謝長文, 范紅結, 劉德義

(1. 宿州職業(yè)技術學院, 安徽 宿州 234101; 2. 南京農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095; 3.安徽科技學院 動物科學學院, 安徽 鳳陽 233100)

支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabornchispetica, Bb)又叫支氣管鮑特桿菌或博德特氏桿菌，簡稱波氏桿菌，該菌主要引起兔(包括野兔、飼養(yǎng)兔和實驗兔)的一種傳播廣泛、侵害呼吸系統(tǒng)的、多發(fā)的急慢性傳染病，感染動物主要以鼻炎、支氣管炎、支氣管肺炎和膿皰性肺炎為特征[1-2]。圈舍環(huán)境衛(wèi)生差、濕度大、養(yǎng)殖密度大、空氣污濁等原因極易造成家兔感染本病并迅速在兔場內傳播[3-4]。近年來國內外對兔肉食品、兔毛皮制品的需求量急增，我國家兔養(yǎng)殖結構已由以往的散養(yǎng)模式向規(guī)?；B(yǎng)殖模式快速發(fā)展，但安徽北部地區(qū)許多養(yǎng)兔場在擴大養(yǎng)殖規(guī)模的同時，忽略了飼養(yǎng)管理水平、養(yǎng)殖技術和疫病防控技術的提高，導致兔場兔波氏桿菌病多發(fā)，且該病應用常規(guī)的細菌學、血清學等手段檢測時存在耗時、耗力、靈敏度較低等缺點，導致本病在很多養(yǎng)兔場長期隱性存在難以根除，現(xiàn)急需一種簡捷、快速、特異性高、低成本的檢測本菌的方法。本試驗從皖北地區(qū)多個疑似發(fā)生本病的大型養(yǎng)兔場采取病料，對兔波氏桿菌進行分離鑒定，并建立了針對該菌的PCR快速診斷方法，為皖北地區(qū)養(yǎng)兔場準確的掌握本病在兔群中的流行狀況，提早做好防疫提供依據(jù)，進而降低皖北地區(qū)養(yǎng)兔場本病的感染率和死亡率。

1 材料與方法

1.1 供試材料

主要儀器設備：臺式高速離心機(eppendorf公司)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；冰柜(青島澳柯瑪股份有限公司)；PCR擴增儀(TaKaRa公司)；全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)；電泳儀(BIO-RAD公司)；自動顆粒制冰機(太倉市華美生化儀器廠)。

病料來源:安徽北部地區(qū)4家疑似發(fā)生兔支氣管敗血波氏桿菌病的大型兔場，解剖無菌采集發(fā)病兔只肺臟置-20 ℃保存。

主要試劑:馬丁肉湯；麥康凱瓊脂培養(yǎng)板；5%的綿羊血改良B-G培養(yǎng)板；Bb診斷血清，標準兔支氣管敗血波氏桿菌，兔巴氏桿菌，兔魏氏梭菌，金黃色葡萄球菌和兔大腸桿菌等(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所兔病研究室提供)；細菌微量生化鑒定管，染色試劑盒，藥敏紙片等(杭州天和微生物試劑有限公司)；柱式細菌DNAout提取試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)；pMD19-T載體，DNA膠回收試劑盒，DH5α感受態(tài)細胞，PCR擴增所需試劑(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng)與純化 取采集的病變肺臟，分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)板，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落的生長狀況，挑取孤立單一的疑似菌落，繼續(xù)劃線接種于5%綿羊血改良的B-G培養(yǎng)板進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 細菌的形態(tài)學與血清學鑒定 挑取少量菌落涂片，進行革蘭氏法染色，顯微鏡下觀察細菌形態(tài)和著色情況；挑取分離菌落接種于馬丁肉湯中，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，吸取等量的菌液和標準的Bb血清混于玻片上，2 min后觀察有無凝集反應。

1.2.3 生化鑒定與藥物敏感性試驗 分別取100 μL菌液接種于不同的微量生化鑒定管中，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48～72 h后觀察結果；將分離株菌液均勻涂布于含有綿陽血的瓊脂培養(yǎng)皿上，表面貼上藥物敏感紙片，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察結果。

1.2.4 PCR鑒定與BLAST比對 提取分離菌株基因組，根據(jù)文獻報道選用16S rRNA基因測序技術設計一對引物[5](DNT-F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3',DNT-R:5'-GCAGGGGAAGGCACCATT-3')，反應總體積設為25 μL，逐一加入Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 1.0 μL，上下游引物(50 pmol/μL)各0.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，Bb基因組DNA模板1.0 μL，10×Taq Buffer 2.5 μL，ddH2O 17.0 μL。在94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸110 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min作為反應條件進行PCR擴增，預期獲得片段大小約為1 492 bp；擴增產(chǎn)物進行電泳、凝膠成像、回收、純化，回收純化的產(chǎn)物利用pMD19-T試劑盒進行連接，轉化DH5α感受態(tài)細胞后送上海Invitrogen公司測序，最后對所得序列進行BLAST比對。

