王利華 張玉 鄭州廷 曹越 紀(jì)銳 方繼朝

摘要： 灰飛虱是危害中國(guó)水稻的3種主要稻飛虱之一。脂肪酶是脂肪代謝的關(guān)鍵酶，在昆蟲發(fā)育、繁殖等生理活動(dòng)中具有重要作用。為了深入研究脂肪酶（ LsLPS ）在灰飛虱生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，本研究克隆了 LsLPS 基因ORF序列，并進(jìn)行了原核表達(dá)和His標(biāo)簽融合蛋白的純化。結(jié)果顯示，灰飛虱 LsLPS 開放閱讀框長(zhǎng)1 293 ?bp，可翻譯成430個(gè)氨基酸，含有信號(hào)肽序列和PF00151結(jié)構(gòu)域。 LsLPS 連接到原核表達(dá)載體pET28a（+）-SUMO、pCold I后在表達(dá)菌株BL21（DE3）中主要以包涵體形式表達(dá)，連接到pET43.1a（+）后可在表達(dá)菌株BL21（DE3）中可溶性表達(dá)。采用pH 8.0、含20 mmol/L 咪唑的磷酸緩沖液作為平衡液，Ni-NTA純化LsLPS-pET43.1a（+）融合蛋白的純度和產(chǎn)量相對(duì)較高。

關(guān)鍵詞： 灰飛虱; 脂肪酶; ?LsLPS 基因; 原核表達(dá); Ni-NTA純化

中圖分類號(hào)： S435.112+.3?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?? 文章編號(hào)： 1000-4440（2022）03-0611-06

Prokaryotic expression and Ni-NTA purification of lipase ?LsLPS ?from ?Laodelphax striatellus

WANG Li-hua 1，2 ， ZHANG Yu 1，2 ， ZHENG Zhou-ting2， CAO Yue2， JI Rui2， FANG Ji-chao2

（1.College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China; 2.Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： Small brown planthopper （SBPH）， ?Laodelphax striatellus ， is one of the three main rice planthoppers damaging rice in China. Lipase is the key enzyme in fat metabolism and plays an important role in insect development， reproduction and other physiological activities. In order to investigate the function of lipase in the growth and development of SBPH， the ORF sequence of ?LsLPS ?gene was cloned， and the fusion protein with a His-tag was purified. The results showed that the open reading frame of ?LsLPS ?was 1 293 ?bp in length and could be translated into 430 amino acids， containing signal peptide sequence and PF00151 domain. ?LsLPS ?fusion proteins expressed using prokaryotic expression vectors pET28a（+）-SUMO and pCold I were mainly in the form of inclusion bodies in the expression strain BL21（DE3）. After connecting ?LsLPS ?with pET43.1a（+） vector， the obtained proteins were expressed in soluble forms in BL21（DE3）. The purity and yield of the fusion protein purified by Ni-NTA were relatively higher using phosphate buffer （pH 8.0） containing 20 mmol/L ?imidazole as equilibrium solution.

Key words： ?Laodelphax striatellus ; lipase; ?LsLPS ?gene; prokaryotic expression; Ni-NTA

灰飛虱（ Laodelphax striatellus ）屬于半翅目飛虱科害蟲，通過(guò)直接刺吸韌皮部或者傳播病毒病危害禾本科作物，是江淮稻區(qū)重要水稻害蟲之一。脂肪酶可將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，是生物脂肪水解的關(guān)鍵酶。在昆蟲中，還存在許多催化中心基序變異的脂肪酶，不具備水解脂肪的能力，但可在繁殖等其他生理過(guò)程中起作用，如某些雙翅目昆蟲中的中性脂肪酶、鱗翅目昆蟲的酸性脂肪酶，可充當(dāng)卵黃蛋白 [1] 。

原核表達(dá)是研究基因離體功能的重要前提和手段。目前用于原核表達(dá)的質(zhì)粒主要有pET、pGEX、pCold等系列質(zhì)粒。這些質(zhì)粒含有不同的啟動(dòng)子和融合表達(dá)標(biāo)簽，可適應(yīng)不同蛋白質(zhì)表達(dá)的需求。如pET系列載體，含有 T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄子，具有基礎(chǔ)表達(dá)水平低、誘導(dǎo)表達(dá)水平較高等優(yōu)點(diǎn)，在昆蟲外源基因原核表達(dá)中被廣泛應(yīng)用 [2-7] 。

