張 諾,陳瀟俐,丁麗平,胡 南

(1.紙質(zhì)文物保護(hù)國家文物局重點(diǎn)科研基地,江蘇 南京 210016;2.近現(xiàn)代紙質(zhì)文獻(xiàn)脫酸保護(hù)技術(shù)文化和旅游部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210016;3.南京博物院,江蘇 南京 210016;4.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800)

紙質(zhì)文物作為我國四大發(fā)明之中造紙術(shù)和印刷術(shù)的具體承載,是我國古代勞動人民的智慧結(jié)晶與創(chuàng)新成果,占有極為重要的地位與意義。中國兩千年以來積累的紙質(zhì)文物浩如煙海,它真實(shí)詳細(xì)地記錄了社會的發(fā)展、各地民風(fēng)民俗等,是祖先留下的寶貴的文化遺產(chǎn),對于現(xiàn)代學(xué)者研究古代歷史有著十分寶貴的意義[1]。紙質(zhì)文物是以紙為主要載體材質(zhì)的文物,主要包括書畫、古籍、檔案、地圖、文書、紙幣、郵票等等。紙張作為紙質(zhì)文物的載體會因物理、化學(xué)和生物因素而損壞,其有機(jī)組成成分——纖維素、半纖維素和木質(zhì)素皆可作為微生物生存必需的碳源。微生物獲得這些養(yǎng)分后,生長代謝和繁殖,致使紙張?jiān)谖锢斫Y(jié)構(gòu)、化學(xué)組成方面發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的“生物退化”[2]。損壞博物館、圖書館中紙質(zhì)文物的微生物主要是絲狀真菌。絲狀真菌在新陳代謝中產(chǎn)生的物質(zhì)可誘導(dǎo)本體的多種物理和化學(xué)分解過程,如:真菌的生長會改變原紙張載體的結(jié)構(gòu)組成,真菌代謝還會產(chǎn)生不同種類的酶系、有機(jī)和無機(jī)酸、色素、螯合劑和其他生化物質(zhì)。根據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道,有些菌屬通過新陳代謝產(chǎn)生的纖維素酶、蛋白酶等,可直接對紙質(zhì)文物的組成成分進(jìn)行降解;有些菌屬代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸,黏附在紙質(zhì)文物上,使紙質(zhì)文物一直處于低酸度的環(huán)境[4],且可以在較短時(shí)間大大降低紙張的強(qiáng)度;真菌在生長過程中還會分泌不同顏色的色素,在紙上呈現(xiàn)出從黑色到棕色、紅色、黃色和紫色的多種色斑[5],這些色斑會隨著時(shí)間的推移而增加,最終導(dǎo)致紙質(zhì)文物無法讀視,造成無法挽救的損失。

早在20世紀(jì)30年代,人們就注意到紙質(zhì)文物上出現(xiàn)的黃色、黃褐色、鐵銹色的斑點(diǎn),稱之為狐斑(fox spots)[6]。狐斑的起因仍是一個(gè)值得討論的問題。事實(shí)上,它的發(fā)生有兩種互補(bǔ)的理論——生物理論和非生物理論[5]。色斑的顏色代表不同真菌種屬的特征,但其出現(xiàn)也可能與紙張?zhí)匦?酸堿度、金屬元素、施膠)相關(guān)。關(guān)于紙質(zhì)文物微生物病害的研究方法,基于各類培養(yǎng)基的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法一直是研究微生物生理代謝特征的主流方法,但分子生物學(xué)技術(shù)出現(xiàn)以來,包括克隆文庫構(gòu)建、變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)和分子測序技術(shù)在微生物病害鑒定方面發(fā)揮了重要作用[7]。近年來,隨著宏基因組學(xué)、高通量測序、代謝組學(xué)、生物化學(xué)分析等手段的快速發(fā)展,這些與傳統(tǒng)培養(yǎng)法將共同構(gòu)成了研究微生物病害特征和退化機(jī)制的“工具庫”[7]。

