祝 玉 吳 瑋 謝錦瑩 周順婷 黃閩嘉 羅志強 周書文

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，廣東湛江，524000

營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa，EB)是一組以皮膚和(或)黏膜脆性增加為特征的罕見遺傳病，可發(fā)生于局部或全身。它是由編碼不同蛋白質(zhì)的基因突變引起的，這些蛋白質(zhì)主要與真皮-表皮連接的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。根據(jù)皮膚裂隙水平(從上到下)分為四種類型：單純型(EBS，epidermolysis bullosa simplex)、交界型(JEB，junctional epidermolysis bullosa)、營養(yǎng)不良型(DEB)和Kinder綜合征(KS)。分子遺傳學(xué)表明，位于染色體3p21的COL7A1基因(C7)為DEB的致病基因[1]。本文通過基因測序確診2例來自一個廣東DEB家系的患者，并發(fā)現(xiàn)了位于86號外顯子的基因突變位點。

1 臨床資料及家系調(diào)查

先證者，女，廣東廉江人，51歲。雙脛前反復(fù)結(jié)節(jié)、水皰，伴瘙癢40余年就診?；颊咦?0歲以來雙脛前反復(fù)出現(xiàn)丘疹和水皰，慢慢演變成結(jié)節(jié)和色素沉著，瘙癢明顯，逐漸雙上肢也出現(xiàn)類似皮損。皮膚科情況：雙側(cè)小腿見密集分布孤立暗紅色結(jié)節(jié)，部分中央結(jié)痂，見少部分丘疹，無水皰。雙側(cè)大腿可見散在紅色丘疹、結(jié)節(jié)，部分中央結(jié)痂，無水皰。雙上肢可見散在紅色丘疹，部分表面結(jié)痂。趾甲可見甲增厚、表面凹凸不平和甲萎縮(圖1)。組織病理：正角化過度，表皮略肥厚，表皮突消失，見表皮下裂隙，真皮淺層膠原纖維增生致密，見少許淋巴組織細胞和漿細胞浸潤(圖2)。免疫熒光：基底膜帶IgG、IgA、IgM及C3均陰性。初步診斷為大皰性表皮松解癥。予阿維A膠囊20 mg日2次，復(fù)方甘草酸苷片50 mg日3次，復(fù)方醋酸曲安奈德溶液及鹵米松/三氯生乳膏外用治療，效果不佳，目前正在隨訪中。

圖1 先證者臨床照片 1a、1b:雙上肢散在多發(fā)丘疹，部分中央結(jié)痂，伴脫屑；1c、1d:雙側(cè)小腿可見密集分布紅色丘疹、結(jié)節(jié)，部分融合。雙側(cè)大腿可見散在多發(fā)紅色丘疹，部分中央結(jié)痂;1e:趾甲可見甲增厚、表面凹凸不平和甲萎縮 圖2 先證者組織病理：正角化過度，表皮突消失，見表皮下裂隙，真皮淺層膠原纖維增生致密(HE，×200)

先證者胞妹，44歲，雙下肢丘疹、結(jié)節(jié)30余年，伴輕微瘙癢?；颊咦?0歲以來雙下肢丘疹、結(jié)節(jié)，伴輕微瘙癢。皮膚科情況：雙側(cè)小腿和足背可見密集分布類圓形丘疹、結(jié)節(jié)，部分呈線狀排列，背部和右側(cè)肘關(guān)節(jié)伸側(cè)見散在多發(fā)皮色扁平丘疹，無水皰。10趾甲可見甲增厚、表面凹凸不平和甲萎縮(圖3)。

3a、3b:雙側(cè)小腿密集分布類圓形丘疹、結(jié)節(jié)，部分融合成線狀，雙側(cè)脛前可見片狀色素減退;3c:雙足背可見密集分布類圓形丘疹、結(jié)節(jié)，雙側(cè)趾甲可見甲營養(yǎng)不良

先證者的父親和胞妹的兒子亦有類似癥狀，母親、其余兩個姐妹和其子女無類似癥狀。該家系4代20名成員，發(fā)現(xiàn)有4例患者(圖4)，父母否認近親結(jié)婚。根據(jù)家系調(diào)查結(jié)果，該病的遺傳方式為常染色體顯性遺傳。

4a:家系圖(4代20名成員，發(fā)現(xiàn)有4例患者，分別為先證者及其父親、妹妹和外甥)，箭頭示先證者；4b：先證者及其胞妹測序分析提示：雜合突變，位于外顯子86上的c.6761G>A；p.Gly2254Glu(上方為先證者，下方為其胞妹)

2 基因檢測

2.1 經(jīng)患者知情同意后，取患者及其胞妹的外周靜脈血各6 mL，標(biāo)本送至深圳華大臨床檢驗中心，采用芯片捕獲高通量方法對先證者進行DNA基因全外顯子直接測序。檢測區(qū)域：人類基因組中約2萬個基因的外顯子區(qū)；檢測策略：針對受檢者主訴，對OMIM(0nline Mendelian Inheritance in Man)數(shù)據(jù)庫收錄的明確致病關(guān)系基因進行分析；檢測方法：芯片捕獲高通量測序。

2.2 對先證者及其胞妹的外周血DNA用Sanger測序驗證突變位點。

3 結(jié)果

3.1 先證者 在先證者COL7A1基因外顯子86上檢出一個與受檢者臨床表型相關(guān)的意義未明變異c.6761G>A；p.Gly2254Glu(圖4)，根據(jù)ACMG(American College of Medical Genetics and Genomics)指南，該變異被判斷為意義未明變異。采用Sanger測序驗證突變位點的結(jié)果顯示為一雜合突變。