His標(biāo)簽是蛋白質(zhì)原核表達(dá)常用的融合表達(dá)標(biāo)簽之一，具有促進(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)、對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和晶體結(jié)構(gòu)影響小、純化操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在生物蛋白質(zhì)功能研究中被廣泛使用 [8-12] 。His標(biāo)簽融合蛋白的純化常采用Ni-NTA瓊脂糖純化樹脂，其His標(biāo)簽可與Ni 2+ 螯合，從而使融合蛋白結(jié)合到純化介質(zhì)上。純化緩沖液可能影響His標(biāo)簽融合蛋白的可溶性、穩(wěn)定性、與基質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合等 [13-16] ，從而影響Ni-NTA純化效率。本研究通過(guò)篩選不同原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了灰飛虱脂肪酶 LsLPS 的可溶性表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，比較了不同化學(xué)組成、pH或咪唑濃度緩沖液純化的His標(biāo)簽融合蛋白的純度和產(chǎn)量，其研究結(jié)果不僅可為 LsLPS 的功能研究奠定基礎(chǔ)，也可為His標(biāo)簽融合蛋白的純化提供參考。

1 材料與方法

1.1 灰飛虱脂肪酶 LsLPS 基因序列分析

灰飛虱脂肪酶 LsLPS 基因序列從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，其ORF序列經(jīng)RT-PCR克隆測(cè)序驗(yàn)證。采用在線生物學(xué)軟件Computer PI/Mw計(jì)算LsLPS蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn);采用SignalP-5.0 Server預(yù)測(cè)潛在的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)及其位置;采用TMHMM Server v. 2.0預(yù)測(cè)跨膜螺旋區(qū)域;采用Pfam分析蛋白質(zhì)家族;采用ScanProsite預(yù)測(cè)是否存在絲氨酸活性位點(diǎn)。

1.2 灰飛虱脂肪酶 LsLPS 原核表達(dá)

設(shè)計(jì)含同源臂的引物進(jìn)行RT-PCR（引物序列見表1），擴(kuò)增 LsLPS ?ORF序列，然后連接到空白載體pET22b（+）、pET28a（+）、pET28a（+）-SUMO、pCold I、pET43.1a（+），轉(zhuǎn)化DH5 α 。挑單克隆測(cè)序，將測(cè)序正確的序列轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3）。擴(kuò)大培養(yǎng)后取1 ml菌液加入終濃度10%的甘油保存，其余菌液加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)，收集菌體，超聲破碎后采用12% SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。對(duì)檢測(cè)有可溶性表達(dá)的菌株，取100 μl甘油保存的表達(dá)菌株，加入20 ml LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，然后按照1%的比例轉(zhuǎn)入新鮮的培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)至 OD 600 約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h。離心收集菌體后，采用30 ml緩沖液重懸菌體，充分混勻后，平均分為6份，10 000 ?r/min 離心5 min，重新收集菌體，-80 ℃ 貯存用于Ni-NTA純化。

1.3 蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠電泳

SDS-PAGE凝膠電泳采用碧云天生物技術(shù)公司SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒。上層膠濃度為5%，下層膠濃度為12%。待凝膠凝固后將6 μl樣品加入凝膠孔中，80 V電泳20 min，然后120 V電泳約60 min，至溴酚藍(lán)指示帶遷移至凝膠近底部位置。凝膠染色采用R250染色液。

1.4 融合蛋白Ni-NTA純化

分別采用Tris-HCl緩沖液（含20 mmol/L 咪唑，pH 8.0）、磷酸緩沖液（分別含0 mmol/L 、20 mmol/L 、50 mmol/L 咪唑，pH 8.0;或者含20 mmol/L 咪唑，pH分別為7.5或8.5）重懸-80 ℃ 貯存的菌體，超聲破碎后，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，相同條件，再離心1次。取上清液，加入平衡好的層析柱中進(jìn)行Ni-NTA純化，具體步驟參考TransGen試劑盒說(shuō)明書。待上清液流出后，用10倍柱體積平衡液洗滌層析柱，直到洗出液達(dá)到 OD 280 基線值。然后依次采用50 mmol/L 、100 mmol/L 、200 mmol/L 、300 mmol/L 咪唑溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，利用Bradford快速檢測(cè)洗脫液中蛋白質(zhì)的濃度;收集洗脫液，用Bradford試劑檢測(cè)，保留有明顯藍(lán)色的洗脫液。過(guò)夜后透析，即得純化的融合蛋白溶液。