本研究選取貴州地區(qū)濕潤潮濕氣候條件下受微生物侵染的館藏紙質(zhì)文物為典型代表;采用無損采樣方法對紙質(zhì)文物表面色斑上的微生物進(jìn)行采集、分離,結(jié)合分子生物學(xué)手段對其類別進(jìn)行基因鑒定;以纖維素酶酶活、木聚糖酶酶活和蛋白酶酶活為評價(jià)指標(biāo),按照國標(biāo)定量測定實(shí)驗(yàn)菌株的酶活,從而判斷因微生物生長增殖和代謝活動對紙質(zhì)文物可能造成的退化和危害。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

基因組提取采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司基因組DNA提取試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司微生物裂解試劑盒;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成;擴(kuò)增產(chǎn)物的純化采用江蘇康寧生命科學(xué)有限公司凝膠回收試劑盒;基因序列測定委托南京金斯瑞生物科技有限公司;蛋白胨、酵母膏、木聚糖,美國阿拉丁公司;羧甲基纖維素鈉,生工生物工程(上海)股份有限公司;酒石酸鉀鈉、L-酪氨酸,BBI生命科學(xué)有限公司;葡萄糖、NaCl、瓊脂、苯酚、無水亞硫酸鈉、二水合磷酸二氫鈉、干酪素、七水合硫酸鎂、硫酸銨、磷酸二氫鉀,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;福林酚,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基[8]

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:依次稱取蛋白胨10 g、NaCl 10 g、牛肉膏3 g、瓊脂15 g于燒杯中,加入適量的雙蒸水并加熱使其溶解,后定容至1 L,調(diào)節(jié)pH至7.4～7.6,121 ℃下高壓滅菌20 min。液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基的成分相同,但不加瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g,加適量的水煮沸30 min后,紗布過濾,濾液中加入葡萄糖20 g、瓊脂15 g,后定容至1 L,121 ℃下高壓滅菌20 min。液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基的成分相同,但不加瓊脂。

羧甲基纖維素鈉發(fā)酵培養(yǎng)液基:依次稱取羧甲基纖維素鈉5 g、七水合硫酸鎂0.3 g、硫酸銨2 g、蛋白胨3 g、磷酸二氫鉀4 g、NaCl 0.3 g,加入適量的雙蒸水后定容至1 L,121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.3 試樣信息

試樣(Z1-Z9)為貴州省某博物館(ZY)館藏近現(xiàn)代書法、文書。試樣(B10-B19)為貴州省某博物館(BJ)館藏清代、民國時(shí)期書法、繪畫。試樣表面出現(xiàn)紅色、黃色和黑色的色斑,且具有繼續(xù)惡化的趨勢(表1、圖1)。

表1 試樣基本信息

1.4 試樣的理化性質(zhì)分析

針對試樣的病害情況,采用CLEAN pH30型酸堿度計(jì)調(diào)研色斑區(qū)的文物本體酸度值。采用L&W 862型微波水分測定儀調(diào)研文物本體的含水率,為病害微生物的生物學(xué)特性提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)支撐。

1.5 微生物的采集、分離和純化

用浸潤的無菌棉簽在試樣色斑處輕柔旋轉(zhuǎn)摩擦,隨即將棉簽涂抹及接種至適宜微生物生長的無菌牛肉膏蛋白胨和馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基上(圖2),分別置于37和28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別采用平板劃線和點(diǎn)培養(yǎng)法對細(xì)菌和真菌進(jìn)行分離純化。

1.6 微生物的基因鑒定[8-9]

細(xì)菌總DNA的提取采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司基因組DNA提取試劑盒,真菌總DNA的提取采用寶生物工程(大連)有限公司微生物裂解試劑盒。

