布 凡，柴劍波，白 冰，王萬宇，趙永厚

鐵死亡相關(guān)(ferroptosis-related)是一種依賴于細(xì)胞內(nèi)活性氧和細(xì)胞內(nèi)鐵的細(xì)胞死亡途徑，不同于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬，與癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)參與機(jī)體多個(gè)生理學(xué)過程，近期研究顯示鐵死亡相關(guān)lncRNAs與多種癌癥患者的預(yù)后有關(guān)[5,6]。目前，鐵死亡相關(guān)lncRNAs在HCC發(fā)病過程中的作用尚不清楚。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法獲得影響HCC患者預(yù)后的鐵死亡相關(guān)lncRNAs，為進(jìn)一步探究HCC與鐵死亡的關(guān)系以及評(píng)估HCC患者的預(yù)后提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集 自TCGA-HCC數(shù)據(jù)庫收集50例正常人和374例腫瘤患者RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。剔除臨床資料不全的數(shù)據(jù)，實(shí)際納入377例，其臨床特征見表1。下載鐵死亡數(shù)據(jù)庫，包括鐵死亡誘導(dǎo)基因、鐵死亡抑制基因和鐵死亡標(biāo)志物，去除重復(fù)基因，共篩選出246個(gè)鐵死亡相關(guān)基因。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，計(jì)算鐵死亡相關(guān)基因水平與lncRNAs的相關(guān)性，條件為P<0.001，相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值>0.6，篩選出127個(gè)與鐵死亡相關(guān)的lncRNAs。整理HCC患者臨床和病理學(xué)資料，包括性別、年齡、腫瘤分級(jí)、臨床分期、TMN分期、生存狀況和生存時(shí)間，條件為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.01，差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥2時(shí)，進(jìn)一步提取出73個(gè)差異水平的lncRNAs和80個(gè)差異水平的鐵死亡相關(guān)基因。對(duì)差異基因進(jìn)行GO/KEGG通路分析。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫HCC患者臨床信息

1.2 構(gòu)建鐵死亡相關(guān)lncRNAs預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型 以P<0.01為篩選條件，采用單變量COX回歸分析。根據(jù)鐵死亡相關(guān)IncRNA(ferroptosis-related long non-coding RNA)水平和相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)回歸系數(shù)，建立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。計(jì)算每例患者基于該模型的風(fēng)險(xiǎn)值(risk score)，并以風(fēng)險(xiǎn)值的中位數(shù)將患者分為高與低風(fēng)險(xiǎn)組。計(jì)算公式如下:風(fēng)險(xiǎn)值=基因1)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)×基因(1)水平+基因(2)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)×基因(2)水平+…+基因(n)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)×基因(n)水平。

1.3 預(yù)測(cè)諾莫圖(nomogram)分析 進(jìn)行單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA)lncRNA參與的作用通路以預(yù)測(cè)預(yù)后。P<0.05設(shè)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)DR-q<0.25為篩選條件，結(jié)合預(yù)后特征構(gòu)建諾莫圖，用于預(yù)測(cè)HCC患者1/3/5 a總生存率。

1.4 免疫與基因水平分析 應(yīng)用CIBERSORT[7，8]、ESTIMATE[9]、MCP counter[10]、ssGSEA[11]和TIMER[12]5種算法評(píng)估鐵死亡相關(guān)lncRNAs特征的高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組之間細(xì)胞成分和細(xì)胞免疫反應(yīng)的異同。應(yīng)用熱圖揭示不同算法下免疫應(yīng)答的差異。