1.5 融合蛋白純度和濃度測(cè)定

融合蛋白純度根據(jù)SDS-PAGE凝膠電泳條帶灰度值計(jì)算。采用ImageJ掃描電泳條帶，以目標(biāo)條帶灰度值除以所有條帶灰度值總和得到目標(biāo)蛋白質(zhì)的純度 [17] 。融合蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用碧云天BCA試劑盒，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書。融合蛋白產(chǎn)量= 純化蛋白總產(chǎn)量× 融合蛋白純度;純化蛋白總產(chǎn)量=純化蛋白濃度×純化蛋白總體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰飛虱脂肪酶 LsLPS 基因序列特征

灰飛虱脂肪酶 LsLPS 基因開放閱讀框長(zhǎng)1 293 ?bp，可翻譯成430個(gè)氨基酸（圖1）。理論相對(duì)分子質(zhì)量為47 900 ，等電點(diǎn)為5.47。含有信號(hào)肽序列和PF00151結(jié)構(gòu)域，屬于胰脂肪酶家族，與豌豆蚜（ Acyrthosiphon pisum ）、桃蚜（ Myzus persicae ）脂肪酶 H 的氨基酸序列具有58%的一致性，但無(wú)脂肪酶的絲氨酸活性中心PS00120。其氨基酸序列第238位和243位氨基酸為苯丙氨酸，而絲氨酸活性中心在第238位對(duì)應(yīng)位置的氨基酸為亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸，第243位對(duì)應(yīng)位置的氨基酸為組氨酸、酪氨酸、色氨酸或纈氨酸（圖1）。

2.2 灰飛虱脂肪酶 LsLPS 在不同載體中的原核表達(dá)

灰飛虱脂肪酶 LsLPS 在5個(gè)原核表達(dá)載體pET28a（+）、pET22b（+）、pET28a（+）-SUMO、pCold I 、pET43.1a（+）中的表達(dá)情況如圖2所示。 LsLPS -pET28a（+）-SUMO、 LsLPS -pCold I表達(dá)的融合蛋白存在于重組大腸桿菌包涵體中， LsLPS -pET43.1a（+）表達(dá)的融合蛋白存在于菌體破碎的上清液和包涵體中， LsLPS -pET22b（+）、 LsLPS -pET28a（+）在重組大腸桿菌中無(wú)明顯表達(dá)。

2.3 LsLPS-pET43.1a（+）融合蛋白Ni-NTA純化產(chǎn)量和純度比較

2.3.1 Tris-HCl緩沖液和磷酸緩沖液純化效果比較 采用Tris-HCl或磷酸緩沖液純化LsLPS-pET43.1a（+）融合蛋白時(shí)，均可純化到目標(biāo)蛋白質(zhì)（圖3），但這2種緩沖液獲得的融合蛋白產(chǎn)量和純度存在較大的差異（表2）。

2.3.2 不同pH值磷酸緩沖液純化LsLPS-pET43.1a（+）融合蛋白效果比較 不同pH值磷酸緩沖液純化LsLPS-pET43.1a（+）融合蛋白的產(chǎn)量和純度不同（表3、圖4）。當(dāng)緩沖液pH值為8.0時(shí)，融合蛋白的產(chǎn)量和純度都相對(duì)較高。

2.3.3 含不同濃度咪唑的磷酸緩沖平衡液純化LsLPS-pET43.1a（+）融合蛋白效果比較 平衡液采用含不同濃度咪唑的磷酸緩沖液時(shí)，LsLPS-pET43.1a（+）融合蛋白的純化效果也不同（表4、圖4）。含20 mmol/L 咪唑的磷酸緩沖液作為平衡液時(shí)，融合蛋白產(chǎn)量分別為含0 mmol/L 和50 mmol/L 咪唑的磷酸緩沖液的1.3倍和7.0倍。但融合蛋白的純度以含50 mmol/L 咪唑的磷酸緩沖液最高，其次為含20 mmol/L ，含0 mmol/L 咪唑的磷酸緩沖液獲得的融合蛋白純度最低。

