鄒銳濤 蔡桂月 陳曉旋 肖 鏗 樊志金 陳嶸祎

1廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州， 523024；2南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東廣州，510091

惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是起源于黑素細(xì)胞的一種惡性腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)，如不及時(shí)治療預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。在現(xiàn)階段，MM常規(guī)治療的療效不佳，其中手術(shù)僅對早期治療有效。近年來，免疫治療在MM中發(fā)揮著越來越重要的角色。目前，應(yīng)用在MM中的免疫治療主要有：免疫檢查點(diǎn)抑制劑(PD-1和CTLA-4等單克隆抗體)；細(xì)胞因子(IL-2，IFN-α-2b等)；溶瘤病毒(溶瘤病毒T-VEC)；腫瘤疫苗(肽疫苗、DC疫苗等)；過繼性細(xì)胞療法(腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞療法、工程T細(xì)胞受體治療、嵌合抗原受體T細(xì)胞療法、NK細(xì)胞療法等)[2]。其中，過繼性細(xì)胞療法是近幾年來在腫瘤免疫治療中的一大熱點(diǎn)。

過繼性細(xì)胞療法(adoptive cell therapy，ACT)是通過收集患者體內(nèi)的免疫細(xì)胞，經(jīng)過體外激活或基因修飾，擴(kuò)增至足夠數(shù)量時(shí)并選擇具有腫瘤靶向的免疫細(xì)胞，再回輸?shù)綑C(jī)體從而起到抗腫瘤的一種新型的免疫治療方法[3,4]。這些免疫細(xì)胞可來源患者外周血淋巴細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)或淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(Lymphokine activated killer cell, LAK)。嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(CAR-T)是對外周血中淋巴細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選T細(xì)胞后再進(jìn)行基因編輯成CAR-T，對于腫瘤治療具有精準(zhǔn)、快速、高效，但對于實(shí)體瘤的治療效果欠佳，在MM治療中的研究較少；TIL是從腫瘤組織中提取出來的，這類淋巴細(xì)胞具有精準(zhǔn)識別腫瘤細(xì)胞的能力，能夠有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，對于轉(zhuǎn)移性黑素瘤具有較好的治療效果[5-7]。但是TILs量少，分離困難，很多情況下是功能耗竭的，無法發(fā)揮正常的抗腫瘤作用，發(fā)展新的淋巴細(xì)胞來源具有重要意義。

本研究通過構(gòu)建黑素瘤小鼠模型，提取荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，與黑素瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與正常脾臟淋巴細(xì)胞相比，來自黑素瘤小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞具有更明顯的抑瘤現(xiàn)象，通過對兩組淋巴細(xì)胞進(jìn)行活化刺激，也發(fā)現(xiàn)黑素瘤小鼠來源的脾臟淋巴細(xì)胞分泌更高的腫瘤殺傷因子。脾臟淋巴細(xì)胞易獲取、數(shù)量多，這一研究發(fā)現(xiàn)或許為MM的過繼性細(xì)胞療法提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 黑素瘤細(xì)胞系B16購自上海蓋寧生物科技有限公司，雌性C57BL/6小鼠，SPF級，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；在南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 北美胎牛血清、1640培養(yǎng)基、0.25% Trypsin-EDTA (1X)0.25% Trypsin-EDTA (1X)胰酶(美國Gibco公司)；PD-1、Granzyme B、perforin、GAPDH一抗、β-actin一抗(美國Cell Signaling Technology公司)；Cyanine5-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD8、PE-抗小鼠CD4、PE-cy7抗小鼠Granzyme B、PE-抗小鼠perforin單克隆熒光抗體(美國Biolegend公司)； CCK8試劑盒(同仁化學(xué)/DOJINDO)；Calcein/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒、山羊抗兔二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒、紅細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);刀豆蛋白A、Hass緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)；TNF-α、IFN-γ ELISA試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑素瘤細(xì)胞系B16，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長至70%～80%時(shí)，使用胰酶消化后傳代以及液氮凍存保種。

1.2.2 荷瘤小鼠模型構(gòu)建 B16細(xì)胞長至70%～80%時(shí)，胰酶消化后加入2 mL培養(yǎng)基重懸，離心5 min，去除上清，PBS清洗后用1 mL PBS重懸，計(jì)數(shù)，細(xì)胞量稀釋至106/150 μL，小鼠背部備皮，每只每個(gè)部位注射150 μL，觀察3周。