2 結(jié)果

2.1 差異水平的鐵死亡相關(guān)lncRNA富集分析 對(duì)差異水平的鐵死亡相關(guān)lncRNAs進(jìn)行富集分析，繪制排名前30的通路(圖1、圖2)。GO功能富集分析得到762個(gè)條目，其中生物過程(BP)條目671個(gè)，細(xì)胞組成(CC)條目18個(gè)，分子功能(MF)條目73個(gè)。KEGG通路富集篩選得到56條信號(hào)通路。參與的BP主要包括細(xì)胞的化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)營養(yǎng)水平的應(yīng)答、對(duì)細(xì)胞外刺激反應(yīng)；CC主要包括細(xì)胞頂端、粘著斑、細(xì)胞-底物連接、黑素體；MF主要包括氧化還原酶活性，作用于NADPH氧化酶復(fù)合物、有機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、抗氧化活性、鐵離子結(jié)合等。參與的相關(guān)通路主要有神經(jīng)變性多種疾病通路、化學(xué)致癌作用-活性氧、癌癥中的microRNA合成、血清素能突觸、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、鐵死亡、癌癥的中心碳代謝等。

圖1 差異水平的鐵死亡相關(guān)基因KEGG富集分析

圖2 差異水平的鐵死亡相關(guān)基因GO富集分析

2.2 鐵死亡相關(guān)lncRNAs預(yù)后分析 對(duì)73個(gè)差異水平的鐵死亡相關(guān)lncRNAs進(jìn)行單變量COX分析，確定了7個(gè)基于HCC差異水平的鐵死亡相關(guān)lncRNAs(表2)。

表2 基于HCC差異水平的鐵死亡相關(guān)lncRNAs

2.3 生存結(jié)果和多變量分析 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組總生存率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.001，圖3)。同時(shí)，ROC曲線顯示預(yù)測(cè)3 a生存率的AUC為0.716，在預(yù)測(cè)HCC預(yù)后方面優(yōu)于傳統(tǒng)的臨床和病理學(xué)指標(biāo)(圖4、圖5)。通過風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)(圖6)和生存狀態(tài)(圖7)分析發(fā)現(xiàn)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與HCC患者的生存率成反比。風(fēng)險(xiǎn)熱圖顯示，本研究發(fā)現(xiàn)的較多數(shù)lncRNAs與風(fēng)險(xiǎn)模型呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步排除了2個(gè)模型基因。差異IncRNAs預(yù)測(cè)1 a、2 a、3 a生存率的AUC為0.781、0.738和0.716(圖8)。單變量COX分析顯示，IncRNAs腫瘤分期(HR：1.68，95CI：1.37～2.06)，T分型(HR：1.66，95CI：1.37～2.02)和風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)(HR：1.33，95CI：1.23～1.44)是HCC患者總體生存率的依賴性預(yù)后因素。對(duì)比多變量COX分析發(fā)現(xiàn)，IncRNAs腫瘤分期(HR：1.34，95CI：0.64～2.81)和T分型(HR：1.18，95CI：0.58～2.39)對(duì)HCC患者總體生存率的影響略有降低，而風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)(HR：1.35，95CI：1.23～1.49)基本無變化。

圖3 Kaplan-Meier生存分析

圖4 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的AUC

圖5 DCA分析風(fēng)險(xiǎn)因素

圖6 風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)圖

圖7 生存狀態(tài)圖

圖8 預(yù)測(cè)HCC患者1/2/3 a生存率

2.4 lncRNAs and mRNAs共水平網(wǎng)絡(luò)和ssGSEA基因集富集分析應(yīng)用Cytoscape軟件可視化表現(xiàn)lncRNA和mRNA之間的共水平網(wǎng)絡(luò)。低風(fēng)險(xiǎn)組與高風(fēng)險(xiǎn)組在年齡構(gòu)成、性別、TNM分期方面無顯著性差異，而低風(fēng)險(xiǎn)組腫瘤分期和分級(jí)多較高，高風(fēng)險(xiǎn)組則較低。結(jié)合臨床和病理特征與鐵死亡相關(guān)lncRNAs預(yù)后繪制諾莫圖(圖9)，預(yù)測(cè)1例55歲處于第3階段的女性患者，其1 a、3 a和5 a病死率分別為0.368、0.681和0.852。高危組富集了多個(gè)腫瘤相關(guān)通路，如均質(zhì)重組、癌癥途徑、mTOR信號(hào)通路和ERBB信號(hào)通路等。

