李得春 王艷國(guó) 吳滌

隨著社會(huì)的發(fā)展和生活環(huán)境的變化，不孕不育已經(jīng)成為了重要的公共衛(wèi)生問題，據(jù) WHO 的統(tǒng)計(jì)，全球大約有15%的夫婦受此困擾，其中約40%～56%是由男性原因?qū)е碌牟辉胁挥?，并有持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1-5]，其中男性精液質(zhì)量異常屬于主要原因[6]。據(jù)報(bào)道約24%的低生育率與弱精子癥直接相關(guān)[7-9]。目前，認(rèn)為男性低生育率的產(chǎn)生多數(shù)由參與精子發(fā)生過程的相關(guān)基因的突變而導(dǎo)致[10]。研究發(fā)現(xiàn)，ESR2基因多態(tài)性與男性不育相關(guān)，但眾多學(xué)者研究結(jié)論尚不完全一致，在伊朗人群[11]和日本人群[12]中rs4986938位點(diǎn)的等位基因頻率差異都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在中國(guó)臺(tái)灣人群[13]中與精液濃度有關(guān)，而在中國(guó)河南漢族人群[14]中可能與男性不育的發(fā)生相關(guān)。針對(duì)男性弱精子癥情況，本研究通過測(cè)定中國(guó)內(nèi)蒙古包頭地區(qū)弱精男性不育患者ESR2基因rs4986938的多態(tài)性，探討ESR2基因多態(tài)性與弱精子癥男性不育的關(guān)系。

資料與方法

1.一般資料：收集包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2018—2019年202名男性就診者資料，由有經(jīng)驗(yàn)的流行病學(xué)專家設(shè)計(jì)統(tǒng)一調(diào)查問卷，由經(jīng)過培訓(xùn)的調(diào)查員逐一詢問獲得詳細(xì)的人口統(tǒng)計(jì)資料及出行方式、睡眠時(shí)間、吸煙、體育鍛煉時(shí)間、工作地點(diǎn)、家裝木地板及板材家具裝修狀況等，其中包括文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)男性生殖有影響的消毒劑[15]等內(nèi)容。

2.研究對(duì)象確定：選取2018年1月—2019年3月期間于包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的弱精癥患者標(biāo)本78例作為弱精組，年齡范圍26～44歲，平均年齡(31.2±4.9)歲。正常精液患者標(biāo)本124例為對(duì)照，年齡23～49歲，平均年齡(30.3±5.2)歲。兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。其中至少2次精液常規(guī)分析確定為弱精子癥的入組(參照WHO第5版手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn))[16]前向運(yùn)動(dòng)精子(PR)+非前向運(yùn)動(dòng)精子(NP)< 40% 或 PR< 32%，所有標(biāo)本均排除生殖道感染、精索靜脈曲張、激素水平異常及系統(tǒng)性疾病等。

3.血樣收集和DNA提?。撼槿§o脈血，置于EDTA抗凝管中，-20℃保存，采用基因組DNA提取試劑盒(天根血液基因組DNA提取試劑盒)提取全血基因組DNA，具體步驟按試劑盒說明書操作。

4. PCR擴(kuò)增,基因型檢測(cè)：PCR擴(kuò)增引物(rs4986938)(F：5′-GGTCCCAGTGTATGACCTGC-3′，R：5′-AAGGTGGAGGGAAGGATGGT-3′)。PCR反應(yīng)體系中含有2.5 μM上游引物1.0 μL，2.5 μM下游引物1.0 μL，DNA 1 uL，TaKaRa LA Taq 0.5 μL，dNTP mixture 2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，加ddH2O至25 uL。PCR反應(yīng)條件為94℃，5 min；94℃，30 sec；60℃，30 sec；72℃，40 sec；循環(huán)35次，最后一次72℃延伸5 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。rs4986938位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物片段是291 bp。PCR產(chǎn)物送通用生物技術(shù)有限公司采用Sanger雙脫氧測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，有三種基因型，即GG、GA、AA。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以百分比表示計(jì)數(shù)資料；各基因型的分布、等位基因頻率的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)，評(píng)估基因突變對(duì)該疾病發(fā)生的相對(duì)危險(xiǎn)度；非正態(tài)計(jì)量資料用秩和檢驗(yàn)；采用Logistic回歸法排除混雜因素，分析ESR2基因型多態(tài)性與弱精子癥男性不育的關(guān)系。

結(jié)果

1.一般特征比較：在202例研究對(duì)象中，弱精癥患者78名、正常精液男性體檢者124名。χ2檢驗(yàn)顯示，兩組在工作地點(diǎn)和吸煙方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

弱精組和正常組比較，精子總活力、前向運(yùn)動(dòng)力、精子活力、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子、非前向運(yùn)動(dòng)精子、不動(dòng)精子等指標(biāo)經(jīng)秩和檢驗(yàn)有顯著性差異，見表2。

