物質(zhì)被破壞，造成二次污染。DON具有十分穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)[9]，化學(xué)脫毒可以有效破壞DON結(jié)構(gòu)，但同時(shí)會(huì)引入化學(xué)物質(zhì)，影響谷物和飼料的品質(zhì)。生物降解法主要通過從自然界中篩選微生物，利用微生物釋放的胞外酶對DON進(jìn)行降解，具有溫和、安全、高效等特點(diǎn)。微生物可以通過水合作用、去環(huán)氧化和糖苷化等方式使DON的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而使DON轉(zhuǎn)化成為低毒或者無毒的產(chǎn)物[10-12]。目前，國內(nèi)外利用微生物降解DON的研究已慢慢成為主流，且相關(guān)研究結(jié)果表現(xiàn)出良好的應(yīng)用和開發(fā)前景[13-14]。

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminis)屬于植物病原真菌[15]，通過侵染不同生長階段的小麥分泌出DON等真菌毒素，對人和牲畜造成威脅[16]。小麥赤霉病每年的發(fā)病面積超過總種植面積的20%[17]?，F(xiàn)今噴灑農(nóng)藥是防治禾谷鐮刀菌產(chǎn)生危害的主要措施，但是化學(xué)試劑長期使用會(huì)導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性，并且會(huì)造成病原菌毒素的積累[18]。生物防治技術(shù)在植物病害綜合治理中具有重要作用，利用微生物或者其代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為生物防治的重要組成部分，能夠保障食品和環(huán)境的安全，同時(shí)對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)綠色發(fā)展具有重大意義[19]。在禾谷鐮刀菌的生物防治中研究最為廣泛的菌株是芽孢桿菌，如多黏類芽孢桿菌[20]、枯草芽孢桿菌[21]、解淀粉芽孢桿菌[22]等對其都有較好的抑制作用。作者從豬腸道微生物中分離得到1株能夠降解嘔吐毒素的貝萊斯芽孢桿菌Vel-HNGD-F2，研究其降解效果及特性，同時(shí)探究其對禾谷鐮刀菌的拮抗效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：洛陽仔豬腸道微生物；禾谷鐮刀菌：河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院。

DON標(biāo)準(zhǔn)品：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所；Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；嘔吐毒素免疫親和柱：佰奧萃(天津)生物科技有限公司；蛋白酶k：德國 biofroxx 公司；甲醇：天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。硫酸銨、氯化鈣、硫酸亞鐵等：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQZY-A8E全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：游目儀器有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀儀器有限公司；高效液相色譜儀：安捷倫科技(中國)有限公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：1 g 硫酸銨、0.5 g 氯化鈉、0.05 g 氯化鈣、6 g 磷酸氫二鉀、3 g 磷酸二氫鉀、0.5 g 硫酸鎂、0.001 g 硫酸亞鐵、20 g瓊脂、1 L蒸餾水。

發(fā)酵培養(yǎng)基：3 g牛肉膏、10 g蛋白胨、6 g葡萄糖、5 g氯化鈉、20 g瓊脂、1 L蒸餾水。

LB培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸粉、10 g氯化鈉、20 g瓊脂、1 L蒸餾水。

PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 L蒸餾水。

1.4 菌株的分離純化

稱取10 g樣品加入90 mL生理鹽水中，150 r/min恒溫振蕩2 h，吸取0.2 mL懸浮液于滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃搖床150 r/min培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液等梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，然后吸取不同稀釋度的發(fā)酵培養(yǎng)菌液100 μL涂布于含有20 μg/mL DON的初篩培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)基中挑選出長勢良好且形態(tài)較大的單菌落，將菌落劃線于初篩培養(yǎng)基上，純化并培養(yǎng)3代后得到單一菌落。將單一菌落接種在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃搖床150 r/min 培養(yǎng)48 h后保藏于-80 ℃冰箱中。

