劉瑋，曹威，劉浩，潘梅*

（1.桂林南藥股份有限公司，廣西 桂林 541004；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)于健康的關(guān)注和需求也日益多樣化。益生菌具有合成分泌多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，改善腸道微環(huán)境、免疫調(diào)節(jié)、抗過(guò)敏、抗感染等多種作用[1]。同時(shí)隨著對(duì)腸道科學(xué)研究的不斷深入，大眾對(duì)益生菌劑需求也日益旺盛。篩選品質(zhì)性狀優(yōu)良的菌種則是益生菌劑開(kāi)發(fā)中重要的一環(huán)。

乳酸菌是一類(lèi)可以利用糖進(jìn)行發(fā)酵代謝生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌的總稱(chēng)，在自然界中分布廣泛，其中絕大部分都是動(dòng)物體內(nèi)具有重要生理功能且必不可少的菌群[2-4]。乳酸菌具有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、維持腸道菌群生態(tài)平衡和改善機(jī)體免疫能力等功效，并以其公認(rèn)的安全性（generally recognized as safe，GRAS）在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、畜牧業(yè)等[5]。泡菜是一種中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，泡菜中微生物菌群復(fù)雜多樣，乳酸菌便是其中重要的一類(lèi)，其產(chǎn)生的多種有機(jī)酸和蛋白酶等物質(zhì)在賦予泡菜特有風(fēng)味的同時(shí)，也使泡菜具有多種保健功效，如促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、幫助人體消化、降低膽固醇以及調(diào)節(jié)生理機(jī)能等[6]，因此，泡菜成為篩選獲得性狀優(yōu)良的乳酸菌的重要來(lái)源、開(kāi)發(fā)益生菌劑的良好材料。

屎腸球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性、兼性厭氧的乳酸菌，腸球菌屬，是動(dòng)物腸道正常菌種之一，在腸道微生物菌群中占有一定比例，與其它腸道益生菌相互協(xié)作共同維持宿主的正常生理功能[7-8]，該菌具有較強(qiáng)的抗逆性，即具有耐酸堿、耐高溫、耐高鹽、對(duì)氧氣存在與否無(wú)要求、腸道黏附能力好、對(duì)部分抗生素也具備很好的耐受性等生長(zhǎng)特點(diǎn)[9]，廣泛存在于乳制品[10]、泡菜[11]、豆醬[12]以及香腸[13]等傳統(tǒng)的發(fā)酵食品中，對(duì)食品的香氣、風(fēng)味、質(zhì)地等均有一定的影響，能產(chǎn)生多種有益成分，是工業(yè)化生產(chǎn)乳酸菌制品的首選菌種之一[14-15]。

本文以從傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡菜中分離篩選獲得的一株屎腸球菌RS3為研究對(duì)象，以培養(yǎng)結(jié)束后生物量及乳酸含量為主要考核指標(biāo)，研究培養(yǎng)基中碳源、氮源、氯化鈉濃度、pH值及發(fā)酵溫度等單因素對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，進(jìn)而通過(guò)響應(yīng)面法的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定培養(yǎng)基成分及其最佳配比和培養(yǎng)溫度，實(shí)現(xiàn)屎腸球菌RS3的高效增殖培養(yǎng)，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為益生菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

泡菜：市售，取回后置于4℃冰箱保存待用。

1.1.2 試劑

蔗糖（分析純）、糖蜜（生化級(jí)）、淀粉（生化級(jí)）、牛肉膏（生化級(jí)）、瓊脂粉（生化級(jí)）、尿素（分析純）、玉米漿（生化級(jí)）：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、氯化鈉、乳糖、硫酸銨（均為分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白胨（生化級(jí)）：英國(guó)OXOID公司；血平板（成品培養(yǎng)基）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；EasyPureBacteria Genomic DNA Kit：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基制備

含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基：牛肉膏10g/L、氯化鈉5g/L、胰蛋白胨20 g/L、乳糖20 g/L，121℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂15 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

雙人超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD）：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)公司；pH計(jì)（METTLER TOLEDO）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1800）：上海美普達(dá)儀器有限公司；分析天平（BSA124S）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH-4000B）：天津市泰斯特儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-75KBS）：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分離和純化

取泡菜汁液25 mL于225 mL無(wú)菌生理鹽水中稀釋?zhuān)⒁?0倍梯度稀釋方式稀釋至10-6，將稀釋后菌液均勻涂布于含有1.5%碳酸鈣的含糖牛肉湯固體培養(yǎng)基中，于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h，挑取含有透明圈、長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的單菌落重復(fù)涂布于培養(yǎng)基中，挑取該單菌落，選取表型穩(wěn)定的單菌落為后期試驗(yàn)菌株。

