曾欽朦，曾亞軍，陳勝群，侯 娜

(貴州省林業(yè)科學研究院，貴陽 550005)

種質(zhì)資源為林木遺傳育種研究提供了大量的材料，但也增加了林木資源的管理成本及篩選優(yōu)良種質(zhì)材料的難度。Frankel 等[1]首次提出核心種質(zhì)(core collection)的概念，Brown[2]在1989年將其進一步發(fā)展。構(gòu)建核心種質(zhì)不僅有利于種質(zhì)資源的保存與評價，而且還能夠提高其利用效率[3-4]。構(gòu)建核心種質(zhì)時采用不同的取樣策略可確保構(gòu)建核心集合的質(zhì)量，核心種質(zhì)要求以最小資源量最大程度地表示全部資源的遺傳多樣性，因此合理的取樣比例顯得尤為重要。林木核心種質(zhì)的構(gòu)建相較于農(nóng)作物的構(gòu)建起步較晚。目前，國內(nèi)外對林木核心種質(zhì)構(gòu)建的研究主要樹種有歐洲黑楊[5]、美洲黑楊[6]、水青樹[7]、杉木[8]、杜仲[9]、樟樹[10]、大花序桉[11]、伊朗核桃[12]等。

核桃是中國乃至世界重要的果樹和木本油料樹種，因核桃仁營養(yǎng)豐富，風味獨特及用途多樣，躋身于世界著名的“四大干果”之首[13]。同時，核桃栽培在退耕還林、石漠化及水土流失治理和樹種結(jié)構(gòu)調(diào)整等方面均有積極貢獻，兼具生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益[14]。貴州核桃種植主要是核桃(Juglansregia)和泡核桃(J.sigillata)2個栽培種，以泡核桃為主。同時，泡核桃也是中國特有種。貴州省核桃研究所查閱和收集了貴州88個核桃分布縣(市、區(qū))的相關研究與開發(fā)利用圖片和政策文件，為了進一步提高貴州核桃種質(zhì)資源利用效率，挖掘其優(yōu)異基因，需進一步構(gòu)建其核心種質(zhì)資源庫。

本研究基于245份核桃種質(zhì)資源的數(shù)量性狀，通過不同取樣策略及取樣比例篩選最適宜貴州核桃核心種質(zhì)的構(gòu)建方法，并構(gòu)建核桃核心種質(zhì)資源庫，旨在為貴州核桃種質(zhì)資源保護、開發(fā)利用及新品種選育提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

根據(jù)當?shù)亓謽I(yè)部門和群眾提供的信息資料，最終選取19個縣(市、區(qū))為核桃種質(zhì)資源的調(diào)查區(qū)域，對貴州核桃種質(zhì)資源進行系統(tǒng)收集。在每個縣、鄉(xiāng)核桃資源相對集中的區(qū)域，標記調(diào)查區(qū)域的地理坐標和行政位置、海拔，調(diào)查具有優(yōu)異農(nóng)藝性狀植株的生物學性狀、生長環(huán)境。經(jīng)篩選共記錄了樹齡大于30年的核桃單株245株。本研究的試材名稱、采集地生態(tài)、地理信息及樣本數(shù)見表1。

表1 貴州核桃種質(zhì)資源采樣點信息

1.2 測定方法

從245個單株中分別采集30個大小基本一致、飽滿的堅果帶回實驗室，晾干至恒質(zhì)量后進行表型性狀的測定。堅果數(shù)量性狀中的縱徑、橫徑、側(cè)徑用游標卡尺(精度0. 01 mm)測量，單果質(zhì)量、核仁質(zhì)量用天平(精度0. 01 g)測量，果殼厚度用螺旋測微儀(精度0. 001 mm)測量。核仁脂肪及蛋白質(zhì)含量測定參考GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》[15]和GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[16]。

1.3 核心種質(zhì)構(gòu)建方法

1.3.1 主成分分析及聚類分析運用SPSS 26.0軟件將245份核桃種質(zhì)資源的13個數(shù)量性狀數(shù)據(jù)先進行標準化處理，后進行主成分分析[17]，再利用歐氏距離和組間連接法通過逐步聚類的方法對其進行聚類，得到各個體間的聚類圖。