1.5 降解DON菌株的篩選

在LB培養(yǎng)基中接種篩選出的單菌落，37 ℃搖床150 r/min培養(yǎng)24 h，將1%的培養(yǎng)液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃搖床150 r/min培養(yǎng)48 h。吸取950 μL培養(yǎng)液和50 μL DON標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/mL)于1.5 mL棕色離心管中，使DON 的終質(zhì)量濃度達(dá)到5 μg/mL，37 ℃搖床150 r/min 孵育72 h。將孵育完全的混合體系以10 000 r/min離心10 min后收集上清液，將上清液以1～2 s/滴通過嘔吐毒素免疫親和柱，用10 mL蒸餾水清洗免疫親和柱，將3 mL甲醇以1～2 s/滴通過免疫親和柱，用10 mL離心管收集甲醇溶液，并使用氮吹儀吹干收集的甲醇溶液，向吹干后的離心管中加入1 mL流動(dòng)相進(jìn)行復(fù)溶，通過高效液相色譜(HPLC)檢測DON降解率。HPLC檢測參數(shù)：Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫35 ℃；上樣量20 μL ；流動(dòng)相為水-甲醇(體積比70∶ 30)；波長218 nm ；流速1 mL/min。

式中：A0為對照組DON含量；A1為試驗(yàn)組DON含量。

1.6 菌株鑒定

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》分析菌株的生理生化特征。

1.7 分子生物學(xué)鑒定

篩選菌株的DNA使用Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取。將提取出來的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目標(biāo)產(chǎn)物在150 V、100 mA條件下電泳20 min，根據(jù)電泳條帶判斷PCR擴(kuò)增是否成功。將擴(kuò)增成功的目標(biāo)產(chǎn)物純化、測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 孵育時(shí)間對DON降解的影響

將接種在LB培養(yǎng)基中的單菌落于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種1%的菌液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在1.5 mL離心管中加入950 μL 的發(fā)酵液和50 μL的 DON標(biāo)準(zhǔn)品，使DON終質(zhì)量濃度為5 μg/mL，使用HPLC檢測37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12、24、36、48、72 h的DON降解率。

1.9 細(xì)菌細(xì)胞及上清液對DON降解的影響

使用低溫離心機(jī)將發(fā)酵液在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液；菌體沉淀用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2遍后加入5倍的PBS形成菌體懸浮液；收集部分菌體懸浮液使用超聲波細(xì)胞破碎儀(輸出功率360 W、裂解10 s、間隔10 s、總時(shí)間30 min)進(jìn)行破碎，將破碎之后的菌體懸浮液4 ℃、12 000 r/min離心15 min，保留上清液得到胞內(nèi)提取物。將950 μL的上清液、菌體懸浮液和胞內(nèi)提取物與50 μL的 DON標(biāo)準(zhǔn)品混合，37 ℃搖床150 r/min 孵育48 h。對照組為發(fā)酵培養(yǎng)基和PBS，每組設(shè)置3個(gè)平行，使用HPLC檢測DON降解率。

1.10 經(jīng)蛋白酶k、熱處理后的上清液對DON降解的影響

上清液中加入1 mg/mL 蛋白酶k，37 ℃混合培養(yǎng)12 h，加入50 μL DON標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/mL)，設(shè)置3個(gè)平行，37 ℃搖床150 r/min 孵育48 h。將上清液在100 ℃水浴中加熱10 min后與50 μL(100 μg/mL)DON標(biāo)準(zhǔn)品混合均勻，設(shè)置3個(gè)平行，37 ℃搖床150 r/min 孵育48 h，然后用HPLC檢測DON降解率。

1.11 Vel-HNGD-F2菌株及上清液對禾谷鐮刀菌的拮抗作用

采用皿內(nèi)平板對峙法[23]，將5 mm的禾谷鐮刀菌接種在PDA平板中央處，取長勢良好的篩選菌的單菌落接種在PDA平板周圍4個(gè)點(diǎn)上。27 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h后觀察禾谷鐮刀菌的生長情況，并計(jì)算抑菌率。

將培養(yǎng)48 h的菌體發(fā)酵液6 000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾膜過濾除去殘留菌體得到上清液。將PDA培養(yǎng)基和上清液按體積比9∶ 1混合搖勻，倒入培養(yǎng)皿中，以相同比例的發(fā)酵培養(yǎng)基代替上清液作為空白對照，在混合均勻的PDA平板中央接種5 mm的禾谷鐮刀菌菌餅，27 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后觀察禾谷鐮刀菌在培養(yǎng)基上的生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 DON 降解菌的篩選與鑒定

圖1 菌株Vel-HNGD-F2的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain Vel-HNGD-F2