1.2.5 DNA模板的制備 無菌條件分別培養(yǎng)本研究分離的Bb菌、標準Bb菌、兔巴氏桿菌、兔魏氏梭菌、金黃色葡萄球菌和兔大腸桿菌，依據(jù)柱式細菌DNAout提取試劑盒操作說明制備DNA模板，放4 ℃冰箱備用或放-20 ℃冰箱長期保存。

1.2.6 PCR引物設計與合成 利用GenBank報道的波氏桿菌絲狀血凝素基因(AF111796)設計1對引物(上游引物：5'-GCGAGCAGACGAGCCAAAG-3'；下游引物：5'-TGCGGAGCCATCCCAAC-3')，預計目的片段約734 bp。PCR反應總體積設定為25 μL，對本研究所得的Bb菌株進行擴增，回收、純化擴增產(chǎn)物后連接pMD19-T載體，連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，將轉化后的菌液涂布于預熱的LB平板(含100 μg/mL Amp)，37 ℃培養(yǎng)12 h獲得陽性菌落，挑單個菌落置入LB的培養(yǎng)液中，200 r/min，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h制備重組質粒的DH5α菌液，之后用煮沸法提取細菌的重組質粒模板置4 ℃保存，設PCR反應總體積為25 μL，以T載體鑒定通用引物(上游引物：5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'；下游引物：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')，對提取的重組質粒進行驗證，陽性產(chǎn)物送上海Invitrogen公司測序。

1.2.7 PCR條件優(yōu)化 反應總體積設定為25 μL，依次改變反應體系中的Mg2+濃度、不同退火溫度(55、56、57、58、59、60 ℃)和不同循環(huán)數(shù)(25循環(huán)、30循環(huán)、35循環(huán))，分別進行PCR擴增，確定最佳PCR反應條件。

1.2.8 PCR特異性檢測和敏感性試驗 以25 μL為反應總體積，以94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸110 s，30個循環(huán)數(shù)，72 ℃延伸10 min為PCR反應條件，對兔波氏桿菌、兔巴氏桿菌、兔魏氏梭菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌DNA模板同時進行PCR擴增、電泳、觀察結果和拍照；取分離株培養(yǎng)液，菌液濃度為7.2×1010CFU/mL，采取9個梯度10倍稀釋后粗提不同濃度菌液的DNA模板，以25 μL作為反應總體積，分別取不同濃度的DNA模板1 μL進行PCR擴增。

1.2.9 對比試驗 用鼻拭子從宿州某肉兔場無菌采集50份不同癥狀的鼻腔分泌物進行細菌培養(yǎng)，用常規(guī)的直接凝集法檢測，同時運用建立的PCR檢測，并對檢測結果進行對比。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)觀察與血清學檢測

對分離菌株進行涂片，革蘭氏染色后鏡檢顯示該菌為兩端鈍圓、兩極著色不明顯的革蘭氏陰性的短桿菌(圖1)，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)板和馬丁肉湯中上能良好的生長，菌液表面形成較厚的膜，觀察菌落呈針尖狀，表面濕潤光滑，有亮澤，凸起的圓形；在改良的B-G培養(yǎng)板上形成濕潤光滑、半透光、中心凸起、圍繞菌落有一環(huán)形β溶血環(huán)且邊緣整齊的珍珠樣小菌落(圖2)，其分離菌與標準Bb菌株在形態(tài)結構上相符；分離菌菌液與標準的Bb診斷血清混合后呈現(xiàn)出肉眼可見的絮狀凝結。

圖1 分離菌株的顯微鏡觀察

圖2 菌落

2.2 分離株生化試驗和藥敏試驗

生化試驗顯示：該菌不發(fā)酵乳糖、棉籽糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖和側金盞花醇等；能利用硝酸鹽及分解尿素；H2S、靛基質、七葉苷、明膠、吲哚、MR實驗呈陰性；石蕊牛乳、V-P、動力等實驗呈陽性；能反應氧化酶、接觸酶、H2O2酶、過氧化物酶等。藥物敏感性試驗顯示：分離的菌株對甲氧嘧啶、氯霉素、氟苯尼考、慶大霉素、環(huán)丙沙星、復方新諾明、呋喃坦啶高度敏感；對紅霉素、頭孢曲松鈉、多粘菌素、卡那霉素、先鋒必、頭孢噻肟、乙酰螺旋霉素等中等敏感；對青霉素G、磺胺間二甲氧嘧啶鈉、氨芐西林、蓋博斯林、阿莫西林、桿菌肽、克林霉素等不敏感。鑒定結果顯示本研究所得的菌株與支氣管敗血波氏桿菌標準株在生化、藥敏特性上相一致。