表1 研究對(duì)象的一般情況比較 [例(%)]

表2 研究對(duì)象的精子情況比較

2. ESR2基因rs4986938位點(diǎn)PCR產(chǎn)物：下圖是ESR2基因rs4986938位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增片段是291 bp，見圖1。

圖1 ESR2 rs4986938 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖(擴(kuò)增產(chǎn)物291 bp)

3. ESR2基因rs4986938位點(diǎn)等位基因及基因型頻率分布：ESR2基因rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性有三種基因型，即GG、AG、AA。弱精組ESR2基因rs4986938位點(diǎn)GG基因型頻率為73.1%，低于對(duì)照組(87.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。弱精組中AA 基因型頻率為5.1%，與對(duì)照組(1.6%)無顯著差異。此外，弱精組患者 AG基因型頻率為 21.8%，高于對(duì)照組(11.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在弱精組中，ESR2 基因rs4986938的A等位基因頻率為16.0%，高G等位基因頻率為84.0%。A等位基因頻率高于對(duì)照組(7.3%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 兩組患者rs4986938位點(diǎn)基因及基因型頻率分布 [例(%)]

弱精癥雜合子基因測(cè)序圖灰色區(qū)域代表突變堿基，見圖2。

圖2 ESR2基因rs4986938位點(diǎn)雜合子基因測(cè)序圖

4. ESR2基因rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與弱精男性不育的關(guān)系分析結(jié)果：在調(diào)整吸煙、工作地方等影響因素后，GA+AA基因型與GG基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；具有GA和AA基因型者，男性不育的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低(OR=0.41,95%CI:0.20～0.86)，結(jié)果見表4。

表4 ESR2基因rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與弱精男性不育的關(guān)系 [例(%)]

討論

男性的優(yōu)勢(shì)激素為雄激素，但是男性體內(nèi)雌激素的水平會(huì)直接影響雄激素的水平，雌激素主要是通過雌激素受體來實(shí)現(xiàn)其作用[17]。雌激素受體有兩種，ESR1和ESR2。其中ESR2主要分布在睪丸、前列腺、卵巢、松果體、甲狀腺、淋巴組織、尿道中[18-19]，研究顯示，ESR2是卵泡發(fā)育和精子發(fā)育過程中的雌激素發(fā)揮功能的介導(dǎo)物[20]，所以，ESR2與男性不育相關(guān)研究較多[21-22]。雌激素受體2是由ESR2基因編碼的，ESR2基因定位于14q22-24，全長(zhǎng)約40 kb，包括8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，編碼530個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。ESR2基因rs4986938位點(diǎn)位于ESR2基因的第8外顯子的3′非編碼區(qū)第1730號(hào)核苷酸，rs4986938位點(diǎn)由G突變?yōu)锳，因其處于非編碼區(qū)，可能會(huì)影響ESR2的表達(dá)和功能，進(jìn)而影響雌激素的生理功能[23]。

本文分析了近年中國(guó)內(nèi)蒙古包頭地區(qū)弱精癥男性不育患者的ESR2基因SNPrs4986938多態(tài)性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)由于AA基因型數(shù)量較少，故將GA基因型與AA基因型數(shù)量合并后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。經(jīng)Logistic回歸分析，GA+AA基因型頻率顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在調(diào)整有影響的混雜因素后，結(jié)果提示GA+AA基因型與GG基因型比較可以降低包頭地區(qū)弱精癥男性的不育風(fēng)險(xiǎn)，這與其他學(xué)者的相關(guān)研究有一定的不同。2010年，有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)伊朗人群此位點(diǎn)的等位基因在對(duì)照組與病例組中的頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2011年中國(guó)臺(tái)灣學(xué)者[13]發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)的多態(tài)性與精液濃度有關(guān)。而本文所得結(jié)果可能與種族、生活的環(huán)境以及生活的方式不同等因素造成。另外，本研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，弱精人群和正常組比較戶外和室內(nèi)的工作地點(diǎn)有差異，可能因長(zhǎng)期接受紫外線照射可造成DNA的損傷；其次，這可能與包頭是一座重工業(yè)城市有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)每天吸煙大于20支在弱精組和正常組之間有顯著性差異，這與多數(shù)學(xué)者研究相符[24-26]。

本研究提示，ESR2基因SNPrs4986938位點(diǎn)GA+AA基因型可降低弱精癥男性不育風(fēng)險(xiǎn)，ESR2基因rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性可能與包頭地區(qū)漢族人群中弱精子癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，由于本研究實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量有限，可能導(dǎo)致本研究結(jié)果具有一定的局限性。更多有利于臨床研究的數(shù)據(jù)還需進(jìn)一步加大樣本量研究并驗(yàn)證，以闡明ESR2基因多態(tài)性在弱精男性不育中的作用機(jī)制，為男性不育提供理論依據(jù)。