從豬腸道微生物中分離得到1株能夠高效降解DON的菌株，命名為Vel-HNGD-F2。從圖1可以看出，Vel-HNGD-F2為單菌落，呈凸起狀，淺黃色且不透明，菌落表面干燥，邊緣不光滑，這與繆伏榮等[24]觀察到的結(jié)果一致。菌株經(jīng)過革蘭氏染色后用顯微鏡觀察(圖2)，該菌株呈橢圓短桿狀、紫色，說明Vel-HNGD-F2為革蘭氏陽性菌。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對Vel-HNGD-F2菌株進(jìn)行生理生化分析測試，結(jié)果見表1。圖3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖，可以看到在大約1 500 bp處出現(xiàn)一條清晰的擴(kuò)增條帶，說明擴(kuò)增產(chǎn)物的序列長度為1 500 bp左右。將得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因比對分析可知，菌株Vel-HNGD-F2與芽孢桿菌屬同屬一大分支，其16 S rDNA與貝萊斯芽孢桿菌有100%序列同一性。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)進(jìn)一步確定Vel-HNGD-F2為貝萊斯芽孢桿菌。

圖2 菌株Vel-HNGD-F2革蘭氏 染色后的形態(tài)Fig.2 Morphology of strain Vel-HNGD-F2 after gram staining

表1 菌株Vel-HNGD-F2生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification of strain Vel-HNGD-F2

注：M為Marker；1為Vel-HNGD-F2的PCR產(chǎn)物。圖3 菌株Vel-HNGD-F2的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of strain Vel-HNGD-F2

圖4 菌株Vel-HNGD-F2及相關(guān)菌群16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Vel-HNGD-F2 and 16S rDNA gene sequences of related strains

2.2 貝萊斯芽孢桿菌對DON的降解效果

菌株Vel-HNGD-F2對DON的降解效果見圖5，DON的保留時(shí)間在6 min左右，試驗(yàn)組與對照組相比DON含量明顯下降。由圖6可知，菌株Vel-HNGD-F2對DON的降解是一個(gè)快速而且連續(xù)的過程，12 h內(nèi)Vel-HNGD-F2可以快速降解DON，降解率達(dá)到60.0%，36 h后降解率趨于穩(wěn)定，72 h降解率達(dá)到76.7%?？赡苁怯捎诰闢el-HNGD-F2在培養(yǎng)發(fā)酵過程產(chǎn)生大量降解物質(zhì)使降解速率在12 h內(nèi)快速增長，當(dāng)發(fā)酵液中降解物質(zhì)的降解能力達(dá)到最大限度時(shí)，降解效果趨于穩(wěn)定，這與竇勇等[25]的試驗(yàn)結(jié)果非常相似。

圖5 菌株Vel-HNGD-F2對DON的降解效果Fig.5 Degradation effect of strain Vel-HNGD-F2 on DON

圖6 菌株Vel-HNGD-F2不同孵育時(shí)間 對DON的降解率Fig.6 Degradation rate of DON by strain Vel-HNGD-F2 at different incubation time

2.3 貝萊斯芽孢桿菌對DON的降解特性

為了探究菌株Vel-HNGD-F2對DON的降解特性，將培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液離心后收集上清液，同時(shí)收集用PBS懸浮的菌體懸浮液和通過細(xì)胞破碎收集的胞內(nèi)提取物，分別檢測其降解DON的能力。由圖7可知，孵育48 h，上清液對DON的降解率達(dá)到58.9%，菌體懸浮液和胞內(nèi)提取物對DON的降解率只有5.98%和6.26%。說明菌株Vel-HNGD-F2對DON的降解主要來自分泌的胞外活性物質(zhì)，并不是菌體的吸附作用，與付苗苗等[26]的研究結(jié)果相似。為了進(jìn)一步探究菌株的降解特性，將上清液與蛋白酶k混合處理12 h之后，再與DON混合孵育，發(fā)現(xiàn)降解率降低了14.5個(gè)百分點(diǎn)，可能是蛋白酶k的處理抑制了酶的作用活性導(dǎo)致降解率降低，因此進(jìn)一步推測對DON降解的活性物質(zhì)主要來自于菌株Vel-HNGD-F2分泌的胞外酶，與付苗苗等[26]研究結(jié)果一致。上清液經(jīng)過100 ℃水浴處理10 min后，DON的降解率下降了11.2個(gè)百分點(diǎn)，推測可能是高溫處理破壞了酶的結(jié)構(gòu)，降低了酶的活性，造成胞外酶對DON的降解率下降。在許多情況下，微生物對真菌毒素的降解主要是靠酶活性，例如孟玲玲[27]將NJA-1菌中的DON降解酶基因表達(dá)在畢赤酵母中，得到的畢赤酵母對DON的降解率達(dá)到50%；He等[28]篩選得到1株德沃斯氏菌，能夠使DON的C3位異構(gòu)化3-epi-DON，且其降解酶及基因也已明確，在48 h內(nèi)DON的降解率達(dá)到88%；計(jì)成等[29]將德沃斯氏菌添加到被污染飼料中，DON的降解率達(dá)到86.19%。這些研究表明微生物對DON降解主要是通過酶的作用，對農(nóng)業(yè)和食品業(yè)都有重要的應(yīng)用價(jià)值。

