黃佳佳，張燕姬，曾寶鈿，劉穎誼，洪日韋婷，翟 培

(廣東食品藥品職業(yè)學院，廣東 廣州 510520)

食品安全與國民經(jīng)濟和人民生活水平密切聯(lián)系，快速檢測技術在推進我國食品安全整治過程中發(fā)揮著重要作用，而該領域也逐步朝著標準化方向發(fā)展[1]。20世紀80年代，免疫層析技術(Immunochromatographic Assay，ICA)以其簡單、快速、靈敏等優(yōu)勢而被廣泛應用于食品安全、環(huán)境和醫(yī)療診斷領域[2]。免疫層析試紙條一般由樣品墊、結合墊、層析膜、吸水紙和PVC底板構成(圖1)。其核心原理是基于抗原-抗體的特異性結合，將捕獲抗原或抗體固定在硝酸纖維素膜上，采用有色或發(fā)光納米顆粒標記抗體作為信號標記物，通過樣品溶液層析泳動，即可在反應區(qū)域實現(xiàn)快速顯色，從而實現(xiàn)對目標分析物的定性或定量分析[3]。在食品安全檢測領域，基于雙抗夾心法和競爭法的ICA現(xiàn)已被廣泛應用于大分子蛋白質和小分子有毒有害的檢測[4]。本文旨在歸納目前納米材料在食品安全多殘留ICA的應用情況，并對ICA未來發(fā)展進行展望。

圖1 免疫層析試紙條構造和檢測原理Fig.1 Structure and principle of immunochromatographic test strip

1 納米材料在免疫層析技術中的應用

膠體金(gold nanoparticles，GNPs)是免疫層析技術的傳統(tǒng)標記物，具有制備簡單、容易標記、穩(wěn)定性高等特點，但是膠體金本身不具備發(fā)光特性，光學信號低，使得檢測靈敏度較低，從而限制了膠體金在低檢出限項目中的應用[5]。為進一步提高靈敏度，基于不同功能性納米顆粒標記物的ICA被開發(fā)利用，主要可分為有色納米顆粒、發(fā)光納米顆粒、磁性納米顆粒和其他新型標記材料[6]。

1.1 有色納米顆粒

有色納米顆粒包括金納米花(gold nanoflowers，AuNFs)、乳膠微球(latex microspheres，LMs)、碳納米顆粒(carbon nanoparticles，CNPs)和膠體硒納米顆粒(colloidal selenium nanoparticles，SNPs)等。金納米花具有多分支結構和比表面積大的優(yōu)勢，與檢測對象結合親和力增強，檢測靈敏度提高。金玉等[7]分別合成了球狀膠體金和金納米花作為標記探針，檢測牛奶中的黃曲霉毒素M1，結果顯示金納米花作為標記物的免疫層析試紙條檢測限為12.3 pg/mL，比傳統(tǒng)球型膠體金標記物靈敏度提高了5倍左右。CNPs是一種無定形的黑色粉末，局部石墨化結構，具有穩(wěn)定性高、易制備、價格低廉等優(yōu)點。Liu等[8]開發(fā)了CNPs作為標記探針的試紙條，檢測肉類樣品中沙丁胺醇，檢測限低至10 μg/kg，且試紙條穩(wěn)定性高于膠體金(GNPs)標記試紙條，制備成本更低。膠體硒納米顆粒SNPs是一種鐵銹色的納米微粒，具有很好的生物吸附性能，與蛋白標記簡單且不容易發(fā)生沉聚。Wang等[9]以SDS和PEG為穩(wěn)定劑，在常溫下成功制備了SNPs，開發(fā)了基于SNPs的試紙條檢測豬尿中的克倫特羅，檢測限為3 ng/mL，與市售的同類試紙條具有相同的靈敏度，但穩(wěn)定性更高，可在37 ℃下儲存60天。

1.2 發(fā)光納米顆粒

發(fā)光納米顆粒包括量子點(quantum dots，QDs)，熒光微球(fluorescent microspheres，F(xiàn)Ms)，時間分辨熒光微球(time-resolved fluorescent microspheres，TRFMs)，上轉換發(fā)光顆粒(UP-converting phosphor，UCP)等。量子點是一種光學穩(wěn)定性高，發(fā)射帶窄，吸收光譜寬的熒光半導體納米晶體，因其獨特的光學性質，被認為是應用前景最廣的生物標記材料。Liu等[10]利用量子點作為標記探針研發(fā)了檢測農產(chǎn)品中啶蟲脒的免疫層析試紙條，定性檢測限為1 ng/mL，結合便攜式熒光測定儀檢測，其線性范圍為0.098～25 ng/mL，最高半抑制濃度(IC50)為1.12 ng/mL，樣品平均回收率為78.38%～126.97%，盲樣檢測結果與高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測結果高度相關。Zhao等[11]開發(fā)了一種基于競爭性上轉換熒光免疫層析檢測谷物和其它農作物中的黃曲霉毒素B1污染水平，檢測限為0.1～5 ng/g，遠低于目前我國國家標準中農作物黃曲霉毒素B1最大殘留限量，可滿足現(xiàn)行檢測需求。