細(xì)菌擴(kuò)增的引物序列為24F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反應(yīng)體系為50 μL,其中24F和1492R各1 μL、Taq酶0.5 μL、10×PCR緩沖液 5 μL、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4 μL、MgCl24 μL、DNA模板1.5 μL、無菌雙蒸水33 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)條件為①94 ℃預(yù)變性5 min;②94 ℃變性1 min;③55 ℃退火30 s;④72 ℃延伸100 s;⑤重復(fù)上述4個(gè)步驟35個(gè)循環(huán);⑥72 ℃延伸10 min。真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因片段擴(kuò)增的引物序列為ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。PCR反應(yīng)體系為50 μL,其中ITS1和ITS4各1 μL、Taq酶0.4 μL、10×PCR緩沖液5 μL、dNTP 4 μL、MgCl23 μL、DNA模板2 μL、無菌雙蒸水33.6 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)條件為①94 ℃預(yù)變性5 min;②94 ℃變性30 s;③58 ℃退火30 s;④72 ℃延伸90 s;⑤重復(fù)上述4個(gè)步驟35個(gè)循環(huán);⑥72 ℃延伸10 min。

將經(jīng)過酶切驗(yàn)證的質(zhì)粒試樣送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。將得到的細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS序列經(jīng)過DNAMAN 6.0軟件校正后,在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行同源性序列搜索(BLAST search)。

圖1 試樣污漬視圖Fig.1 Stain views of samples

圖2 微生物的采集Fig.2 Collection of microorganisms

1.7 微生物的酶學(xué)性質(zhì)分析

纖維素酶酶活測定:參照中華人民共和國輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB 2583—2003纖維素酶制劑[10-11]。采用二硝基水楊酸(DNS)法:即以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物,取待測酶液0.5 mL,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% CMC-Na 1.5 mL,置于50 ℃水浴中反應(yīng)30 min,加入DNS試劑3.0 mL,搖勻并于沸水中顯色10 min,迅速冷卻后定容至25 mL。在520 nm下,采用紫外分光光度計(jì)測定OD值。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.837 85x-0.014 45,R2=0.999 4。

木聚糖酶酶活測定:參照中華人民共和國輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4483—2013木聚糖酶制劑[12]。采用二硝基水楊酸(DNS)法:即以木聚糖為底物,取待測酶液0.5 mL,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% CMC-Na 1.5 mL,置于50 ℃水浴中反應(yīng)30 min,加入DNS試劑3.0 mL,搖勻并于沸水中顯色10 min,迅速冷卻后定容至25 mL。在520 nm下,采用紫外分光光度計(jì)測定OD值。木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.715 61x-0.010 44,R2=0.999 5。

蛋白酶酶活測定:參照中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999蛋白酶活力測定法[13]。即以酪蛋白為底物,取40 ℃預(yù)熱待測酶液1 mL,加入40 ℃預(yù)熱的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%酪蛋白溶液1 mL,置于40 ℃水浴中反應(yīng)10 min,迅速加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL終止反應(yīng),同時(shí)繼續(xù)水浴中保溫20 min。吸取1 mL經(jīng)12 000 r/min離心機(jī)離心10 min的上清液,與0.4 mol/L NaCO32 mL及福林試劑1 mL混合,置于40 ℃水浴中保溫發(fā)色20 min,迅速冷卻至室溫。在680 nm下,采用紫外分光光度計(jì)測定OD值。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.009 8x+0.001 27,R2=0.999 5。

2 結(jié)果與討論

2.1 試樣的理化性質(zhì)分析

Z1-Z9、B10-B19色斑處本體紙張含水率平均值皆在10%以上,最高達(dá)到18.3%,大部分集中在13%～17%之間(表2),遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了紙張正常含水率水平。這與當(dāng)?shù)爻睗竦臍夂驐l件和不當(dāng)?shù)谋４姝h(huán)境相關(guān)?，F(xiàn)場調(diào)查發(fā)現(xiàn),庫區(qū)內(nèi)未安裝任何溫度、濕度控制等文物保護(hù)的現(xiàn)代化科技設(shè)施。這種館藏環(huán)境條件和當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件給微生物的侵染提供了機(jī)會。據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道,大多數(shù)真菌在0.60～0.98水活度(aw)條件下可以生長,而對于一般真菌,其aw沒有明確的極限值,因?yàn)樗欠浅Ｒ蕾囄锓N的。而對紙張有較大危害的曲霉和青霉可以生長在含水率為7%～8%的本體上,它們在紙張上表現(xiàn)出驚人的生長速度,產(chǎn)生的分生孢子加速了材料的污染。