1.3.2 取樣策略目前，大量研究構(gòu)建種質(zhì)資源的取樣比例設定在5%～40%，但若總體樣本數(shù)量少的可增加取樣比例。本研究以245份核桃種質(zhì)資源為試驗材料，設定8個取樣比例，分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%和50%，采用優(yōu)先取樣[18]、偏離度取樣[19]和隨機取樣[20]3種取樣策略進行取樣(圖1)。

(1)優(yōu)先取樣策略。根據(jù)聚類圖優(yōu)先選擇最先聚在一起、具有最大或最小表型性狀極值的遺傳材料進入下一輪聚類，若各材料均具有極值則進入下一輪聚類，若各材料均無極值則隨機選擇一個材料進入下一輪聚類。

(3)隨機取樣策略。根據(jù)聚類的原理，最低分類水平的各組遺傳材料中隨機取一個材料進入下一輪聚類，如只有一個遺傳材料，則直接進入下一輪聚類；對所取遺傳材料再次進行聚類，按同樣方法取樣，經(jīng)多次聚類、取樣，直至所取遺傳材料量達到核心種質(zhì)的構(gòu)建標準。

1.3.3 核心種質(zhì)的評價及檢驗通過13個數(shù)量性狀數(shù)據(jù)，計算出各性狀的均值、標準差、方差、變異系數(shù)等；得出均值差異百分率(MD%)、極差符合率(CR%)、方差差異百分率(VD%)、變異系數(shù)變化率(VR%)、最大值變化率(CRMAX%)、最小值變化率(CRMIN%)、平均值變化率(CRMEA%)、表型方差(VPV)和表型保留比例(RPR%)9個參數(shù)[21]，利用9個參數(shù)評價所構(gòu)建的核心種質(zhì)，構(gòu)建核心種質(zhì)的最低標準是MD%≤20%，CR%≥80%[22]。比較不同方法所構(gòu)建的核心種質(zhì)，篩選出最佳方法。將篩選的核心種質(zhì)各表型性狀進行t檢驗，驗證所構(gòu)建的核心種質(zhì)是否能有效代表原種質(zhì)。

1.3.4 核心種質(zhì)的確認采用Origin 2020b軟件，比較核心種質(zhì)與原種質(zhì)基于主成分分析的分布圖，運用SPSS 26.0軟件分別對構(gòu)建的核心種質(zhì)和原種質(zhì)進行主成分分析，得到各主成分的累計貢獻率及得分情況，以此對核心種質(zhì)進行確認，評價核心種質(zhì)遺傳多樣性的高低和結(jié)構(gòu)的保留水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析

采用SPSS 26.0軟件對245份核桃種質(zhì)資源的13個數(shù)量性狀進行主成分分析，在13個主成分因子中前5個特征值的累計貢獻率為73.89%(表2)。其中,第1主成分占32.84%，第2主成分占13.03%，第3主成分占11.13%，第4主成分占8.61%，第5主成分占8.28%，說明數(shù)量性狀的主成分累計貢獻率較分散，累計增加較緩慢。對5個特征值分別計算各主成分值，并將其主成分值利用歐氏距離對245份個體進行聚類分析。

2.2 構(gòu)建核心種質(zhì)庫的取樣策略

2.2.1 優(yōu)先取樣策略采用優(yōu)先取樣策略抽取8個比例的種質(zhì)資源，將其主成分值利用歐氏距離進行逐步聚類分析，結(jié)果見表3。其中，8個取樣比例的MD%均小于20%，CR%均大于80%，說明8個群體均符合核心種質(zhì)的構(gòu)建要求，能夠代表原群體的遺傳多樣性。極差符合率、最大值變化率和最小值變化率均為100%，變異系數(shù)變化率和表型方差隨著取樣比例的增加而減少，表型保留比例隨著取樣比例的增加而增加。當CR%≥80%，并且VR%與CR%越大，認為核心種質(zhì)越能夠代表原種質(zhì)的遺傳多樣性[15]；VPV越大，表明所構(gòu)建的核心種質(zhì)中各性狀的遺傳冗余度越小。取樣比例為5%時，VR%和VPV的值最大，分別為151.00%和22.48%，說明與其他相比，S1最能保證原種質(zhì)的遺傳多樣性，且遺傳冗余度最?。灰虼?，S1最能代表原種質(zhì)，并得到25份核桃核心種質(zhì)資源。