2.5 免疫與差異mRNA水平分析基于CIBERSORT、ESTIMATE、MCP counter、ssGSEA和TIMER等5種算法繪制免疫反應(yīng)熱圖。相關(guān)性分析表明，高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組細(xì)胞溶解活性、MHCI類分子、I型、II型INF反應(yīng)存在顯著性差異(圖10)；免疫檢查點(diǎn)顯示，兩組CD44、TNFRSF4和CD276等水平也不同(圖11)。鑒于基于檢查點(diǎn)抑制劑的免疫治療的重要性，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)兩組患者之間YTHDF1、METTL3和METTL14等水平存在顯著性差異(圖12)。

圖10 ssGSEA用于檢測(cè)免疫細(xì)胞亞群和相關(guān)功能之間的關(guān)聯(lián)

圖11 高/低HCC風(fēng)險(xiǎn)人群免疫檢查點(diǎn)水平比較

圖12 高/低HCC風(fēng)險(xiǎn)人群m6A相關(guān)基因水平比較*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

3 討論

在本研究，我們首先基于TCGA數(shù)據(jù)集確定了基于HCC差異水平的鐵死亡相關(guān)lncRNAs特征，進(jìn)一步探討了腫瘤微環(huán)境下免疫浸潤細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)抑制劑在HCC患者預(yù)后中的作用。這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)揭示了鐵死亡信號(hào)通路中潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，5個(gè)差異水平的鐵死亡相關(guān)lncRNAs，即AC099850.3、LUCAT1、AL031985.3、MKLN1-AS和SREBF2-AS1，可能是HCC患者獨(dú)立的預(yù)后因素。

LUCAT1位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，可對(duì)諸多癌癥起到調(diào)節(jié)功能，如肺癌[14]、腎透明細(xì)胞癌[15]、結(jié)腸癌[16]、肝細(xì)胞癌[17]等。對(duì)HCC患者進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)LUCAT1在HCC組織具有高水平，其水平活躍度通常與患者生存周期呈負(fù)相關(guān)。因此，將LUCAT1作為預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。為了進(jìn)一步確定LUCAT1對(duì)HCC的影響方式，在HCC異種移植模型的實(shí)驗(yàn)表明，通過上調(diào)LUCAT1水平，可以顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲程度，在HCC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵的作用。轉(zhuǎn)錄因子ETS原癌基因1(ETS1)在包括HCC在內(nèi)的不同種類的癌癥中發(fā)揮了致癌作用。假設(shè)MKLN1-AS通過結(jié)合miR-22-3p介導(dǎo)EST1水平，通過采集HCC患者癌組織，采用RT-qPCR檢測(cè)MKLN1-AS水平，數(shù)據(jù)集顯示MKLN1-AS主要位于HuH7和LM3細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，HCC組織MKLN1-AS水平遠(yuǎn)高于正常組織。構(gòu)建的人體腫瘤裸鼠異種移植模型表明，沉默MKLN1-AS能夠抑制HuH7和LM3細(xì)胞增殖、血管生成、遷移和侵襲，證實(shí)了MKLN1-AS在HCC發(fā)病過程中作為致癌調(diào)節(jié)因子而發(fā)揮作用。基于多個(gè)數(shù)據(jù)庫分析MKLN1-AS和Yes相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1(YAP1)在HCC組織水平，以確定MKLN1-AS在細(xì)胞中的定位以及MKLN1-AS對(duì)HCC患者的影響。結(jié)果表明，MKLN1-AS在HCC組織水平明顯高于正常組織且主要位于HCC細(xì)胞質(zhì)，MKLN1-AS高水平能夠增強(qiáng)YAP1 mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)一步加速HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。在正常組織，MKLN1-AS可通過體內(nèi)誘導(dǎo)YAP1水平而導(dǎo)致HCC的發(fā)生。因此，可以將MKLN1-AS作為YAP1的上游因子，用于HCC的診斷和預(yù)后判斷。