1.2.3 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞提取 荷瘤小鼠建模3周后，腫瘤長至7～8 mm時(shí)，將正常小鼠與荷瘤小鼠進(jìn)行解剖，取其脾臟剪碎置于Hass緩沖液中進(jìn)行研磨，70 μm細(xì)胞篩過濾，使用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行提取，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液裂解5 min，離心并用PBS清洗后，使用1 mL完全培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)、備用。

1.2.4 Western blot 用刀豆蛋白A(ConA)5 μg/mL對淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激，即將脾臟淋巴細(xì)胞分四組：正常小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(NL)、腫瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(ML)、NL+ConA、ML+ConA，每組細(xì)胞數(shù)為2×106，鋪板刺激24 h，收集細(xì)胞，每組用200 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心收集上清進(jìn)行BCA蛋白定量，加1/4的5×loading buffer混勻后100℃金屬浴10 min，每組取20 ug蛋白進(jìn)行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h，TBST漂洗三遍，分別與PD-1、Granzyme B、perforin、GAPDH、β-actin等蛋白一抗(1∶1000)于4℃敷育過夜，TBST漂洗三遍后，加入二抗(1∶5000)室溫敷育1h，TBST漂洗三遍后進(jìn)行ECL 化學(xué)發(fā)光劑顯色，Image J分析軟件計(jì)算各組細(xì)胞目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 ELISA 對上述分組細(xì)胞鋪板刺激后離心收集上清，進(jìn)行TNF-α、IFN-γ ELISA測定。嚴(yán)格按照說明進(jìn)行檢測，檢測完成后，10 min內(nèi)進(jìn)行酶標(biāo)儀測量每孔在450 nm發(fā)射波長下的吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2控制在0.998以上，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平。

1.2.6 Calcein/PI熒光染色 收集B16細(xì)胞進(jìn)行24孔板鋪板，每孔10萬個(gè)細(xì)胞，4 h細(xì)胞貼壁后分3個(gè)組，每組3個(gè)復(fù)孔，即陰性對照組、正常組(NL組)、荷瘤組(ML組)，按照1∶20(B16細(xì)胞：NL/ML)加入淋巴細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h，去上清，PBS漂洗2遍，加入Calcein AM/PI染色液(1∶500)，每孔200 uL，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱避光孵育30 min，熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 CCK8 收集B16細(xì)胞進(jìn)行96孔鋪板，每孔10000個(gè)細(xì)胞，4 h細(xì)胞貼壁后共分為7個(gè)組、每組6個(gè)復(fù)孔。即空白組(無細(xì)胞)、陰性對照組、ConA 組、NL組、ML組、NL+ConA組、ML+ConA組，按照1∶20(B16細(xì)胞：NL/ML)加入淋巴細(xì)胞，ConA 5 μg/mL刺激24 h，每孔加入10 μL CCK8溶液后，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h,進(jìn)行酶標(biāo)儀測量每孔在450 nm發(fā)射波長下的吸光度值。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù) 取提前備好的NL/ML各106，分別用100 μL 1×的結(jié)合緩沖液重懸，每管分別加入5 μL的Cyanine5-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD8、PE-抗小鼠CD4流式抗體，4℃避光孵育20 min；而ConA刺激24 h后的NL/ML，分別用100 μL 1×的結(jié)合緩沖液重懸，每管分別加入5 μL的Cyanine5-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD8，4℃避光孵育20 min，漂洗后對細(xì)胞進(jìn)行破膜，分別加5 μL PE-cy7抗小鼠Granzyme B、PE-抗小鼠perforin流式抗體，4℃避光孵育20 min，每管再加1mL緩沖液漂洗，離心后用500 μL 1×的結(jié)合緩沖液重懸，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究使用Image J和GraphPad Prism 8.0進(jìn)行制圖以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本間采用配對樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3遍以上。