2.2.2 偏離度取樣策略采用偏離度取樣策略抽取8個比例的種質(zhì)資源，將其主成分值利用歐氏距離進行逐步聚類分析，結(jié)果見表4。其中，8個取樣比列的均值差異百分率均小于20%， 極差符合率均大于80%，說明8個群體均符合核心種質(zhì)的構(gòu)建要求，能夠代表原群體的遺傳多樣性。變異系數(shù)變化率、最小值變化率和表型方差均隨著取樣比例的增加而減少，最大值變化率、表型保留比例隨著取樣比例的增加而增加。當取樣比例僅在50%時，極差符合率達到100%、均值差異百分率達到0。因此，D8最能代表原種質(zhì)，并得到131份核桃核心種質(zhì)資源。

表2 貴州核桃種質(zhì)資源主成分分析結(jié)果

表3 優(yōu)先取樣策略下貴州核桃種質(zhì)資源與原種質(zhì)性狀的差異百分率

2.2.3 隨機取樣策略采用隨機取樣策略抽取8個比例的種質(zhì)資源，將其主成分值利用歐氏距離進行逐步聚類分析，結(jié)果見表5。其中，8個取樣比例的均值差異百分率均小于20%，極差符合率均大于80%，說明8個群體均符合核心種質(zhì)的構(gòu)建要求，能夠代表原群體的遺傳多樣性。最小值變化率隨著取樣比例的增加而減少，而最大值變化率、表型保留比例隨著取樣比例的增加而增加。當取樣比例僅在50%時，極差符合率達到99.37%、方差差異百分率和表型保留比例均達到最大，分別為46.15%和70.83%，因此，R8最能代表原種質(zhì)，并得到132份核桃核心種質(zhì)資源。

2.2.4 不同取樣策略的比較不同取樣策略構(gòu)建的核心種質(zhì)的參數(shù)見圖2。其中，核心種質(zhì)D8和R8的均值差異百分率均為0.00%，且D8的CR%達到100%；而核心種質(zhì) S1的均值差異百分率為7.69%。

表4 偏離度取樣策略下貴州核桃種質(zhì)資源與原種質(zhì)性狀的差異百分率

表5 隨機取樣策略下貴州核桃種質(zhì)資源與原種質(zhì)性狀的差異百分率

D8的最大值變化率、最小值變化率、平均值變化率及表型保留比例均大于R8，且平均值變化率及表型保留比例也都大于S1。綜合考慮，偏離度取樣策略(D8)更適合構(gòu)建核桃的核心種質(zhì)資源庫，共構(gòu)建131份核桃核心種質(zhì)資源。

2.3 核心種質(zhì)的評價與確認

2.3.1 核心種質(zhì)的評價在50%的取樣比例下，131份核桃核心種質(zhì)資源占原種質(zhì)資源的實際比例為53.47%。對初步構(gòu)建的核桃核心種質(zhì)進行t檢驗。由表6可知，t檢驗的結(jié)果均不顯著，說明初步構(gòu)建的核桃核心種質(zhì)具有很好的代表性，與核桃原種質(zhì)在各指標上相差不大。通過檢測核心種質(zhì)13個數(shù)量性狀的平均值、變異系數(shù)與原種質(zhì)的符合率，結(jié)果表明平均值的符合率高達97.08%以上，變異系數(shù)的符合率高達106.78%以上，說明初步構(gòu)建的131份核桃核心種質(zhì)是有效的，且具有原種質(zhì)中各性狀的變異。