1.3.2 菌株鑒定

將挑選出的菌株于含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h，收集菌體，利用EasyPureBacteria Genomic DNA Kit提取基因組DNA，以通用引物對(duì)27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增該菌株的16 S rRNA序列。PCR反應(yīng)體系：基因組1 μL，TransStartFastPfu DNA Polymerase 0.5 μL，5×FastPfu Buffer 4 μL，正反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸混合物（eoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（2.5mmol/L）2μL，加滅菌水至20μL。擴(kuò)增條件：94℃、10 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72℃、10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由金唯智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用NCBI網(wǎng)站中的BLATN 比對(duì)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

同時(shí)，對(duì)獲得的菌株進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)，包括糖發(fā)酵試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和透明圈試驗(yàn)[16]。

1.3.3 增殖培養(yǎng)

挑取單菌落，接種于裝有40 mL含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h。吸取種子培養(yǎng)液，以1%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量轉(zhuǎn)接到裝有100 mL含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h。

1.3.4 乳酸含量測(cè)定

取屎腸球菌RS3培養(yǎng)菌液2 mL于Eppendorf管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋20倍后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜柱為AminexHPX-87H 色譜柱（300 mm×7.8 mm）。檢測(cè)條件：流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4溶液、流速0.6 mL/min、柱溫為65℃、檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm、進(jìn)樣量20 μL、檢測(cè)時(shí)間 22 min。

1.3.5 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 生長(zhǎng)pH值優(yōu)化

控制含糖牛肉湯培養(yǎng)基中其他組分不變，分別將培養(yǎng)基初始pH值調(diào)整為4.0、5.0、6.0、7.0、7.2、7.5、8.0、9.0和10.0下對(duì)屎腸球菌RS3進(jìn)行增殖培養(yǎng)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.5.2 培養(yǎng)溫度優(yōu)化

控制含糖牛肉湯培養(yǎng)基中其他組分不變，分別在20、25、30、37、45 ℃的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)屎腸球菌RS3，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.5.3 乳糖濃度優(yōu)化

控制含糖牛肉湯培養(yǎng)基中其他組分不變，分別在10、15、20、25、30 g/L乳糖的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)屎腸球菌RS3，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.5.4 胰蛋白胨濃度優(yōu)化

控制含糖牛肉湯培養(yǎng)基中其他組分不變，分別在10、15、20、25、30 g/L胰蛋白胨的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)屎腸球菌RS3，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.6 中心復(fù)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

為了確定培養(yǎng)基中各種組分的最佳配比及屎腸球菌RS3最佳培養(yǎng)條件，選取培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基乳糖濃度和胰蛋白胨濃度4個(gè)影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素編碼及水平Table 1 The coding and standard of empirical factor

1.3.7 菌體生物量的測(cè)定方法

取37℃恒溫靜置培養(yǎng)12 h后的發(fā)酵液100 mL于離心管中進(jìn)行離心（4℃，10 000 r/min，15 min），收集濕菌體，用蒸餾水洗滌菌體2次后，將獲得的濕菌體置于60℃下恒溫干燥至恒重，用稱(chēng)量法測(cè)定其生物量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Design-Expert 12軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和方差分析，Origin 8軟件進(jìn)行圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化及鑒定

菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落特征及對(duì)不同碳源的發(fā)酵情況見(jiàn)圖1。

圖1 菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落特征及對(duì)不同碳源的發(fā)酵情況Fig.1 Colony characteristics of strains on different media and fermentation of different carbon sources

由圖1A可知，從泡菜中篩選分離得到一株長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的乳酸菌株RS3，菌落形態(tài)呈圓形，大而光滑具有光澤，顏色呈乳白色，質(zhì)地均勻，不透明，邊緣整齊。于含有碳酸鈣培養(yǎng)基上有透明圈產(chǎn)生（圖1B），在血平板上生長(zhǎng)菌落周?chē)霈F(xiàn)溶血圈（圖1C），在不同碳源生化管中與阿拉伯糖和甘露醇反應(yīng)呈陽(yáng)性、與山梨醇和D-棉子糖反應(yīng)呈陰性（圖1D），革蘭氏染色為陽(yáng)性菌株，16 S rRNA 測(cè)序（GenBank：MZ310419）鑒定該菌株屬于腸球菌屬（Enterococcus sp.）。綜合分析并查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]此菌株為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。

