朱慧玲，朱丹丹，陳旺，劉瀟璇

（中國(guó)藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 藥物科學(xué)研究院高端藥物制劑與材料研究中心，江蘇 南京 210009）

信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）是一類(lèi)攜帶遺傳信息的單鏈核糖核酸，可與核糖體結(jié)合進(jìn)而指導(dǎo)細(xì)胞直接合成特定的蛋白質(zhì)[1]。mRNA療法則是通過(guò)一定的手段將外源的治療性mRNA導(dǎo)入特定細(xì)胞內(nèi)，以糾正或補(bǔ)償相關(guān)基因的表達(dá)，從而達(dá)到預(yù)防或治療感染性疾病、惡性腫瘤、遺傳性疾病和罕見(jiàn)病等疾病的目的[1-5]。自從20世紀(jì)60年代mRNA被首次發(fā)現(xiàn)到新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）mRNA疫苗緊急獲批上市，mRNA療法已然成為當(dāng)今生物醫(yī)藥領(lǐng)域最具潛力的研發(fā)方向之一（見(jiàn)圖1），其被廣泛應(yīng)用于蛋白替代療法、mRNA疫苗以及基因編輯等領(lǐng)域[1-2,6-7]。例如，治療性mRNA可在病變細(xì)胞內(nèi)特異性補(bǔ)償缺失基因或突變的表達(dá)，編碼靶細(xì)胞所需功能性蛋白，進(jìn)而恢復(fù)細(xì)胞正常的功能，在蛋白質(zhì)替代治療中具有較好的應(yīng)用潛力[1]；mRNA疫苗則可編碼某些特定的抗原或細(xì)胞因子，激活或加強(qiáng)特異性免疫，從而達(dá)到預(yù)防或治療疾病的效果，如COVID-19 mRNA疫苗等[2]；此外，mRNA在基因編輯領(lǐng)域如規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9，CRISPR-Cas9）也有著廣泛應(yīng)用潛力，Cas9 mRNA可在細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)Cas9蛋白，隨后其在sgRNA指導(dǎo)下定點(diǎn)編輯特定的DNA片段，瞬時(shí)且高效地發(fā)揮強(qiáng)有力的基因編輯作用[8]。因此，mRNA療法是一種極具開(kāi)發(fā)潛力和臨床應(yīng)用前景的治療手段。目前，已獲批上市2款mRNA藥物并有69種已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

圖 1 mRNA技術(shù)發(fā)展歷程Figure 1 Timeline of the development of mRNA-based technologies

理論上，mRNA具有編碼任意蛋白的潛力，相較于DNA療法和蛋白療法，mRNA療法在應(yīng)用過(guò)程中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：1）mRNA發(fā)揮作用直接高效，無(wú)需入核即可在胞質(zhì)中啟動(dòng)功能性蛋白質(zhì)翻譯；2）mRNA具有良好的安全性，幾乎無(wú)基因組插入風(fēng)險(xiǎn)，瞬時(shí)表達(dá)所編碼的功能性蛋白；3）mRNA合成簡(jiǎn)單快捷，可大規(guī)模生產(chǎn)且成本較低；4）可針對(duì)蛋白藥物難以成藥的靶點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)[6]。然而，mRNA的穩(wěn)定性差，極易被核酸酶降解[9]，而且容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除；其次，mRNA是親水性的大分子核酸（相對(duì)分子質(zhì)量為0.3×106～5.0×106），富含陰離子基團(tuán)，難以被靶細(xì)胞攝取發(fā)揮作用[9-10]；此外，外源性mRNA可能會(huì)激活Toll樣受體（toll-like receptors，TLR），誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)（見(jiàn)圖2）[11]。因此，迫切需要安全高效遞送載體將mRNA輸送至靶細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中啟動(dòng)蛋白翻譯過(guò)程，編碼所需治療性蛋白。

圖 2 mRNA輸送的細(xì)胞內(nèi)外屏障Figure 2 The intracellular and extracellular barriers of mRNA delivery