2.3.2 核心種質(zhì)的確認將核桃原種質(zhì)資源和131份核心種質(zhì)資源利用主成分分析法進行確認，結(jié)果見表7和圖3。核桃原種質(zhì)和核心種質(zhì)的主成分分析結(jié)果(表7)顯示，原種質(zhì)與核心種質(zhì)均在第6個主成分時特征值小于1，原種質(zhì)與核心種質(zhì)的第5個主成分的特征值分別為1.076和1.064，累計貢獻率分別為73.89%和76.48%，說明核桃核心種質(zhì)的貢獻率要高于原種質(zhì)，核心種質(zhì)在前5個主成分上能解釋13個表型數(shù)據(jù)76.48%以上的表型方差，有效減少了遺傳冗余度。同時，圖3的主成分圖結(jié)果顯示，核桃核心種質(zhì)不僅包含了原種質(zhì)的整個分布范圍，而且外圍具有特異性狀的種質(zhì)也包含在內(nèi)，表明構(gòu)建的核桃核心種質(zhì)的實用性及代表性得以確保，能夠更有效地將原種質(zhì)的遺傳信息保留。

表7 貴州核桃原種質(zhì)與核心種質(zhì)的主成分分析

3 討論與結(jié)論

核心種質(zhì)是能以最小資源量及遺傳重復性，最大程度地表示全部資源的遺傳多樣性。因此，評價構(gòu)建的核心種質(zhì)資源庫是否合適的關鍵步驟是對構(gòu)建的核心種質(zhì)進行檢驗，檢驗其遺傳多樣性的高低以及實用性的大小[4]。前人[15]通過比較各性狀的評價參數(shù)表明均值差異百分率(MD%)、極差符合率(CR%)、方差差異百分率(VD%)和變異系數(shù)變化率(VR%)比其他評價參數(shù)能更好地反映出構(gòu)建的核心種質(zhì)資源與原種質(zhì)在均值、方差和變異系數(shù)方面的差異。構(gòu)建的核心種質(zhì)需具有異質(zhì)性、多樣性及代表性的原則[23]，早期評價核心種質(zhì)的代表性中，認為構(gòu)建核心種質(zhì)樣本的MD小于30%且VR大于70%才有效[21]；之后Hu等提出了更高的要求，認為核心種質(zhì)具有較高的代表性，其MD小于20%且CR大于80%。此外，在評價構(gòu)建核心種質(zhì)的數(shù)量性狀時，應優(yōu)先考慮CR、VD和VR。本研究構(gòu)建的131份核桃核心種質(zhì)，CR、VD、VR和MD值分別為100.00、15.38、112.23和0.00，根據(jù)前人的標準，所構(gòu)建的核心種質(zhì)是有效的。

取樣策略是構(gòu)建核心種質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，它決定哪個種質(zhì)有資格入選為核心種質(zhì)。Hu等研究表明，隨機取樣策略可以保持原種質(zhì)的遺傳多樣性形式；優(yōu)先取樣策略能夠保留原種質(zhì)資源的極端性狀及遺傳變異結(jié)構(gòu)；偏離度取樣策略能夠保留原種質(zhì)資源的最大遺傳變異水平[15]。3種取樣策略中絕大多數(shù)研究者認為其他聚類取樣策略優(yōu)于隨機取樣策略，因為隨機取樣是盡可能地獲得原種質(zhì)的無偏樣本，而無法保留原種質(zhì)有效的遺傳多樣性[24]。李長濤等[25]認為偏離度取樣策略盡可能地保存了該物種的遺傳變異，也有利于根據(jù)各類型的遺傳多樣性狀況對種質(zhì)的收集加以調(diào)節(jié)。鐘永達等利用872份中國樟樹種質(zhì)資源的表型數(shù)據(jù)進行中國樟樹初級核心種質(zhì)取樣策略的研究，結(jié)果表明優(yōu)先取樣法構(gòu)建的核心種質(zhì)是最佳的[7]。馬玉敏用297個中國野生板栗的19個表型性狀構(gòu)建核心種質(zhì)庫，表明偏離度取樣策略是應用形態(tài)數(shù)據(jù)構(gòu)建中國野生板栗核心種質(zhì)最佳的取樣策略[24]。本試驗采用的3種取樣策略分別篩選出3種核心種質(zhì)(S1、D8和R8)，優(yōu)先取樣策略和偏離度取樣策略的極差符合率達到100.00%，雖然優(yōu)先取樣策略的變異系數(shù)變化率高于偏離度取樣策略，但偏離度取樣策略的均值差異百分率為0.00%，表型保留比例遠高于優(yōu)先取樣策略，從而能更有效地保存優(yōu)異基因。因此，偏離度取樣策略是利用數(shù)量性狀數(shù)據(jù)構(gòu)建貴州核桃核心種質(zhì)最適宜的取樣策略。