2 結(jié)果

2.1 B16細(xì)胞分別與NL/ML共孵育24 h后各組B16細(xì)胞的增殖能力以及Calcein AM/PI熒光染色后的結(jié)果 NL和ML按照20∶1，分別與B16細(xì)胞共孵育24 h后，ML組與陰性對照組以及NL組相比較，B16細(xì)胞增殖能力均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*t=39.07，*P<0.05；#t=9.39，#P<0.05，圖1a); Calcein AM/PI熒光染色后的結(jié)果也與之對應(yīng)，并且NL與ML都依附在B16細(xì)胞表面(圖1b)。

*P<0.05：與陰性對照組比較，# P<0.05：與正常組比較

2.2 B16細(xì)胞分別與NL/ML共孵育并加入ConA刺激24 h后各組B16細(xì)胞的增殖能力 B16 細(xì)胞按比例1∶20與NL/ML共孵育并加入ConA(5 μg/mL)刺激24h后，ConA組細(xì)胞增殖能力相對于陰性對照組無差異，排除ConA對于B16細(xì)胞的影響；ML組與陰性對照組以及NL組相比較，B16細(xì)胞增殖能力均顯著下降(*t=69.61，*P<0.05；#t=5.44，#P<0.05，圖2)。

2.3 NL組和ML組脾臟淋巴細(xì)胞中CD8+、CD4+T細(xì)胞比例占比 流式分析發(fā)現(xiàn)，在免疫T細(xì)胞表達(dá)CD3陽性條件下， NL組,中CD8+和CD4+T細(xì)胞比例分別為：25.1%、59.9%；在ML組中CD8+和CD4+T細(xì)胞比例分別為：31.3%、58.9%。ML組中CD8+T細(xì)胞明顯高于NL組中CD8+T細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.56，P<0.05，圖3)。

圖2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 *P<0.05：與陰性對照組比較，# P<0.05：與正常組+刀豆蛋白A比較 圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析NL和ML中CD8+與CD4+比例占比 *** P<0.001

2.4 NL組和ML組PD-1蛋白表達(dá)水平 與正常小鼠脾臟淋巴細(xì)胞NL組相比，B16荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞ML組中PD-1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào); 在ConA(5 μg/mL)刺激活化24 h后， ML組PD-1蛋白表達(dá)水平依舊較NL組顯著下調(diào)(圖4)。

圖4 Western blot檢測NL、ML、NL +ConA和ML+ConA中 PD-1蛋白表達(dá)水平

2.5 在ConA刺激24 h之后，NL組和ML組淋巴細(xì)胞顆粒酶B、穿孔素蛋白表達(dá)水平以及TNF-α、IFN-γ細(xì)胞因子表達(dá)水平。

在ConA(5 ug/mL)刺激活化24 h后，ML組中顆粒酶B、穿孔素蛋白表達(dá)水平較NL組顯著上調(diào)(圖5a)；TNF-α、IFN-γ細(xì)胞因子的表達(dá)水平都較NL組都顯著上升(t1=22.72，P1<0.05；t2=11.56，P2<0.05，圖5b)；ML組中CD8+T細(xì)胞的顆粒酶B表達(dá)比例相對NL組更高，ML組(17.8%)較NL組(14.3%)提高了24.5%；而穿孔素的表達(dá)比例，ML組(11.3%)較NL組(8.78%)提高了28.7%，(圖5c、5d)，而未經(jīng)ConA刺激的淋巴細(xì)胞幾乎不表達(dá)顆粒酶B以及TNF-α、IFN-γ細(xì)胞因子。