1 mRNA遞送載體概述

目前常用的mRNA遞送載體主要分為病毒載體和非病毒載體[12]。病毒載體的mRNA遞送效率較高，但是其mRNA荷載量有限且存在一定的安全隱患。相較而言，非病毒載體能有效負(fù)載mRNA并保護(hù)其不被降解，具有較高的核酸藥物負(fù)載能力和較低的免疫原性，且適于規(guī)模化批量生產(chǎn)，被廣泛用于mRNA遞送的研究[13]。在眾多開(kāi)發(fā)的用于mRNA遞送的非病毒載體中，脂質(zhì)載體和聚合物是研究較深入和應(yīng)用較廣泛的載體（見(jiàn)圖3）[12,14-15]。尤其是被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的2款針對(duì)COVID-19的mRNA疫苗（Comirnaty和Spikevax）都是基于脂質(zhì)載體的藥物制劑[14]。本綜述將聚焦于脂質(zhì)載體和聚合物在mRNA遞送中的研究進(jìn)展，探討這些mRNA遞送體系在應(yīng)用過(guò)程中的挑戰(zhàn)與發(fā)展前景，旨在為mRNA遞送載體的開(kāi)發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化提供有價(jià)值的參考。

圖 3 脂質(zhì)和聚合物載體的mRNA遞送過(guò)程示意圖Figure 3 Lipid- and polymer-based vectors for mRNA delivery

2 脂質(zhì)載體用于mRNA遞送的研究

基于脂質(zhì)載體的mRNA遞送系統(tǒng)是目前臨床上最成熟的mRNA輸送技術(shù)之一，特別是脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles，LNP）技術(shù)[14]。此類(lèi)遞送系統(tǒng)能高效負(fù)載mRNA，促進(jìn)其被靶細(xì)胞攝取，且可通過(guò)膜擾動(dòng)方式促進(jìn)其負(fù)載mRNA快速?gòu)膬?nèi)涵體中逃逸，進(jìn)而啟動(dòng)蛋白翻譯過(guò)程（見(jiàn)圖3）[16]。LNP所介導(dǎo)的mRNA遞送系統(tǒng)通常是由mRNA、中性輔助脂質(zhì)、膽固醇及其衍生物、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）脂質(zhì)和關(guān)鍵功能性脂質(zhì)組成（見(jiàn)圖4）[17]。中性輔助脂質(zhì)一般為磷脂，對(duì)脂質(zhì)遞送系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)具有支撐和穩(wěn)定的作用，可促進(jìn)細(xì)胞攝取以提高mRNA遞送效率。膽固醇及其衍生物具有疏水性和剛性，分布于脂質(zhì)之間的間隙，可增強(qiáng)體系的流動(dòng)性。PEG脂質(zhì)主要位于納米顆粒的表面，減少在體內(nèi)與血漿蛋白的結(jié)合，提升體系的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間[14,16]。關(guān)鍵功能性脂質(zhì)是mRNA遞送和轉(zhuǎn)染效率的決定性因素，其由陽(yáng)離子或可離子化頭基、飽和或不飽和烷基長(zhǎng)鏈和連接基團(tuán)3部分組成。該類(lèi)脂質(zhì)的頭基可通過(guò)靜電相互作用與帶負(fù)電的mRNA結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，保護(hù)其免受酶降解；其疏水烷基長(zhǎng)鏈約為8～18個(gè)碳，可增強(qiáng)關(guān)鍵功能性脂質(zhì)與細(xì)胞膜的相互作用，促進(jìn)其細(xì)胞攝取與內(nèi)涵體逃逸；頭基和烷基長(zhǎng)鏈之間的連接基團(tuán)可保持脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，還可引入生物可降解基團(tuán)，以進(jìn)一步促進(jìn)mRNA釋放[18-19]。本文將介紹3類(lèi)常見(jiàn)的關(guān)鍵性功能脂質(zhì)（陽(yáng)離子脂質(zhì)、可電離脂質(zhì)和兩性離子脂質(zhì)）在mRNA遞送中的應(yīng)用，探討不同類(lèi)型頭基、疏水烷基長(zhǎng)鏈和連接基團(tuán)的合理化設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)及其對(duì)脂質(zhì)遞送載體的mRNA遞送效率的影響。

圖 4 脂質(zhì)納米顆粒/mRNA復(fù)合物的示意圖Figure 4 Schematic illustration of lipid nanoparticles/mRNA complexes

