周苗苗， 杜緩緩， 趙輝軒， 朱 偉， 毛月圓

(安徽科技學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

巰基氨基酸(包括半胱氨酸，高半胱氨酸，谷胱甘肽)是一種非常重要的生物分子，與生物體內(nèi)多種過(guò)程有關(guān)，例如保持細(xì)胞內(nèi)的還原性[1-2]，維持蛋白的立體結(jié)構(gòu)等等[3-4]，因而巰基氨基酸的代謝異常與多種疾病的出現(xiàn)有關(guān)。例如，作為巰基氨基酸的重要代謝物，硫醇濃度的異常升高與心血管疾病及阿爾茲海默癥[5]相關(guān)，而硫醇濃度的異常降低與嗜睡、肝臟損傷、皮膚損傷[6-7]等疾病相關(guān)。因此，巰基氨基酸的檢測(cè)有利于疾病的早期診斷[8]。現(xiàn)有多種手段被用于巰基氨基酸的檢測(cè)，主要包括熒光光譜手段[9]、電化學(xué)手段[10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜、色譜手段及質(zhì)譜手段等。在這些測(cè)試手段中，熒光光譜手段是一種簡(jiǎn)單、有效、無(wú)損傷且具有較低檢測(cè)限的方法，可以被應(yīng)用于細(xì)胞[11-12]、組織及活體成像中[13-14]。大多數(shù)的巰基氨基酸類熒光探針是基于化學(xué)反應(yīng)的探針，主要包括磺胺鍵、磺酸酯鍵、乙酰酯鍵的斷裂[15]，Se-Au鍵斷裂[16]，芳香取代反應(yīng)，二硫鍵斷裂反應(yīng)[17]，環(huán)化反應(yīng)[18]及Michael加成反應(yīng)[19]?；诨瘜W(xué)反應(yīng)的探針通常需要一定的反應(yīng)時(shí)間，因此，亟需開(kāi)發(fā)一種快速靈敏的熒光探針。

本項(xiàng)目以7-羥基香豆素為原料合成了一種巰基氨基酸熒光探針SP，并利用1HNMR，13CNMR，HRMS等手段進(jìn)行表征；此探針溶液中加入GSH、Hcy及Cys后呈現(xiàn)出較為明顯的熒光變化，并具有較高的選擇性；探針SP實(shí)現(xiàn)了溶液中的巰基氨基酸的高選擇性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試劑：7-羥基香豆素(98%)，2,4-二硝基氟苯(98%)，谷胱甘肽，半胱氨酸，高半胱氨酸，牛血清蛋白(BSA)，苯丙氨酸，丙氨酸，甘氨酸，谷氨酸，胱氨酸，精氨酸，賴氨酸，酪氨酸，亮氨酸，色氨酸，絲氨酸，絲氨酸，組氨酸，天冬氨酸(AR，上海泰坦科技有限公司)。儀器：AdvanceⅢ600核磁共振波譜儀(日本理學(xué))；6200系列TOF/6500(Q-TOF B.06.01)高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫);RF-6000熒光光譜儀(日本島津)。

1.2 化合物SP的合成

將7-羥基香豆素(0.016 2 g，0.100 0 mmol)加到50 mL的圓底燒瓶中，加入10 mL乙腈使其完全溶解，加入3滴三乙胺攪拌5 min，再加入2,4-二硝基氟苯(0.018 6 g，0.100 0 mmol)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 h，TLC板監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度(圖1)。待其充分反應(yīng)后，旋干溶劑得到粗產(chǎn)品，通過(guò)柱層析提純，得到淡黃色固體化合物。

圖1 化合物SP的合成

1.3 溶液配制及測(cè)試方法

化合物SP溶解于DMSO中得到濃度為10-3mol/L的儲(chǔ)備溶液;谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸及其他氨基酸溶解于純水中得到儲(chǔ)備溶液。用v(PBS)∶v(DMSO)為6∶4的混合溶劑將儲(chǔ)備液稀釋至需要的濃度進(jìn)行測(cè)試,其中PBS溶液的濃度為0.05 mol/L,pH=7.4。

熒光光譜測(cè)試過(guò)程以377 nm為激發(fā)光,收集390～700 nm之間的發(fā)射光譜,數(shù)據(jù)間隔0.5 nm,掃描速度600 nm/min,激發(fā)光帶寬5 nm,發(fā)射光帶寬3 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 核磁共振譜圖表征

按照1.2中合成步驟得到淡黃色化合物為探針SP(0.024 0 g,0.073 2 mmol),產(chǎn)率73%。1HNMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.93 (d, J=2.6 Hz, 1H), 8.45 (dd, J=9.1 Hz, 1H), 7.75 (d, J=9.6 Hz, 1H), 7.61 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.24 (d, J=9.1 Hz, 1H), 7.13-7.03 (m, 2H), 6.46 (d, J=9.6 Hz, 1H).13CNMR δ 159.80, 156.81, 155.47, 154.19, 142.78, 142.53, 140.50, 129.95, 129.07, 122.33, 120.50, 116.76, 116.43, 115.95, 108.04. HRMS:[M+Na+]=351.022 78 (理論值=351.022 4)。

2.2 光物理性質(zhì)

探針?lè)肿覵P中,化合物SP無(wú)熒光,但香豆素?zé)晒鈭F(tuán)的熒光被猝滅,這是由于2,4-二硝基苯基的引入。向SP的v(PBS(pH=7.4))∶v(DMSO)為6∶4的溶液中逐漸加入巰基氨基酸溶液并在37 ℃下水浴1 h后,454 nm處熒光成像呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)(圖1)。當(dāng)SP溶液中所含有的巰基氨基酸(GSH、Cys或Hcy)的濃度逐漸增大時(shí),體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng);當(dāng)巰基氨基酸大約為100 μmol/L時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)到熒光平臺(tái)區(qū);向SP溶液中分別加入過(guò)量的GSH、Cys或Hcy并水浴后,分別呈現(xiàn)出217、178或135倍的熒光增強(qiáng)(圖2d)。

