劉慧 邵珊珊 黃錕 嚴(yán)雙琴 劉雨薇 朱鵬 郝加虎 陶芳標(biāo)

小于胎齡兒(small for gestational age,SGA)是指出生體重低于同胎齡出生體重第10百分位數(shù)或2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的活產(chǎn)兒，發(fā)生率約為8%～13%[1]。與適于胎齡兒(appropriate for gestational age infant,AGA)相比，SGA的圍產(chǎn)期患病率和死亡率較高，兒童期發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良、認(rèn)知行為異常以及成年后罹患高血壓、糖尿病等心腦血管和代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是胎盤血管生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及活化[3-4]，已有研究證實(shí)SGA胎盤VEGFA表達(dá)降低[5]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)對(duì)基因表達(dá)和功能可產(chǎn)生著重要影響，VEGFA基因變異或可通過(guò)改變VEGFA基因表達(dá)或VEGFA分泌影響胎盤血管生成導(dǎo)致SGA的發(fā)生。然而，目前相關(guān)研究較為少見(jiàn)。本研究采用巢式病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì)探討了VEGFA基因多態(tài)性與SGA易感性的關(guān)聯(lián)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：研究對(duì)象均來(lái)自馬鞍山優(yōu)生優(yōu)育隊(duì)列，該隊(duì)列納入了于2013年5月到2014年9月在馬鞍山婦幼保健院建冊(cè)并計(jì)劃在該院分娩的孕婦共3 474例。在隊(duì)列的單胎活產(chǎn)中共篩選出318例分娩SGA且無(wú)妊娠并發(fā)癥(高血壓或糖尿病)的母親，按照1:1.5隨機(jī)選取477例分娩AGA且無(wú)妊娠并發(fā)癥的母親作為AGA組，但僅有183例SGA母親和298例AGA母親提供了靜脈血樣本。因此，本研究共納入481例孕婦，其中SGA組183例，AGA組298例。本項(xiàng)目已通過(guò)安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查(批號(hào)：20170283)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

2.診斷標(biāo)準(zhǔn)：SGA為出生體重低于同胎齡嬰兒平均體重的第10百分位的嬰兒，AGA為出生體重位于同胎齡嬰兒平均體重的第10百分位至第90百分位的嬰兒[6]。

3.問(wèn)卷調(diào)查：包括母親年齡、文化程度、吸煙、飲酒、家庭月收入、母親孕前體重指數(shù)(body mass index,BMI)和父親BMI等。

4. SNP的選擇及基因分型：使用QIAamp DNA Investigator試劑盒提取靜脈血DNA?；贜CBI官方網(wǎng)站采用以下步驟篩選VEGFA基因上的潛在功能性SNP位點(diǎn)。首先，篩選位于3′UTR、5′UTR或編碼區(qū)的錯(cuò)義突變、移碼突變；然后，選擇其中在中國(guó)漢族人群中的最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)≥ 0.1的位點(diǎn)；最后，進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)，保留高度連鎖(r2≥0.8)位點(diǎn)中的一個(gè)進(jìn)行研究。最終納入7個(gè)SNPs(rs2010963、rs833061、rs10434、rs1570360、rs3025020、rs3025040、rs3025053)。使用上海天昊生物科技有限公司的imLDRTM多重SNP分型試劑盒進(jìn)行基因分型，ABI3730XL分析儀進(jìn)行測(cè)序，GeneMapper 4.1軟件(Applied Biosystems,USA)分析基因型。為保證基因分型的準(zhǔn)確性，對(duì)5%的樣本實(shí)施雙盲檢測(cè)。

結(jié)果

1.研究對(duì)象一般情況：如表1所示，兩組研究對(duì)象在母親年齡、文化程度、吸煙、飲酒、家庭月收入和父親BMI的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是SGA組母親孕前BMI顯著低于AGA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 481例研究對(duì)象的基本特征