陽(yáng)離子脂質(zhì)是指頭基中含有永久正電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)（如氨基、季銨基團(tuán)、胍基等）的功能性脂質(zhì)，是應(yīng)用最早的脂質(zhì)載體。其中，1，2-雙十八烯氧基-3-甲基銨丙烷（DOTMA，1）[20]和2，3-二油氧基丙基三甲基氯化銨（DOTAP，2）[21]是目前最常見(jiàn)的用于mRNA遞送的陽(yáng)離子脂質(zhì)，例如商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000的關(guān)鍵脂質(zhì)就是選用的DOTMA。為了進(jìn)一步提高DOTMA的mRNA轉(zhuǎn)染效率和安全性，研究人員在其連接基團(tuán)中引入可降解的酯鍵得到DOTAP用于mRNA遞送。Dhaliwal等[21]研究發(fā)現(xiàn)基于DOTAP的陽(yáng)離子脂質(zhì)體能將編碼綠色熒光蛋白的mRNA（GFP mRNA）成功遞送至小鼠巨噬細(xì)胞中，并表達(dá)綠色熒光蛋白。而且，該體系能將GFP mRNA成功輸送至小鼠腦部并特異性表達(dá)靶蛋白，具有潛在治療腦部相關(guān)疾病的優(yōu)勢(shì)。此外，基于DOTAP為關(guān)鍵脂質(zhì)的LNP可以有效遞送同時(shí)編碼4種腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）的mRNA作為腫瘤疫苗，該系統(tǒng)已被用于治療黑色素瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中[22]。

研究人員針對(duì)病理微環(huán)境（如微酸環(huán)境、氧化還原環(huán)境等）的特征，充分利用敏感基團(tuán)對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)的疏水烷基長(zhǎng)鏈進(jìn)行改造。例如，Li等[23]將還原響應(yīng)的二硫鍵作為功能性脂質(zhì)的連接基團(tuán)，同時(shí)將膽固醇作為疏水結(jié)構(gòu)增強(qiáng)體系的流動(dòng)性，設(shè)計(jì)并合成了生物可降解的還原型膽固醇基陽(yáng)離子脂質(zhì)組合文庫(kù)Lipidoid（3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該系列脂質(zhì)具有較好的安全性，可成功將編碼Cre重組酶的mRNA（Cre mRNA）精準(zhǔn)遞送至Ai14轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌、肺、脾和腦，表達(dá)Cre重組酶蛋白，對(duì)DNA位點(diǎn)進(jìn)行特異性重組，發(fā)揮高效的基因編輯作用。利用類(lèi)似的策略，Li等[24]將pH敏感的環(huán)芐叉縮醛（cyclic benzylidene acetal，CBA）基團(tuán)引入到脂質(zhì)分子的尾部結(jié)構(gòu)中，設(shè)計(jì)并合成了pH響應(yīng)可降解的脂質(zhì)化合物組合文庫(kù)。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選陽(yáng)離子脂質(zhì)R-O16CBA（4）所構(gòu)建的mRNA遞送系統(tǒng)，其在宮頸癌HeLa細(xì)胞的GFP mRNA轉(zhuǎn)染活性與商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000相當(dāng)。盡管陽(yáng)離子脂質(zhì)具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但是其存在潛在的毒性和免疫原性等問(wèn)題。研究表明靜脈注射陽(yáng)離子脂質(zhì)納米顆?？赡軙?huì)導(dǎo)致小鼠肝損傷并誘導(dǎo)強(qiáng)烈的干擾素-γ反應(yīng)[25]。因此，研究人員為了改善陽(yáng)離子脂質(zhì)的安全性，進(jìn)一步提升mRNA遞送效率，開(kāi)發(fā)了新一代關(guān)鍵功能性脂質(zhì)——可電離脂質(zhì)用于mRNA遞送。