1.3 磁性納米顆粒

磁珠納米顆粒(magnetite nanoparticles，MNPs)常被用來從食物基質中濃縮和分離目標分析物。用這種方法制備樣品，可消除食品基質對檢測結果的影響，提高檢測靈敏度。Li等[12]將磁性納米顆粒與抗體偶聯(lián)，制備免疫磁珠，用于富集分離出牛肉、牛奶和水樣中的大腸桿菌O157：H7并富集，結合熒光微球試紙條檢測，其靈敏度比非磁富集樣品方法提高了33倍。為進一步提高檢測性能，Yan等[13]提出了一種基于磁納米顆粒標記得雙探針信號放大策略，利用MNPs標記小鼠單克隆抗體和MNPs標記羊抗鼠抗體之間的高親和力，通過生成雙探針網(wǎng)絡復合物來獲得擴增信號，該方法實現(xiàn)3-氨基-2-惡唑烷酮的高靈敏度檢測，檢出限為0.044 ng/mL。

1.4 其他新型標記材料

1.4.1 納米酶顆粒

納米酶具有類酶特性，作為天然酶的直接替代品，提高了檢測方法靈敏度，在生物傳感器領域具有巨大應用潛力。Wei等[14]利用基于金Au@Pt納米酶的新型ICA對牛奶中鏈霉素進行檢測，與傳統(tǒng)膠體金ICA相比，其靈敏度提高了80倍。Yang等[15]合成了催化效率高、穩(wěn)定性好的鉑銥納米材料(Pt-Ir NCs)，該研究比較了Pt-Ir NCs-ICA和底物AEC介導增強的 Pt-Ir NCs-ICA，結果顯示Pt-Ir NCs-ICA的檢測限為0.5 ng/mL，而ACE介導增強的Pt-Ir NCs-ICA檢測限達到0.05 ng/mL，靈敏度提升一個數(shù)量級。

1.4.2 雙重信號標記材料

大部分多殘留ICA是基于幾種多色標記載體，用于單獨抗體標記，雖然該策略豐富了信號輸出，但檢測系統(tǒng)也變得更復雜，甚至多種標記材料之間會產(chǎn)生諸多干擾。因此，開發(fā)靈敏、方便快捷的雙讀出策略將是一個巨大的挑戰(zhàn)[16-17]。Wang等[18]采用簡單一步法制備魯米諾還原金納米顆粒(AuNPs)，分別以AuNPs比色信號和化學發(fā)光信號作為定性輸出。單探針雙讀出技術具有分析效率高、成本低、操作方便、準確度高等優(yōu)點，在藥物安全、環(huán)境衛(wèi)生和臨床診斷等領域具有廣闊的應用前景。

1.4.3 金屬有機框架

金屬有機框架(MOFs)憑借其高度生物親和力以及新穎的拓撲結構在在分離、催化、傳感、生物醫(yī)藥等方面有著廣泛的應用[19]。普魯士藍(PBNPs)是MOFs材料中的一種，這種基于MOFs材料的ICA分析在靈敏度和穩(wěn)定性方面發(fā)揮強大的優(yōu)越性，Zhao等[20]首次以PBNPs為標記材料，應用于克倫特羅的ICA分析。在最佳條件下，基于PBNPs的ICA測定克倫特羅線性范圍為0.5～5 ng/mL，檢測限為1.0 ng/mL，靈敏度比傳統(tǒng)的金納米粒子ICA提高了5倍。

2 多殘留ICA在食品安全中的應用

食品及農產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工、包裝、運輸、儲存過程中，有害化合物混合污染聯(lián)合效應廣泛存在[21-22]，單個農產(chǎn)品中同時檢出多種藥物殘留的現(xiàn)象較為普遍[23]。較多的研究只關注單一毒性效應，忽視了混合污染帶來的危害風險。因此，開發(fā)多殘留免疫層析方法更適用食品安全現(xiàn)場快速檢測的需求。

2.1 食源性微生物

全球每年多達30%的人口患食源性疾病，其中食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因[24]。Zheng等[25]開發(fā)了一種基于硅量子點(QDs)的熒光ICA，用于同時鑒定食品中寒沙門氏菌和大腸桿菌O157：H7，在雙通道ICA條帶中，QDs提供優(yōu)越的熒光信號，且具有單分散性和良好穩(wěn)定性；而該方法對沙門氏菌和大腸桿菌的檢出限均能達到50 CFU/mL，與傳統(tǒng)方法(GNPs-ICA)相比，靈敏度提高了200倍(圖2)。Wang等[26]把等溫DNA擴增技術與ICA聯(lián)合，將擴增的沙門氏菌和大腸桿菌DNA分別與乳膠微球(LMs)進行標記，該方法對兩種細菌的檢測限達到100 CFU/mL。