2.VEGFA基因多態(tài)性與SGA易感性的關(guān)聯(lián)分析：除VEGFArs3025053外，其余位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，納入后續(xù)分析。如表2所示，rs2010963位點(diǎn)的CC、GC和GG基因型在SGA組和AGA組的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他位點(diǎn)在兩組之間的基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。調(diào)整母親年齡、文化程度、吸煙、飲酒、家庭月收入后，與攜帶rs2010963 CC基因型孕婦相比，攜帶GC基因型的孕婦分娩SGA的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加(共顯性模型：OR=1.94，95%CI=1.12～3.35)；攜帶GC/GG基因型的孕婦分娩SGA的風(fēng)險(xiǎn)也顯著增加(顯性模型：OR=1.69，95%CI=1.01～2.83)。敏感性分析進(jìn)一步校正母親孕前BMI和父親BMI后，結(jié)果仍有顯著性(顯性模型：OR=1.75，95%CI=1.03～2.98)。但是，經(jīng)FDR校正后rs2010963變異與SGA易感性關(guān)聯(lián)的顯著性消失(P=0.222)?；?000 Genome database(https://www.internationalgenome.org/)公共數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到rs2010963位點(diǎn)在中國(guó)漢族人群中的MAF為0.440。隨后根據(jù)Power 3.0計(jì)算[7]，對(duì)于rs2010963位點(diǎn)在中國(guó)漢族人群中的MAF為0.440，在α=0.05 的檢驗(yàn)水平下，SGA發(fā)病率為10%時(shí)，本研究的樣本量有78%把握度能檢驗(yàn)出OR=1.7的關(guān)聯(lián)性。未發(fā)現(xiàn)其他5個(gè)SNP位點(diǎn)與SGA發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間有顯著關(guān)聯(lián)性。

討論

VEGFA基因位于染色體6p21.3，其編碼蛋白是一種強(qiáng)有力的血管內(nèi)皮生成因子,可影響血管通透性，調(diào)節(jié)早期胎盤血管的發(fā)育[3]。本研究結(jié)果提示，孕婦攜帶VEGFArs2010963 G等位基因可能會(huì)增加分娩SGA的風(fēng)險(xiǎn)。之前有一項(xiàng)基于澳大利亞和新西蘭人群的研究探討了VEGFArs699947和rs3025039與SGA關(guān)聯(lián)性，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其與SGA相關(guān)[5]。本研究在中國(guó)漢族人群中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與VEGFArs3025039高度連鎖的rs3025040與SGA顯著相關(guān)。

目前雖然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)VEGFArs2010963與SGA易感性的報(bào)道，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于VEGFArs2010963與低出生體重和子癇前期的研究已較多。BanyaszI等[8]在128例低出生體重兒和200例健康足月兒中開展的巢式病例對(duì)照研究，結(jié)果顯示VEGFArs2010963 C等位基因增加了嬰兒低出生體重的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。這與本研究發(fā)現(xiàn)G等位基因會(huì)增加SGA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是相反的。VEGFArs2010963多態(tài)性對(duì)子癇前期的影響在不同研究間也存在不一致性。在中國(guó)[9]和匈牙利[10]人群中，攜帶rs2010963 G等位基因的母親對(duì)子癇前期的易感性降低，但在菲律賓[11]和突尼斯[12]人群中發(fā)現(xiàn)該等位基因與子癇前期無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。遺傳背景的種族差異可能是導(dǎo)致不同研究結(jié)果的重要因素。rs2010963的G等位基因在中國(guó)人群、歐洲人群和美國(guó)人群的頻率分別為0.596、0.720和0.628。此外，環(huán)境因素沒(méi)有被充分考慮和控制也可能是各研究結(jié)果不一致的原因。

表2 VEGFA位點(diǎn)多態(tài)性與SGA易感性的多因素Logistic回歸模型分析

本研究采用巢氏病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)探討了母親VEGFA遺傳變異與SGA易感性的關(guān)系，結(jié)果提示攜帶G等位基因的孕婦分娩SGA的風(fēng)險(xiǎn)增加。但存在以下局限性。首先，經(jīng)過(guò)FDR校正后，rs2010963變異對(duì)SGA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響無(wú)顯著性，雖然在本研究的樣本量之下，有78%的把握度檢驗(yàn)出rs2010963變異與SGA易感性的關(guān)聯(lián)性，但是對(duì)于MAF較小的位點(diǎn)，本研究的樣本量所能達(dá)到的把握度有限，需要更大的樣本再次驗(yàn)證。其次，本研究缺乏rs2010963致VEGFA表達(dá)下調(diào)或功能損害的直接證據(jù)。VEGFA遺傳變異與SGA易感性的研究有待進(jìn)一步的深入探討。