Z1-Z9色斑處本體紙張的pH平均值在6.2～7.5范圍,B10-B19污漬處本體紙張的pH在4.3～5.6范圍(表2)。微生物在代謝、繁殖中產(chǎn)生的大量有機(jī)酸,如檸檬酸(青霉)、葡萄糖酸(青霉和曲霉)、甲酸、乳酸、延胡羧酸、丙酸、五倍子酸、丁烯二酸(根霉)等黏附于紙質(zhì)文物上[14],會使紙質(zhì)文物一直處于低酸度的環(huán)境,使紙表面呈暗黃色[4],并可能隨著時(shí)間的推移而酸化程度增加。

表2 pH平均值、含水率分析結(jié)果

2.2 微生物的基因鑒定

試樣Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z7、B11、B13、B14、B15、B17、B18、B19污染處黑色色斑占69%、黃色色斑占46%、紅色色斑占31%,分離得到可培養(yǎng)物包括33株細(xì)菌和42株真菌,通過鑒定實(shí)際得到16種細(xì)菌和8種真菌;試樣Z6、Z8、Z9、B10、B12、B16污漬處未得到可培養(yǎng)物。從細(xì)菌鑒定結(jié)果(表3)看,侵染紙質(zhì)文物的細(xì)菌主要是芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬和考克氏菌屬。其中芽孢桿菌屬占33%、假單胞菌屬占11%、伯克氏菌屬占11%、考克氏菌屬占11%。從真菌鑒定結(jié)果(表4)看,侵染紙質(zhì)文物的真菌主要是青霉屬、曲霉屬和雙聚散霉屬。其中花斑曲霉F-WY-12-11占21%,青褐雙聚散霉CBS 407.87占21%,產(chǎn)黃青霉PO22占17%,產(chǎn)黃青霉MS15占13%,花斑曲霉ATCC 9577菌株占13%。據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道,曲霉屬和青霉屬真菌是侵染紙質(zhì)文物常見的菌株。青褐雙聚散霉尚未在紙質(zhì)文物侵染菌中報(bào)道過,試樣Z1、Z3、Z4、Z5、B11中同時(shí)被檢測出,這可能與當(dāng)?shù)氐臍夂颦h(huán)境有關(guān)。