可電離脂質(zhì)是由可電離頭基、連接基團(tuán)和疏水烷基長(zhǎng)鏈組成。其可電離頭基在生理?xiàng)l件（pH =7.4）下呈中性，可在一定程度上改善脂質(zhì)載體的安全性[17,26]；可電離頭基在內(nèi)涵體/溶酶體的酸性環(huán)境（pH≤5.0）下可發(fā)生質(zhì)子化帶正電荷，破壞內(nèi)體細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，促進(jìn)mRNA釋放[12]。例如，Kim等[27]合成哌嗪類(lèi)衍生物頭基的可電離脂質(zhì)246C10（5）用于肝組織靶向性遞送mRNA，成功實(shí)現(xiàn)肝臟中基因特異性編輯。為了進(jìn)一步提升可電離脂質(zhì)的生物可降解性，研究人員在可電離脂質(zhì)的連接基團(tuán)中引入酯鍵，構(gòu)建一系列可降解型可電離脂質(zhì)。例如，Rurik等[28]開(kāi)發(fā)的基于可降解可電離脂質(zhì)的CD5特異性靶向的脂質(zhì)納米顆粒能成功將編碼成纖維細(xì)胞激活蛋白的mRNA遞送至小鼠體內(nèi)的T細(xì)胞，并表達(dá)相關(guān)蛋白，實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T），有效清除異?；钴S的成纖維細(xì)胞，緩解心臟纖維化。另一類(lèi)基于肝靶向的生物可降解可電離脂質(zhì)所構(gòu)建的mRNA遞送體系NTLA-2001能順利將Cas mRNA和靶向識(shí)別血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（recombinant transthyretin，TTR）DNA序列的單向 導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）遞送至肝臟病變細(xì)胞，治療罕見(jiàn)遺傳疾病轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（transthyretin amyloidosis，ATTR）[29]。值得一提的是，該遞送體系Ⅰ期臨床試驗(yàn)已取得優(yōu)異的治療效果，單劑給藥即可有效降低血清中的TTR水平，這也是首個(gè)基于脂質(zhì)納米技術(shù)的體內(nèi)CRISPR療法，具有突破性重大意義。同樣的，在可電離脂質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)引入可降解酯鍵，也能有效促進(jìn)mRNA的釋放，提升體系的安全性。例如，為了增強(qiáng)體系與細(xì)胞膜的相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)負(fù)載mRNA藥物的釋放，Miao等[30]以Dlin-MC3-DMA為主體結(jié)構(gòu)，在其疏水結(jié)構(gòu)中引入酯鍵和炔基，構(gòu)建了一類(lèi)生物可降解的炔烴可電離脂質(zhì)文庫(kù)。其中，優(yōu)選可電離脂質(zhì)A6（6）所構(gòu)建的mRNA遞送體系能成功將編碼熒光素酶的mRNA（Luciferase mRNA，Luc mRNA）遞送至原代肝臟細(xì)胞，作用效果持久，mRNA轉(zhuǎn)染活性遠(yuǎn)高于DLin-MC3-DMA的LNP。

除了上述兩種關(guān)鍵脂質(zhì)以外，兩性離子脂質(zhì)近年來(lái)也被廣泛用于mRNA遞送。兩性離子脂質(zhì)是指頭基同時(shí)含有陽(yáng)離子和陰離子基團(tuán)，在生理?xiàng)l件下往往帶負(fù)電或呈電中性，具有較好的血液穩(wěn)定性[16]。例如，Siegwart團(tuán)隊(duì)基于選擇性器官靶向的概念，設(shè)計(jì)并合成一系列在mRNA遞送系統(tǒng)中頗具潛力的可電離兩性磷脂[31-33]。研究人員通過(guò)調(diào)控可電離兩性磷脂的結(jié)構(gòu)，使得其所構(gòu)建的mRNA遞送系統(tǒng)可在體內(nèi)吸附不同類(lèi)型的血清蛋白，形成具有特異性的“蛋白冠”，成功將mRNA靶向遞送至小鼠的肺、脾和肝。該策略為構(gòu)建組織特異性的mRNA遞送體系提供了新思路。

3 聚合物載體用于mRNA遞送的研究

除脂質(zhì)載體外，陽(yáng)離子聚合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活、可多功能化修飾、合成工藝簡(jiǎn)單，亦被廣泛應(yīng)用于mRNA遞送，例如聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）[34-35]、聚 氨 基 酸[36-38]、聚 酯[39-41]、聚 氨 酯[poly(amino ester)，PAE][42-43]、兩性離子聚合物[44]和樹(shù)形分子[45-47]等。陽(yáng)離子聚合物載體具有豐富的正電荷，可通過(guò)靜電相互作用與mRNA結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，有效保護(hù)mRNA免受核酸酶的降解，促進(jìn)mRNA被靶細(xì)胞高效攝?。贿M(jìn)入靶細(xì)胞后，大部分陽(yáng)離子聚合物載體是通過(guò)“質(zhì)子海綿效應(yīng)”促使mRNA從內(nèi)涵體逃逸到胞質(zhì)中，以啟動(dòng)后續(xù)的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程（見(jiàn)圖3）[15,48]。