圖7 菌株發(fā)酵液不同組分和上清液經(jīng)蛋白酶k、 加熱處理后DON的降解率Fig.7 Degradation rate of DON by different components of strain fermentation broth and after protease K and heating treatment of the supernatant

2.4 貝萊斯芽孢桿菌及上清液對禾谷鐮刀菌的拮抗作用

從圖8可以看出，對照組中的禾谷鐮刀菌生長良好，菌絲鋪滿整個(gè)平板，將Vel-HNGD-F2接種在PDA四角之后可以觀察到，禾谷鐮刀菌在Vel-HNGD-F2周圍的生長受到明顯抑制，產(chǎn)生了抑菌圈(試驗(yàn)組)，抑菌率達(dá)到了56.2%，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是Vel-HNGD-F2分泌產(chǎn)生了抑制禾谷鐮刀菌的代謝物質(zhì)。已有研究表明，芽孢桿菌能有效地控制有害真菌的生長發(fā)育，短小芽孢桿菌能有效抑制碳曲霉在PDA培養(yǎng)基上的生長和碳曲霉?jié){果腐病的發(fā)生[30]。這些結(jié)果與本試驗(yàn)觀察到的結(jié)果一致。

將Vel-HNGD-F2上清液添加到PDA培養(yǎng)基后，禾谷鐮刀菌生長明顯受到了抑制，由圖9可以看到菌絲大幅減少，經(jīng)計(jì)算抑菌率為63.2%。推測可能是Vel-HNGD-F2能夠代謝產(chǎn)生抑制禾谷鐮刀菌的胞外活性物質(zhì)，使用上清液與培養(yǎng)基混勻后，Vel-HNGD-F2產(chǎn)生的胞外活性物質(zhì)在其中發(fā)揮作用，導(dǎo)致禾谷鐮刀菌生長受到抑制。

圖8 菌株Vel-HNGD-F2對禾谷鐮刀菌的抑制Fig.8 Inhibition of strain Vel-HNGD-F2 against Fusarium graminis

圖9 菌株Vel-HNGD-F2上清液對禾谷鐮 刀菌的抑制Fig.9 Inhibition of supernatant of strain Vel-HNGD-F2 against fusarium graminis

3 結(jié)論

從豬腸道微生物中篩選得到1株具有降解DON能力的貝萊斯芽孢桿菌Vel-HNGD-F2，該菌72 h對DON的降解率為76.7%，菌體懸浮液和胞內(nèi)提取物對DON的降解率為5.98%和6.26%，推測Vel-HNGD-F2可以產(chǎn)生降解DON的胞外酶。此外菌株Vel-HNGD-F2還可以對禾谷鐮刀菌的生長進(jìn)行抑制，能夠?yàn)楹坦如牭毒斐傻牟『μ峁┥锓乐蔚睦碚摶A(chǔ)。已經(jīng)確定了一些降解DON的酶，如醛酮還原酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶，本研究尚未確定胞外酶的種類，在后續(xù)的試驗(yàn)中可以繼續(xù)研究胞外酶，挖掘其基因并進(jìn)行外源克隆表達(dá)，開發(fā)出能夠應(yīng)用于飼料和食品的生物脫毒酶制劑。