3.2 患病胞妹 采用Sanger測序驗證突變位點的結(jié)果與先證者一致：c.6761G>A；p.Gly2254Glu，為雜合突變。

4 討論

EB是指皮膚或黏膜受到輕微外傷后即可引起水皰的一組異質(zhì)的罕見遺傳性皮膚病，包括三個主要類型(單純型EB、交界型EB、營養(yǎng)不良型EB)和一種罕見變異型(Kinder綜合征，即肢端角化性皮膚異色病)，共分為至少20種臨床亞型。角蛋白5和7、層粘連蛋-332、Ⅶ型膠原、大皰性類天皰瘡抗原2、網(wǎng)格蛋白、整合素等7個靶蛋白中任何一個基因突變均可導(dǎo)致一種EB的發(fā)生。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可導(dǎo)致EB發(fā)生的基因有19個，其中編碼Ⅶ型膠原的COL7A1基因突變導(dǎo)致營養(yǎng)不良型EB的發(fā)生[2]。營養(yǎng)不良型EB分為常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳，顯性營養(yǎng)不良型EB(dominant dystrophic epidermolysis bullosa，DDEB)是由于Ⅶ型膠原蛋白發(fā)生負顯性突變，突變點位于蛋白中糖基結(jié)合點，并不導(dǎo)致Ⅶ型膠原蛋白的截斷，只是導(dǎo)致皮膚結(jié)構(gòu)的異常，比如皮膚脆性增加、錨原纖維數(shù)量異常等。相反，隱性營養(yǎng)不良型EB(recessive dystrophic epidermolysis bullosa，RDEB)是Ⅶ型膠原蛋白的復(fù)合雜合子突變，提前出現(xiàn)的終止密碼子導(dǎo)致蛋白的截斷，從而導(dǎo)致Ⅶ型膠原的合成不穩(wěn)定。從分子水平上看，本患者為編碼Ⅶ型膠原的COL7A1基因外顯子86上的錯義點突變，沒有導(dǎo)致Ⅶ型膠原蛋白的截斷，家系遺傳圖譜也顯示為常染色體顯性遺傳，符合DDEB的診斷。

與RDEB相比，DDEB一般臨床表現(xiàn)較輕微[3]，多在嬰兒早期或兒童期發(fā)病，水皰及大皰多位于四肢伸側(cè)，尤其是關(guān)節(jié)部位，尼氏征常為陰性，愈后形成粟丘疹和瘢痕。因為是蛋白合成異常所致，不是自身抗體的原因，因此免疫熒光是陰性的。DDEB分為以下亞型：肢端型、脛前型、癢疹型、僅指甲受累型及新生兒大皰性表皮松解型，其變異型包括白色丘疹樣型和增生型。其中癢疹型DDEB表現(xiàn)為劇烈瘙癢性的紫紅色丘疹和結(jié)節(jié)，輕度水皰或糜爛，呈線狀排列，主要發(fā)生在脛前、前臂，少數(shù)發(fā)生在軀干，以及趾甲的萎縮變性，嬰兒或兒童期發(fā)病。與本例兩姐妹均在10歲左右發(fā)病，皮疹分布部位和皮疹特點都是相符的。結(jié)合臨床、病理(表皮下裂隙，免疫熒光陰性)和分子遺傳特點，符合癢疹型DDEB。

Masunaga等[4]總結(jié)了DEB的突變位點，提出隱性病例的突變分布于從N端到C端的整個VII型膠原。而與隱性病例相比，顯性病例的突變位于COL7A1基因的末端，主要為甘氨酸替代突變。本例患者基因檢測顯示為甘氨酸被谷氨酸替代，與文獻報道相符。本文中先證者及其胞妹COL7A1基因存在第6761位堿基G→A突變，導(dǎo)致第2254位甘氨酸替代，從而影響Ⅶ型膠原三螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)Gly-X-Y重復(fù)序列，破壞了三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Clin Var數(shù)據(jù)庫記錄有該位點信息(c.6761G>A；p.Gly2254Glu)，并評估為致病性變異。目前為止，只有2例國外文獻報道了位于外顯子86上的甘氨酸替代突變，分別是c.6797G>T(p.Gly2266Val)和c.6752G>A(p.G2251E)，前者純合突變來自一個索馬里家庭[5]，后者雜合突變來自一個日本家庭[6]。經(jīng)搜索PubMed和萬方數(shù)據(jù)庫，國外報道并進行基因檢測的DDEB共54例(表1)，其中44例為甘氨酸替代突變，并且44例甘氨酸替代突變中以位于外顯子73最多(23例)，外顯子87次之(4例)。因此國外常見的DDEB點突變位于外顯子73。國內(nèi)報道并進行基因檢測的DDEB共10例(表2)，其中9例為甘氨酸替代突變，而9例甘氨酸替代突變中有4例位于73號外顯子。國內(nèi)外DDEB以位于COL7A1基因73號外顯子的點突變最常見，本例突變位于86號外顯子，國內(nèi)尚未見報道。

表1 國外報道的DDEB突變位點

續(xù)表

表2 國內(nèi)報道的DDEB突變位點

綜上，我們報道來自廣東-DEB家族的COL7AI基因外顯子86號上的雜合突變：c.6761G>A;p.Gly2254Glu，這一點突變是國內(nèi)外首次報道。