4 討 論

脂肪酶是脂肪水解的關(guān)鍵酶，在微生物、植物、動(dòng)物中普遍存在。中性脂肪酶具有PF00151保守結(jié)構(gòu)域，在其 N 端一般含有信號(hào)肽序列，是昆蟲最大的2個(gè)脂肪酶家族之一，在脂質(zhì)消化、儲(chǔ)存、繁殖、免疫應(yīng)答等多種生理活動(dòng)中起重要作用 ?[1] 。昆蟲約10%的中性脂肪酶缺少催化活性中心基序，不能水解脂肪，但可作為雌蟲卵黃蛋白、雄蟲副腺蛋白等行使功能 [1，18] ?；绎w虱脂肪酶 LsLPS 含有PF00151結(jié)構(gòu)域， N 端具有信號(hào)肽序列、但無(wú)催化中心基序，推測(cè)該脂肪酶極有可能無(wú)水解脂肪的活性，而是在其他生理活動(dòng)中起作用。

灰飛虱 LsLPS 在大腸桿菌中的表達(dá)受表達(dá)載體融合表達(dá)標(biāo)簽、啟動(dòng)子等影響，大腸桿菌轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)的抗終止因子（NusA）等標(biāo)簽促進(jìn) LsLPS 的表達(dá)。外源基因原核表達(dá)常因表達(dá)宿主缺乏合適的轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工機(jī)制，使其表達(dá)產(chǎn)物不能正確折疊和修飾，難以獲得大量可溶性蛋白質(zhì)。添加恰當(dāng)?shù)娜诤媳磉_(dá)標(biāo)簽是提高外源基因可溶性表達(dá)的有效策略 [19-21] 。目前常用的融合標(biāo)簽有His標(biāo)簽、硫氧還蛋白質(zhì)（Trx）、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)（MBP）、谷胱甘肽- S 轉(zhuǎn)移酶（ GST ）、鏈球菌 G 蛋白質(zhì) B1 結(jié)構(gòu)域、小泛素相關(guān)修飾蛋白質(zhì)（SUMO）以及NusA等 [22] 。僅有His標(biāo)簽的質(zhì)粒pET22b（+） 、pET28a（+）不能實(shí)現(xiàn) LsLPS 的原核表達(dá)，但 LsLPS 與NusA標(biāo)簽融合后可實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，與SUMO標(biāo)簽融合后主要以包涵體的形式表達(dá)。啟動(dòng)子、翻譯增強(qiáng)元件等對(duì) LsLPS 的原核表達(dá)也有一定的影響。pCold I載體采用冷休克啟動(dòng)子，含有翻譯增強(qiáng)元件（TEE）， LsLPS 連接到該載體后也能以包涵體的形式表達(dá)。

灰飛虱 LsLPS 融合蛋白的Ni-NTA純化產(chǎn)量和純度受緩沖液影響。金屬螯合親和層析中蛋白質(zhì)和金屬離子間的結(jié)合強(qiáng)度受金屬離子類型、親和氨基酸殘基數(shù)量及暴露程度、緩沖液離子類型、pH值大小等因素的影響 [23-26] 。Ni-NTA是純化His標(biāo)簽融合蛋白的常用方法，其純化效率受緩沖液化學(xué)組成、咪唑濃度、pH值等因素影響。咪唑是His標(biāo)簽融合蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑，可與Ni 2+ 結(jié)合，平衡液中低濃度的咪唑可以減少雜蛋白的非特異性吸附，但咪唑濃度過(guò)高，可能影響目標(biāo)蛋白的吸附，從而降低純化效率 [15，27] 。pH值可能影響蛋白質(zhì)的溶解性或蛋白質(zhì)-金屬配基的結(jié)合 [28-31] ，從而影響Ni-NTA的純化效率。灰飛虱LsLPS融合蛋白Ni-NTA純化在采用pH 8.0、含20 mmol/L 咪唑的磷酸緩沖液時(shí)目的蛋白質(zhì)產(chǎn)量和純度較高，可能與該配方緩沖液咪唑濃度、pH適中有關(guān)，這一結(jié)果可為下一步 LsLPS 的離體功能研究奠定基礎(chǔ)，也可為其他重組蛋白質(zhì)的Ni-NTA純化提供參考。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-11-30

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（20）1004];國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31572004）;江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20170072）

作者簡(jiǎn)介：王利華（1979-），女，四川仁壽人，博士，研究員，主要從事水稻害蟲發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)研究。張玉為共同第一作者。

通訊作者：方繼朝，（E-mail） fangjc126@126.com;紀(jì) 銳，（E-mail）411526774@qq.com