2.2 屎腸球菌RS3的生長(zhǎng)與乳酸合成的關(guān)系

益生菌劑中乳酸菌比重較大，通過(guò)在腸道中分泌乳酸使腸道微環(huán)境pH值降低，抑制致病菌侵襲繁殖，增強(qiáng)腸道免疫能力[19]。為了研究屎腸球菌RS3菌體生長(zhǎng)與乳酸合成的關(guān)系，對(duì)不同菌體生長(zhǎng)階段的菌懸液中的乳酸濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 屎腸球菌RS3菌體生長(zhǎng)與乳酸合成的關(guān)系Fig.2 The relationship between E.faecium RS3 growth and lactic acid synthesis

如圖2所示，屎腸球菌RS3乳酸的積累與菌株生長(zhǎng)相偶聯(lián)。在含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，0～2 h為延遲期，菌株生長(zhǎng)緩慢，乳酸開(kāi)始積累但水平較低；2 h～8 h為對(duì)數(shù)期，菌株生長(zhǎng)代謝均旺盛，乳酸快速積累，8 h乳酸產(chǎn)量為5.66 g/L；8 h～12 h為穩(wěn)定期，隨著菌體培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸產(chǎn)量保持穩(wěn)定。

2.3 pH值對(duì)屎腸球菌RS3生物量的影響

在以含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)整不同的初始 pH 值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、7.2、7.5、8.0、9.0以及10.0，37℃靜置培養(yǎng)12 h結(jié)束后離心收集菌體，采用恒溫稱(chēng)重法測(cè)定其生物量。不同pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different pH on bacterial growth

如圖3所示，不同培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株增殖生長(zhǎng)影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基pH值為7.0～9.0時(shí)，菌體生物量較大，在pH值為8.0時(shí)，菌體生物量達(dá)到最大值58.1mg/100 mL，而培養(yǎng)基pH值小于6.0或大于9.0時(shí)，屎腸球菌RS3的生長(zhǎng)受到顯著抑制。

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)屎腸球菌RS3生物量的影響

以含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種后分別置于20、25、30、37、40 ℃下靜置增殖培養(yǎng) 12 h，離心收集菌體，采用恒溫稱(chēng)重法測(cè)定其生物量。不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different culture temperature on bacterial growth

如圖4所示，在20℃～37℃增殖培養(yǎng)時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，屎腸球菌RS3生物量也隨之增高，而當(dāng)培養(yǎng)溫度超過(guò)37℃時(shí)，菌體生物量迅速下降，因此，屎腸球菌RS3生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)溫度為37℃，此時(shí)生物量可達(dá)61.2 mg/100 mL。

2.5 乳糖濃度對(duì)屎腸球菌RS3生物量的影響

以含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)整乳糖的終濃度分別為10、15、20、25、30 g/L進(jìn)行屎腸球菌的增殖培養(yǎng)，37℃靜置培養(yǎng)12 h后離心收集菌體，采用恒溫干燥稱(chēng)重法測(cè)得其生物量。不同乳糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同乳糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different concentration of lactose on bacterial growth

如圖5所示，乳糖濃度在10 g/L～30 g/L范圍內(nèi)對(duì)屎腸球菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)，在15 g/L～20 g/L時(shí)，生物量達(dá)到最大為61.66 mg/100 mL，當(dāng)濃度超過(guò)20 g/L時(shí)，生物量隨著濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.6 胰蛋白胨濃度對(duì)屎腸球菌RS3生物量的影響

以含糖牛肉湯液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)整胰蛋白胨的終濃度分別為10、15、20、25、30 g/L進(jìn)行屎腸球菌的增殖培養(yǎng)，37℃靜置培養(yǎng)12 h后離心收集菌體，采用恒溫干燥稱(chēng)重法測(cè)得其生物量。不同乳糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖6。

圖6 不同胰蛋白胨濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different concentration of tryptone on bacterial growth

如圖6所示，胰蛋白胨濃度在10 g/L～25 g/L范圍內(nèi)對(duì)屎腸球菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)，隨著胰蛋白胨濃度的升高，屎腸球菌RS3生物量也隨之增高，而當(dāng)胰蛋白胨濃度超過(guò)25 g/L時(shí)，菌體生物量基本維持不變。因此，屎腸球菌RS3生長(zhǎng)的最佳胰蛋白胨濃度為25 g/L，此時(shí)生物量可達(dá)61.15 mg/100 mL。