在眾多開(kāi)發(fā)的聚合物載體中，PEI是最早用于mRNA遞送的聚合物載體，具有較好的mRNA遞送能力。這主要?dú)w功于PEI結(jié)構(gòu)中含有豐富的叔胺基團(tuán)，具有較好的質(zhì)子緩沖能力，可在內(nèi)涵體酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化，促進(jìn)負(fù)載mRNA快速釋放到胞質(zhì)發(fā)揮作用[49]。然而，通常情況下，具有高核酸遞送能力的PEI多為高相對(duì)分子質(zhì)量的PEI，此類(lèi)PEI所攜帶的較高電荷密度會(huì)產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性，進(jìn)而限制其進(jìn)一步應(yīng)用。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，研究人員采用具有低毒低效的低相對(duì)分子質(zhì)量PEI代替高效高毒的PEI，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行合理化結(jié)構(gòu)改造，例如利用功能化基團(tuán)（如環(huán)糊精[34]和維生素E琥珀酸[35]等）對(duì)低相對(duì)分子質(zhì)量PEI進(jìn)行修飾，使其在擁有良好安全性的同時(shí)兼具高效的mRNA遞送能力。例如，Tan等[34]設(shè)計(jì)的環(huán)糊精修飾的低相對(duì)分子質(zhì)量PEI（CD-PEI2K）（7）不僅能夠壓縮核酸形成穩(wěn)定復(fù)合物，并且能夠延長(zhǎng)體內(nèi)的滯留時(shí)間，通過(guò)鼻腔給藥成功將編碼卵清蛋白的mRNA（ovalbumin mRNA，OVA-mRNA）遞送至小鼠淋巴，激活強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)且未發(fā)現(xiàn)毒性。類(lèi)似的，Ren等[35]將低相對(duì)分子質(zhì)量PEI（1 800）與維生素E琥珀酸共價(jià)修飾得到共聚物PVES（8）用于遞送mRNA。PVES具有優(yōu)異的mRNA遞送能力和良好的安全性，能成功將編碼新冠病毒刺突蛋白受體結(jié)合域（SARS-CoV-2 RBD）的mRNA遞送到小鼠體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，且未產(chǎn)生明顯毒性，由此表明PVES是一類(lèi)有潛力的mRNA疫苗遞送載體。

聚氨基酸及其衍生物是一類(lèi)具有良好的生物相容性的聚合物，在mRNA遞送領(lǐng)域有著較為廣泛的應(yīng)用。例如，Chan等[36]設(shè)計(jì)了PEG修飾的聚天冬氨酸（PEG-PAsp）為主鏈的聚合物，并將不同類(lèi)型的氨基乙烯重復(fù)基團(tuán)共價(jià)修飾到側(cè)鏈上（見(jiàn)圖5A），促進(jìn)伯胺基團(tuán)與mRNA靜電相互作用，有效負(fù)載mRNA形成穩(wěn)定的內(nèi)核，PEG作為親水性外殼可以有效保護(hù)核酸免被降解，延長(zhǎng)遞送體系的血液循環(huán)時(shí)間和提高生物相容性。Kataoka課題組為了增加PEG-PAsp遞送系統(tǒng)的穩(wěn)定性，在主鏈的尾部引入疏水性的膽固醇提高了mRNA壓縮能力（見(jiàn)圖5B）[37]，同時(shí)有效避免復(fù)合物在血清中解散，體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇修飾的PEG-PAsp能在小鼠異種移植胰腺癌腫瘤模型中成功遞送編碼抗血管生成蛋白的mRNA（soluble FMS-like tyrosine kinase receptor 1 mRNA，sFlt-1 mRNA），并顯著抑制胰腺癌腫瘤生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步增加膽固醇修飾PEG-PAsp的聚合物載體的穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)染效率，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在其側(cè)鏈引入苯硼酸，構(gòu)建一類(lèi)具有三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）響應(yīng)性能的mRNA遞送載體（見(jiàn)圖5C）[38]。該體系與mRNA形成復(fù)合物時(shí)，載體結(jié)構(gòu)中的苯基硼酸可與多元醇衍生的聚陽(yáng)離子嵌段共聚物絡(luò)合形成苯硼酸酯交聯(lián)結(jié)構(gòu)，提高載體與mRNA形成復(fù)合物穩(wěn)定性；同時(shí)，該體系在針對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行編碼分泌型熒光素酶的