表3 細(xì)菌鑒定結(jié)果

表4 真菌鑒定結(jié)果

2.3 微生物的酶學(xué)性質(zhì)分析

微生物屬于異養(yǎng)型生物,主要依靠酶學(xué)系統(tǒng)將胞外的高分子水解成能被微生物的細(xì)胞膜所吸收的小分子物質(zhì)。紙質(zhì)文物是有機(jī)質(zhì)文物,主要化學(xué)成分是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素,它們?nèi)咧g形成強(qiáng)大的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。書畫文物上作為鑲料的絹絲也常成為微生物的侵染對象。唐歡等[15]報(bào)道木霉屬、青霉屬能產(chǎn)生高活性的纖維素酶。據(jù)文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道,纖維素酶水解纖維素有很多限制因素,但木聚糖酶對半纖維素中木聚糖組分的酶解有利于纖維素酶的水解作用。Lpez-Miras等[18]采用API-ZYM系統(tǒng)對從油畫上分離得到的細(xì)菌和真菌的酶活進(jìn)行了測定。仲雨薇[19]分析了霉斑處碳水化合物的含量,推得霉菌會使紙張中不溶性的纖維素、半纖維素降解成一些可溶性化合物,從而使得被污染處脆化斷裂。所以,研究微生物的酶活性及作用是研究微生物致病機(jī)制的一個(gè)重要方面。為了定量評估分離得到微生物的代謝和破壞能力,測定纖維素酶和木聚糖酶酶活用以了解微生物對纖維素的降解活力,測定蛋白酶酶活用以了解微生物對蛋白質(zhì)的降解活力。細(xì)菌的酶活在細(xì)菌OD600為1.1±0.1條件下測定(圖3(a)),真菌的酶活在真菌菌體干質(zhì)量為(2.4±0.1) g條件下測定(圖3(b))。結(jié)果顯示:細(xì)菌的纖維素酶酶活和蛋白酶酶活數(shù)值皆較低,木聚糖酶酶活為零可忽略不計(jì);芽孢桿菌屬的纖維素酶酶活最高,可達(dá)2.96 U/mL,動性球菌屬的蛋白酶酶活最高,可達(dá)4.73 U/mL。真菌的纖維素酶酶活和木聚糖酶酶活相對較高,蛋白酶酶活為零可忽略不計(jì);曲霉屬的纖維素酶酶活和木聚糖酶酶活皆高于其他菌屬,可達(dá)18.70和38.02 U/mL;青霉屬的酶活次之。由此可知:真菌由于具有較高的代謝酶活較細(xì)菌生長繁殖快;真菌中的曲霉屬和青霉屬酶活總體水平較高,故而成為降解館藏紙質(zhì)文物的主要優(yōu)勢微生物。環(huán)境中的微生物會在被侵染的材料表面形成生物膜結(jié)構(gòu),不同微生物之間會釋放不同信號以相互“溝通”,例如,芽孢桿菌屬的細(xì)菌屬于產(chǎn)黏液菌,喜好分泌多糖、脂質(zhì)、腐殖質(zhì)、蛋白以及核酸的混合物,真菌則會釋放一些有機(jī)酸如草酸和檸檬酸等螯合劑[20]。因此,細(xì)菌和真菌在微生物致病中起到不同的作用,形成協(xié)同或競爭代謝。

圖3 細(xì)菌和真菌酶活測定結(jié)果Fig.3 Enzyme activity results of bacteria and fungi

3 結(jié)論

本研究檢測了貴州省館藏紙質(zhì)文物本體的酸度值、含水率;采用無損采樣方法,從紙表色斑分離、純化并鑒定了微生物的菌屬;測定了分離得到細(xì)菌和真菌的纖維素酶酶活、木聚糖酶酶活和蛋白酶酶活表征“生物退化”活性。

試驗(yàn)表明:1)貴州省館藏紙質(zhì)文物本體含水率較高、本體偏酸性,館藏環(huán)境條件和當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件是導(dǎo)致微生物病害的主要因素;2)實(shí)驗(yàn)中共分離得到33株細(xì)菌和42株真菌,通過鑒定實(shí)際得到16種細(xì)菌和8種真菌,芽孢桿菌屬、曲霉屬、青霉屬和雙聚散霉屬是侵染當(dāng)?shù)丶堎|(zhì)文物的優(yōu)勢菌屬;3)細(xì)菌的纖維素酶酶活和蛋白酶酶活數(shù)值普遍偏低,真菌的纖維素酶酶活和木聚糖酶酶活相對較高,細(xì)菌和真菌對紙質(zhì)文物都有降解能力,但以曲霉屬和青霉屬的真菌為主。

紙質(zhì)文物因其有機(jī)組成成分和吸濕性,更易遭到微生物侵染而“生物退化”。隨著預(yù)防性保護(hù)理念的日益深入,找出制約微生物侵染而造成“生物退化”的關(guān)鍵因子將成為預(yù)防性保護(hù)研究的關(guān)鍵。本研究為揭示館藏紙質(zhì)文物生物退化的關(guān)鍵因子提供了相關(guān)的數(shù)據(jù)支撐,為后續(xù)預(yù)防性保護(hù)工作提供依據(jù)。