圖2 量子點雙通道免疫層析[25]Fig.2 Dual channel of quantum dot immunochromatography assay

2.2 真菌毒素

農產(chǎn)品在貯藏、運輸和加工過程容易受真菌侵染。而由真菌代謝所產(chǎn)生的真菌毒素對食品及農產(chǎn)品的污染降低產(chǎn)品質量，引發(fā)了嚴峻的食品安全問題[27]。Liu等[28]建立了一種基于智能手機的定量雙檢測模式裝置(圖3)，集成了膠體金和時間分辨熒光微球免疫層析，用于檢測谷物中多種真菌毒素；兩種方法對黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2毒素和伏馬毒素B1檢測限分別為0.59/0.24/0.32/0.9/0.27 μg/kg、0.42/0.10/0.05/0.75/0.04 μg/kg。雙檢測模式為真菌毒素高通量、高靈敏度的現(xiàn)場檢測提供有力支撐。此外，Goryacheva等[29]為了在親水介質和生物偶聯(lián)過程中保持量子點的高熒光量子產(chǎn)率，合成CdSe/CdS和CdSe/CdS/ZnS核殼異質結構，并用不同表面組成的二氧化硅涂層擴展它們，使熒光量子產(chǎn)率在水介質中保持高達70%；將表面含有環(huán)氧和羧基的硅烷化量子點與單克隆抗體進行生物偶聯(lián)，開發(fā)多色熒光ICA，用于同時檢測玉米和小麥中的玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素。

圖3 真菌毒素多殘留免疫層析方法[28]Fig.3 The immunochromatographic assayfor multiple mycotoxin

2.3 獸藥及違禁藥

在畜牧業(yè)的發(fā)展過程中，獸藥的使用可提高禽畜產(chǎn)品質量，然而也導致動物源性食品的獸藥殘留。為此，Hendrickson[30]建立了一種快速、靈敏的GNPs-ICA，用于牛奶中環(huán)丙沙星和氯霉素的同時檢測。該方法樣品前處理簡單，對于兩種藥物的檢測限分別是20 pg/mL和0.5 ng/mL。Liu等[31]建立了磁性普魯士藍納米酶(MPBN)介導的雙讀數(shù)的多殘留ICA(圖4)，以顯色底物TMB催化氧化產(chǎn)生的催化信號和探針原始顏色的比色信號為基礎，這種雙信號輸出策略不僅提高了檢測精度，且方法重現(xiàn)性好，對萊克多巴胺和克倫特羅加樣回收率為84.01%～119.94%。

圖4 基于磁性普魯士藍納米酶的多殘留免疫層析方法Fig.4 Multiplex lateral flow immunoassay based on magnetic Prussian blue nanoenzyme

2.4 農 藥

化學防治是農作物保護的重要手段之一，但農藥殘留帶來的危害不容忽視。Zou等[32]建立了一種基于上轉化納米顆粒(UCPs)的快速、靈敏的ICA方法，用于三種有機磷農藥的多殘留檢測。優(yōu)化后的UCPs-ICA針對對硫磷、甲基對硫磷和殺螟硫磷的IC50分別為3.44 ng/mL、3.98 ng/mL和12.49 ng/mL，檢測范圍為0.98～250 ng/mL，添加回收率為67%～120%，該方法可作為快速檢測食品中3種有機磷農藥的替代篩選工具。Sheng等[33]制備了基于表面增強拉曼散射(SERS)的試紙條，同時檢測百菌清、吡蟲啉和氧氟芬三種農藥，該方法通過測定紙條檢測線上SERS信號的強度，實現(xiàn)準確定量分析。

表1 免疫層析技術在食品各領域的應用Table 1 Application of immunochromatographic assay in various field of food

續(xù)表1

3 結 語

食品安全關系人民健康和社會穩(wěn)定。免疫層析技術在食品安全現(xiàn)場監(jiān)控中發(fā)揮著不可替代的作用，為食品安全快速檢測提供了有效保障。

各種納米材料的應用為ICA帶來新的活力，與傳統(tǒng)的膠體金免疫層析相比，其靈敏度和穩(wěn)定性等方面得到較大得提升。多殘留免疫層析可同時進行多對象檢測，具有樣品用量少，檢測時間短，檢測靈敏度高等方面優(yōu)點。在未來的研究當中，高通量檢測可通過借助于精密的試劑分配技術，如噴墨印刷技術[39-40]實現(xiàn)。同時，蠟印技術的興起為構建多通道免疫層析提供了一種新的手段。然而高通量的ICA往往存在一定的交叉反應。為解決這一問題，一方面可制備高特異性的抗體避免交叉影響，或開發(fā)具有廣譜性的抗體同時檢測多種有害分子，另一方面以新型識別分子(如適配體)來代替抗體[41]。此外，通過將智能手機的光學成像系統(tǒng)與免疫層析技術深度融合，可提高分析性能。智能成像的引入使檢測準確性明顯提高，但是目前基于智能手機的免疫層析方法多數(shù)針對單一目標物的分析，在高通量定量檢測方面仍有待提升。

綜上，免疫層析技術在多年發(fā)展中得到不斷完善，它是未來快速檢測方法中最具發(fā)展前景的工具，具有簡單、便攜、易用、經(jīng)濟的特點，是食品安全快速檢測不可或缺的工具。