圖 5 PEG-PAsp及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 5 Chemical structures of PEG-PAsp and its derivatives

mRNA（Gaussia luciferase mRNA，GLuc mRNA）遞送時(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)高水平的ATP可觸發(fā)苯基硼酸酯鍵的裂解，進(jìn)而加速mRNA的釋放，促進(jìn)GLuc蛋白的高表達(dá)，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效且特異性的mRNA遞送。

聚酯類(lèi)聚合物因其富含生物可降解的酯鍵，而具有良好的生物相容性和安全性，被廣泛應(yīng)用于mRNA遞送[41,50]，如聚乳酸（Polylactic acid，PLA）[51]、聚（乳酸-co-羥基乙酸）[poly(lactic-coglycolic acid)，PLGA][52]和聚氨酯等[42-43]。其中，聚氨基酯的聚合物不僅富含生物可降解酯鍵，還含有大量的叔胺基團(tuán)，因而同時(shí)具有良好的生物相容性和質(zhì)子緩沖能力，在mRNA遞送領(lǐng)域顯示出巨大的潛力[41]。如Haabeth等[53]設(shè)計(jì)合成的一系列具有電荷反轉(zhuǎn)特性的寡碳酸酯-b-α-氨基酯（charge-altering releasable transporters，CARTs，9）可在原代細(xì)胞中高效遞送OVA mRNA，同時(shí)與TLR配體（CpG）共負(fù)載，轉(zhuǎn)染并激活淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)，并用于腫瘤治療。近期，該團(tuán)隊(duì)還設(shè)計(jì)了絲氨酸酯修飾的寡碳酸酯-b-α-氨基酯（Ser–CARTs）作為mRNA遞送載體，寡肽的引入提高了生物相容性，并在體內(nèi)特異性將Luc mRNA遞送至脾[54]。此外，Patel等[55]制備的一系列超支化聚（β-氨基酯）[hyperbranched poly(β-amino ester)，hPBAE，10]可有效結(jié)合mRNA，通過(guò)霧化給藥方式將GFP mRNA順利遞送至肺上皮細(xì)胞，促進(jìn)其細(xì)胞攝取，通過(guò)“質(zhì)子海綿效應(yīng)”促進(jìn)其內(nèi)涵體逃逸，表達(dá)綠色熒光蛋白，該體系在肺部疾病治療中有較好的應(yīng)用潛力。

樹(shù)形分子是一類(lèi)具有樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)的特殊聚合物家族。相對(duì)于傳統(tǒng)的聚合物而言，樹(shù)形分子具有更為精確可控的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的多價(jià)協(xié)同作用，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域極具應(yīng)用前景，尤其是在核酸遞送方面極具潛力[56-59]。其中，聚酰胺-胺類(lèi)[Poly(amidoamine)，PAMAM]樹(shù)形分子是目前研究得最為深入且應(yīng)用最為廣泛的一類(lèi)樹(shù)形分子[60]。PAMAM樹(shù)形分子的結(jié)構(gòu)組成與多肽類(lèi)似，其分子骨架中的酰胺結(jié)構(gòu)使其具有良好的生物相容性，其高密度的多胺結(jié)構(gòu)使其能夠與核酸形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的復(fù)合物，此外，其內(nèi)部還擁有大量的叔胺基團(tuán)，使其能產(chǎn)生“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，有助于其內(nèi)涵體逃逸[61-62]。這些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)使得PAMAM樹(shù)形分子成為了一類(lèi)非常有潛力的核酸藥物載體，目前已經(jīng)上市的商品化基因轉(zhuǎn)染試劑HiPerFect的主要成分就是PAMAM樹(shù)形分子。近年來(lái)，PAMAM樹(shù)形分子在mRNA遞送方面也展現(xiàn)出了獨(dú)特的魅力。例如，Mbatha等[45]開(kāi)發(fā)了基于PAMAM樹(shù)形分子的mRNA遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于第5代PAMAM樹(shù)形分子（generation-five PAMAM dendrimer，PAMAM G5D）通過(guò)葉酸修飾并接枝金納米粒子（gold nanoparticle，AuNPs）而構(gòu)成；能與Luc mRNA結(jié)合形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，保護(hù)其不被降解，具有良好的生物安全性，成功介導(dǎo)了高效的mRNA轉(zhuǎn)染。