2.7 響應(yīng)面結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以菌體密度（OD600）為響應(yīng)值（Y），采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 12進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理及模型的建立，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and experimental result of central combination

續(xù)表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Experimental design and experimental result of central combination

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到關(guān)于編碼值的回歸方程，方程如下：Y=2.52+0.025A-0.13B-0.079C+0.28D+0.063AB-0.048AC+0.021AD-0.018BC-0.009 25BD+0.001 25CD-0.23A2-0.14B2-0.012C2-0.043D2。

方差分析見(jiàn)表3。

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），表明模型相關(guān)度好，即所選4個(gè)因素（pH值、培養(yǎng)溫度、乳糖濃度及胰蛋白胨濃度）之間相互效應(yīng)顯著；其次該模型的失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明該模型精確度高，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間無(wú)失擬存在。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.988 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.977 0，表明此模型可以解釋97.7%響應(yīng)值變化。表明該模型具有較好的擬合度，預(yù)測(cè)性較準(zhǔn)確。因素 B、C、D，交互項(xiàng) AB、AC 及二次項(xiàng) A2、B2和D2對(duì)菌體密度的影響均呈極顯著水平（P＜0.01）。根據(jù)F值可知，各因素對(duì)菌體密度影響的大小為胰蛋白胨濃度＞培養(yǎng)溫度＞乳糖濃度＞pH值。

表3 方差分析Table 3 Analysis of varianc

交互作用響應(yīng)面圖及等高線圖見(jiàn)圖7。

圖7 響應(yīng)面三維圖和等高線圖Fig.7 Three dimensional graphic and contour response surface diagrams

由圖7a可以看出，當(dāng)增殖培養(yǎng)溫度不變時(shí)，隨著培養(yǎng)基pH值的增加，菌體密度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)基pH值保持不變時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌體密度也是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；由圖7b可以看出，其交互項(xiàng)的作用趨勢(shì)與圖7a相似，在各因素中心點(diǎn)菌體密度最高，回歸方程具有最優(yōu)水平。根據(jù)擬合方程可以得到各個(gè)編碼所對(duì)應(yīng)真實(shí)值近似為pH 8.2、培養(yǎng)溫度37℃、乳糖15 g/L、胰蛋白胨25 g/L。經(jīng)優(yōu)化后屎腸球菌RS3發(fā)酵12 h其菌體濃度OD600的理論值可以達(dá)到2.834。

優(yōu)化前后培養(yǎng)基對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖8。

圖8 優(yōu)化前后培養(yǎng)基對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effects of optimized medium on bacterial growth

由圖8可知，屎腸球菌RS3在未優(yōu)化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)其最終生物量為63.7 mg/100 mL，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下最終生物量達(dá)到98.7 mg/100 mL，與優(yōu)化前相比提高了54.9%，同時(shí)培養(yǎng)液中乳酸含量提高了53%，達(dá)到8.81 g/L。對(duì)兩種培養(yǎng)基中菌體進(jìn)行革蘭氏染色，優(yōu)化后培養(yǎng)基中菌體生物量明顯高于優(yōu)化前培養(yǎng)條件下的菌體量（圖9）。

圖9 屎腸球菌RS3革蘭氏染色觀察（1 000×）Fig.9 Gram staining of Enterococcus faecium RS3（1 000×）

3 結(jié)論

從市售泡菜汁液中分離鑒定得到一株乳酸菌，經(jīng)生化和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定為屎腸球菌RS3。本文在單因素的基礎(chǔ)上，采用四因素五水平的響應(yīng)面分析法對(duì)屎腸球菌RS3的最適培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，得到最佳培養(yǎng)條件為乳糖15 g/L、胰蛋白胨25 g/L、牛肉膏10 g/L、氯化鈉5 g/L，培養(yǎng)基初始pH值為8.2，菌株培養(yǎng)溫度為37℃。根據(jù)優(yōu)化后培養(yǎng)條件進(jìn)行屎腸球菌RS3的增殖培養(yǎng)，其最終生物量相比于優(yōu)化前提高了54.9%，達(dá)到了98.7mg/100mL，且其乳酸含量由5.76g/L提高到8.81 g/L。綜上，本研究篩選到一株乳酸菌屎腸球菌RS3，對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，建立了菌體高效增殖培養(yǎng)條件，為其進(jìn)一步工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)開(kāi)發(fā)為益生菌劑提供參考。