****P<0.0001；***P<0.001

3 討論

MM極易發(fā)生侵襲且早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，常規(guī)治療的療效不理想，但MM是對免疫治療相對敏感的惡性腫瘤，近幾年免疫治療在MM中的應(yīng)用已經(jīng)取得重大發(fā)展。免疫檢查點(diǎn)抑制，特別是抗 PD-1 免疫療法已經(jīng)徹底改變了MM的治療，美國 FDA 批準(zhǔn)的免疫治療藥物 Pembrolizumab(PD-1抗體)/CTLA-4 抗體等用于治療MM能明顯延長歐美MM患者的生存時(shí)間[8,9]。PD-1(programmed death 1)程序性死亡受體1，是一種重要的免疫抑制分子。腫瘤微環(huán)境會誘導(dǎo)浸潤的T細(xì)胞高表達(dá)PD-1分子，腫瘤細(xì)胞會高表達(dá)PD-1的配體PD-L1和PD-L2,導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中PD-1通路持續(xù)激活，T細(xì)胞功能被抑制，無法殺傷腫瘤細(xì)胞[10-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，PD-1的相對水平與T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力呈負(fù)相關(guān)，在PD-1上調(diào)的T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子分泌功能受限[13]。Beane等[14]利用鋅指核酸酶針對編碼PD-1基因，敲低TIL中PD-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低PD-1的TIL體外效應(yīng)功能得到改善，TNF-α、GM-CSF和IFN-γ等多功能細(xì)胞因子顯著增加，在治療轉(zhuǎn)移性黑素瘤上也取得可觀的效果，并且對機(jī)體不產(chǎn)生不利影響。有研究發(fā)現(xiàn)，體外刺激后，PD-1缺陷T細(xì)胞的IFN-γ分泌和細(xì)胞毒能力增加[15,16]。而TNF-α、IFN-γ在MM中發(fā)揮著重要作用，TNF-α在體內(nèi)或體外均有殺死腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。IFN-γ具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)控的作用，對于TNF-α具有刺激作用，增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)[17,18]。

PD-1雖然存在誘導(dǎo)表達(dá)的現(xiàn)象，即在活化的T淋巴細(xì)胞上高表達(dá)，但在正常的脾臟淋巴細(xì)胞中同樣也表達(dá)PD-1[19],本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ML中PD-1表達(dá)水平較NL顯著下降，在ConA刺激24 h后，ML組中PD-1表達(dá)依舊較NL組中顯著下降。并且在經(jīng)過ConA刺激24 h之后，ML組中的TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平均明顯高于NL組(P<0.05),并且在CCK8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NL和ML均具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，但ML的抑制作用比NL更顯著，在ConA刺激下，也證明了這一結(jié)果。這提示ML功能可能在腫瘤微環(huán)境中不易被抑制，并且分泌更高的細(xì)胞因子從而起到更好的殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。

穿孔素是儲存在細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)和NK細(xì)胞胞質(zhì)的細(xì)胞毒顆粒中的糖蛋白，顆粒酶是CTL和NK細(xì)胞釋放的細(xì)胞漿顆粒[20,21]。有研究表明，腫瘤免疫激活的CD8+T細(xì)胞主要通過穿孔素顆粒酶-和Fas/Fas配體-途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡來執(zhí)行腫瘤清除[22], 本研究在CD3陽性分選情況下，通過流式分析發(fā)現(xiàn)，NL組中CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞比例分別為：25.1%、59.9%；在ML組中CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞比例分別為：31.3%、58.9%，其中ML組中CD8+T淋巴細(xì)胞比例占比明顯高于NL組中CD8+T淋巴細(xì)胞(P<0.05)。而CD4+T細(xì)胞在兩組中差異不大。并且在Western blot中發(fā)現(xiàn)，ML組中穿孔素的表達(dá)水平較NL組顯著上升(P<0.05)，而顆粒酶B在未激活的免疫細(xì)胞是不表達(dá)的；使用ConA刺激24 h后，ML組中穿孔素、顆粒酶B的表達(dá)水平也較NL組顯著上升(P<0.05)；流式分析發(fā)現(xiàn)ConA刺激24 h后，ML組中CD8+T細(xì)胞表達(dá)的顆粒酶B的比例也相對NL組更高，ML組(17.8%)較NL組(14.3%)提高了24.5%；而穿孔素的表達(dá)比例，ML組(11.3%)較NL組(8.78%)提高了28.7%。這也提示，ML相對于NL具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用。

綜上所述，黑素瘤小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞具有更明顯的抑瘤效應(yīng)，可能通過低表達(dá)PD-1以及能夠分泌更高的穿孔素、顆粒酶B以及TNF-α、IFN-γ等而實(shí)現(xiàn)。作為初步探究，我們在本研究中并未對這種現(xiàn)象是否具有特異性的進(jìn)行驗(yàn)證，我們將在后面的研究中進(jìn)行跟進(jìn)。并且僅在細(xì)胞層面得出結(jié)論，仍需通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。由于脾臟淋巴細(xì)胞易獲取、數(shù)量多，希望這一研究發(fā)現(xiàn)能為MM的過繼性免疫治療提供新的思路。