為了進(jìn)一步提高樹(shù)形分子載體的核酸遞送能力，研究人員將脂質(zhì)載體與樹(shù)形分子載體相結(jié)合開(kāi)發(fā)了一系列兩親性樹(shù)形分子[47]。該類(lèi)分子由疏水烷基鏈和親水樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)組成，其不僅具有脂質(zhì)載體的特性，還擁有樹(shù)形分子載體的多價(jià)協(xié)同等特點(diǎn)，在核酸藥物遞送中頗具應(yīng)用潛力[63-66]。基于此，Chahal等[46]利用脂質(zhì)化兩親性樹(shù)形分子與PEG化脂質(zhì)共組裝用于mRNA疫苗的遞送。該體系具有較好的安全性，可成功將可自我復(fù)制并表達(dá)多種抗原的自擴(kuò)增mRNA（self-amplifying mRNA，saRNA）疫苗遞送至靶細(xì)胞，單劑量即可激活殺傷性T細(xì)胞，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體免受病毒感染，如埃博拉病毒、A型流感病毒（influenza A virus, H1N1）和剛地弓形蟲(chóng)等。此外，Zhang等[67]利用模塊化正交設(shè)計(jì)策略合成了可電離兩親性Janus樹(shù)形分子（ionizable amphiphilic janus dendrimers，IAJD）庫(kù)，用于mRNA的靶向遞送[68-69]。IAJD系列分子在醋酸緩沖液中即可與mRNA共組裝形成穩(wěn)定的單一組分納米顆粒。初步研究發(fā)現(xiàn)IAJD的連接基團(tuán)和疏水烷基鏈比例與其mRNA遞送系統(tǒng)在體內(nèi)的特異性遞送密切相關(guān)，可將Luc mRNA特異性精準(zhǔn)遞送至肺、肝、脾和淋巴細(xì)胞等，如含有酰胺連接基團(tuán)的IAJD110和IAJD111可將mRNA特異性遞送至肺（見(jiàn)圖6）。然而，該系列分子的組織特異性靶向機(jī)制仍需要深入研究。

圖 6 可離子化兩親性Janus樹(shù)形分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 6 Structure of ionizable amphiphilic Janus dendrimers

4 結(jié)語(yǔ)與展望

mRNA療法在未來(lái)生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，如蛋白替代療法、mRNA疫苗、基因編輯等。脂質(zhì)載體和聚合物因其結(jié)構(gòu)靈活性和功能多樣性而被廣泛應(yīng)用于mRNA遞送。兩者均可通過(guò)非共價(jià)作用力有效負(fù)載mRNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，有效增強(qiáng)其在疾病部位的富集，促進(jìn)其被靶細(xì)胞攝取，通過(guò)細(xì)胞膜擾動(dòng)或者“質(zhì)子海綿效應(yīng)”促進(jìn)負(fù)載藥物釋放至胞質(zhì)，從而啟動(dòng)靶蛋白翻譯過(guò)程。更重要的是，研究人員通過(guò)對(duì)脂質(zhì)載體和聚合物載體進(jìn)行合理化設(shè)計(jì)，改善其安全性，賦予其病理響應(yīng)激活性能和組織細(xì)胞特異性，進(jìn)一步增強(qiáng)載體的mRNA遞送效率。盡管脂質(zhì)載體和聚合物在mRNA遞送中已取得較好的成果，但該系列載體在開(kāi)發(fā)過(guò)程中仍存在以下挑戰(zhàn)：首先，mRNA遞送載體的結(jié)構(gòu)對(duì)其組織細(xì)胞選擇靶向性的影響規(guī)律需進(jìn)一步驗(yàn)證與探究；其次，mRNA遞送載體的體內(nèi)安全性、體內(nèi)穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)行為需要進(jìn)一步深入研究；最后，針對(duì)mRNA在不同疾病中的應(yīng)用需求，迫切需要開(kāi)發(fā)疾病特異性按需遞送的新型mRNA遞送載體?？傊|(zhì)載體和聚合物在mRNA輸送中極具潛力，但其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用仍任重道遠(yuǎn)，迫切需要分子生物學(xué)、藥學(xué)、材料化學(xué)、納米科學(xué)等多學(xué)科聯(lián)合攻關(guān)。希望本文為mRNA遞送載體的合理設(shè)計(jì)提供一定的參考和幫助。