確定適宜的取樣比例是構(gòu)建核心種質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。當取樣比例過高，可能會導致構(gòu)建的核心種質(zhì)的冗余較高，并且很有可能對種質(zhì)資源的保存與利用造成不利的影響；當取樣比例過低，可能會導致核心種質(zhì)的代表性和多樣性下降，甚至會引起重要的種質(zhì)資源丟失。大量的研究表明，不同物種的核心種質(zhì)構(gòu)建沒有固定的取樣比例，但總體而言原種質(zhì)數(shù)量越多則取樣比例越小，原種質(zhì)數(shù)量越少取樣比例就越大。Brown認為，當原種質(zhì)資源的數(shù)量超過3 000時，總體取樣比例在5%～10%之間[26]；近年來，大多數(shù)學者認為總體取樣比例在5%～40%之間[27]。本試驗構(gòu)建的核桃核心種質(zhì)資源共有131份，取樣比例為50%，這與Yonezawa的標準不一致，但李自超等認為，當采集的種質(zhì)資源數(shù)量越少，則取樣比例應相應加大[28]。張歡等以161份水青樹種質(zhì)資源構(gòu)建了核心種質(zhì)72份，取樣比例為45%[4]。因此，本研究構(gòu)建的核桃核心種質(zhì)資源的取樣比例是較合理的。

構(gòu)建核心種質(zhì)的異質(zhì)性和多樣性，即核心種質(zhì)需保持原種質(zhì)的形態(tài)特征及遺傳多樣性。絕大多數(shù)學者均采用主成分分析來比較核心種質(zhì)與原種質(zhì)的分布圖及分析結(jié)果來判斷核心種質(zhì)是否能夠較好地保留原種質(zhì)的形態(tài)特征和遺傳多樣性[29-30]。陳升侃等通過主成分分析對構(gòu)建的斑皮檸檬桉核心種質(zhì)進行進一步確認，結(jié)果表明前2個特征值的累計貢獻率高達94%以上，且核心種質(zhì)和原種質(zhì)的主成分分布圖具有相似的結(jié)構(gòu)，說明所構(gòu)建的核心種質(zhì)能較好地代表原種質(zhì)[31]；張歡等基于水青樹葉表型性狀構(gòu)建的核心種質(zhì)通過主成分分析進行確認，4個特征值的累計貢獻率達到83.37%[4]。本研究通過主成分分析對構(gòu)建的核桃核心種質(zhì)進行確認，前5個特征值的累計貢獻率達到76.49%，核桃核心種質(zhì)與原種質(zhì)的分布圖較為相似，這樣有效地保存了核桃原種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，并有效避免了種質(zhì)的冗余。

綜上所述，本研究基于核桃種質(zhì)資源數(shù)量性狀，分析了245份核桃種質(zhì)資源13個數(shù)量性狀的主成分，在13個主成分因子中前5個特征值的累計貢獻率為73.89%，對5個特征值分別計算各主成分值，并將其主成分值利用歐氏距離對245份個體進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)偏離度取樣策略和總體取樣比例為50%，是構(gòu)建貴州核桃核心種質(zhì)資源最適宜的方法。此方法構(gòu)建了131份核桃核心種質(zhì)資源，較好地代表原種質(zhì)的異質(zhì)性、多樣性和代表性，避免種質(zhì)資源的冗雜。核桃核心種質(zhì)的建立，為以后貴州核桃種質(zhì)資源的保護奠定了基礎，對栽培與育種的研究者來說是非常珍貴的基因庫。目前，對于核桃種質(zhì)資源的研究還處于初始階段，它所具有的特殊價值還需更進一步的挖掘。