圖2 分別向化合物(10 μmol/L)v(PBS(pH=7.4))∶v(DMSO)為6∶4的溶液中逐漸加入不同濃度的GSH(a),Cys(b), Hcy(c)并在37 ℃水浴60 min后,溶液的熒光變化趨勢(shì);454 nm處熒光強(qiáng)度隨巰基氨基酸濃度變化趨勢(shì)(d),Ex=377 nm

Fig.2 Fluorescent spectra of probe SP (10 μmol/L) inv(PBS(pH=7.4))∶v(DMSO)=6∶4 after adding different concentration (0～1 000 μmol/L) of GSH (a), Cys (b) or Hcy (c) and incubating the mixture at 37 ℃ for 60 min. Fluorescence intensity at 454 nm of mixture containing 10 μmol/L SP and biothiols change as the concentration of biothiols (GSH or Cys or Hcy) increased gradually, Ex=377 nm

通過(guò)測(cè)量未加入巰基氨基酸的空白探針SP溶液的熒光強(qiáng)度10次,并計(jì)算測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為19.96,在濃度較小時(shí)(<30 μmol/L),熒光強(qiáng)度隨著加入的巰基氨基酸的濃度的增大呈線性變化,經(jīng)過(guò)線性擬合(如圖2所示)得到加入GSH、Cys和Hcy的熒光線性變化斜率分別為4 721.27、4 502.51和1 519.36。標(biāo)準(zhǔn)偏差為19.96,探針SP對(duì)GSH、Cys或Hcy 3種巰基氨基酸的檢測(cè)限(LOD)分別為0.012 7、0.013 3、0.039 5 μmol/L。

2.3 響應(yīng)時(shí)間

為了衡量探針SP與巰基氨基酸的響應(yīng)速度,我們分別將加入過(guò)量巰基氨基酸的SP溶液水浴不同時(shí)間,并測(cè)其熒光光譜。在454 nm處得熒光強(qiáng)度隨著水浴時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖3所示,3種巰基氨基酸(GSH、Cys、Hcy)與探針SP的反應(yīng)速度接近,且在混合后20 min左右熒光強(qiáng)度達(dá)到平臺(tái)區(qū)域。此實(shí)驗(yàn)說(shuō)明探針SP對(duì)GSH、Cys、Hcy 3種巰基氨基酸的響應(yīng)過(guò)程都比較迅速。

圖3 10 μmol/L的SP v(PBS(pH=7.4))∶v(DMSO)=6∶4溶液中分別加入1 000 μmol/L GSH, Cys或Hcy后,熒光強(qiáng)度隨水浴時(shí)間的變化趨勢(shì),Ex=377 nm Fig.3 The fluorescence intensity at 454 nm containing 10 μmol/L SP and 1 000 μmol/L biothiols (GSH or Cys or Hcy) in v (PBS (pH=7.4))∶v (DMSO)=6∶4 mixed solvent change as the time prolonged at 37 ℃, Ex=377 nm

2.4 選擇性

基于探針?biāo)幍沫h(huán)境中有可能存在其他種類的離子,因此熒光探針應(yīng)該具有較好的生物選擇性。向SP的溶液中加入過(guò)量的常見(jiàn)的氨基酸、蛋白及離子(1～22分別代表GSH、Cys、Hcy、BSA、Phe、Ala、Gly、Glu、Cystine、Arg、Lys、Tyr、Leu、Trp、Ser、Thr、Asn、His、K+、Mg2+、Cl-、Na+),并水浴后測(cè)試其熒光光譜圖4所示。加入BSA、Cys和Hcy的樣品的熒光呈現(xiàn)出明顯的增強(qiáng),加入其他氨基酸及離子的樣品熒光未呈現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)趨勢(shì),并且含有巰基的蛋白BSA對(duì)探針SP的熒光也無(wú)明顯的影響。因此,可以說(shuō)探針SP的選擇性很高,可用于復(fù)雜環(huán)境中檢測(cè)GSH、Cys和Hcy。

圖4 探針SP對(duì)其他常見(jiàn)氨基酸、蛋白及離子的選擇性 Fig.4 Selectivity of SP to other amino acids or ions

2.5 檢測(cè)機(jī)理

探針SP分子中的2,4-二硝基苯基中,由于兩個(gè)硝基的吸電子作用使得苯環(huán)上1號(hào)位碳原子呈現(xiàn)出缺電子效應(yīng)顯正電性,二巰基氨基酸中的S原子具有孤對(duì)電子呈現(xiàn)富電子效應(yīng),具有親核性質(zhì),進(jìn)攻1號(hào)位的碳原子,O-C鍵斷裂,與苯環(huán)相連的氧原子離去,生成具有熒光的香豆素衍生物。

圖4 探針SP檢測(cè)GSH、Cys、Hcy的機(jī)理

3 結(jié)論

本文報(bào)道了一種基于香豆素衍生物的巰基氨基酸(GSH、Cys和Hcy)熒光探針SP,在GSH、Cys或Hcy存在時(shí),將呈現(xiàn)出明顯的熒光變化,分別呈現(xiàn)出216、135、183倍的熒光增強(qiáng);SP對(duì)GSH、Cys、Hcy的檢測(cè)限較低,分別為0.012 7、0.013 3、0.039 5 μmol/L;探針SP與巰基氨基酸的響應(yīng)時(shí)間為20 min。此探針具有較高的選擇性,可拓展其在生物成像方面的應(yīng)用。