2.3 分離菌株和標準株的16S rRNA-PCR擴增

分離株和標準株均能在1 492 bp處產(chǎn)生與預期片段大小一致的目的條帶(圖3)，其測序結果與Bb16S rRNA(E06073)基因序列同源性達到了99.1%；通過BLAST比對顯示，支氣管敗血波氏桿菌與分離株在基因序列上最近，再次表明了所分離出的菌株為兔支氣管敗血波氏桿菌。

2.4 PCR擴增和重組質粒的驗證

用設計的引物對分離的Bb菌株和標準Bb菌株進行PCR擴增，均擴增出與預期目的一致大小約734 bp的目的片段(圖4)；對重組質粒進行驗證，可見到大小約800 bp特異目的條帶。

圖3 16S rRNA-PCR擴增結果

圖4 PCR擴增結果

2.5 PCR條件優(yōu)化

PCR總反應體系25 μL保持不變，當MgCl2(25 mmol/L)加量為1.0 μL、退火溫度設置為58 ℃、循環(huán)數(shù)設置為30個循環(huán)時，其它反應條件不變的情況下(94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，72 ℃延伸110 s，72 ℃延伸10 min)出現(xiàn)特異的清晰的目的條帶。

2.6 PCR特異性檢測和敏感性檢測

PCR特異性試驗擴增結果顯示僅有以兔波氏桿菌DNA為模板的反應體系擴增出了大小約為734 bp的特異性片段，其它細菌為模板均未擴增出片段，顯示建立的PCR方法具有高度的特異性(圖5)；PCR敏感性檢測結果顯示，在第8泳道，即菌液濃度為7.2×103CFU/mL時仍能擴增出目的片段(圖6)。

圖6 PCR敏感性檢測結果

2.7 凝集法和PCR檢測的對比

對鼻拭子采集的50份樣本用常規(guī)的玻片凝集法檢測，結果顯示陽性17份，陽性率34%；PCR法檢測，結果顯示陽性43份，陽性率86%(表1)。

表1 凝集法與PCR檢測結果的對比

3 結論與討論

兔支氣管敗血波氏桿菌病是養(yǎng)兔場主要傳染病之一，該病能降低兔只免疫力，使飼料報酬率下降，幼兔生長發(fā)育遲滯等。由于該菌表面的絲狀血凝素大蛋白起著黏附作用，能使該菌在動物體內長期定居并在呼吸道大量繁殖[6-7]，從而導致持續(xù)感染，并不斷向外界排病原菌，且兔支氣管敗血波氏桿菌血清型較多[8]，目前尚沒有商品化疫苗可用，加劇了養(yǎng)兔場對本病的防治難度[9]。

本研究從安徽北部養(yǎng)兔集中地區(qū)多個疑似發(fā)生本病的大型養(yǎng)兔場采集病料，用常規(guī)方法進行細菌分離培養(yǎng)，對分離菌株形態(tài)學、血清學、生化和藥物敏感性等進行了研究，并利用16S rRNA-PCR擴增技術加以驗證，經(jīng)鑒定此次從皖北兔場分離的菌株為兔支氣管敗血波氏桿菌。目前,多采用細菌學、血清學、免疫學方法檢測此病菌，細菌學方法比較費時費力，也不適應于大規(guī)模檢測[10]；血清學方法雖較簡便，但靈敏度低，易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象[11]；免疫學方法存在抗原制備較為繁瑣且還會出現(xiàn)批次差異；李峰等[12]采用16S rRNA基因序列測定方法鑒定兔支氣管敗血波氏桿菌;郭偉娜等[13]采用16S rRNA-PCR方法對豬源多殺性巴氏桿菌的毒力基因進行檢測，但該檢測方法存在局限性，RNA提取比較困難、極易降解，常用作細菌種屬分類。本試驗利用兔支氣管敗血波氏桿菌表面特有的絲狀血凝素蛋白基因序列設計引物，建立了一種PCR快速診斷技術，并對PCR反應體系中的鎂離子濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等反應條件進行優(yōu)化，確立了最佳的反應條件；同時對建立的PCR診斷方法的特異性和敏感性進行了檢測，顯示僅有兔波氏桿菌擴增出特異片段，在菌液濃度僅為7.2×103CFU/mL時仍能擴增出目的片段，用建立的PCR方法對宿州某肉兔場50份鼻拭子樣本進行檢測，陽性數(shù)43例，陽性率86%，是傳統(tǒng)細菌凝集法的2.53倍，證明本研究建立的PCR方法具有較強特異性和高度的敏感性，同時也表明Bb在兔群中普遍存在；此診斷方法在臨床應用時，無需像傳統(tǒng)方法那樣耗時耗力對菌株進行分離培養(yǎng)等，可直接采用煮沸法提取病菌DNA做PCR擴增就可以進行檢測，所以該PCR方法具有高效準確、簡捷快速、省時省力、低成本、一次可檢測多個樣本等優(yōu)點，本研究可用于對兔支氣管敗血波氏桿菌病的快速診斷，為兔場對本病的及時診斷、疫病鑒別、提早預防和有效防治提供理論依據(jù)。