孫凱，魏戌，朱立國，2，張平，銀河，尹遜路，朱宏偉，秦曉寬

1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.中醫(yī)正骨技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100007

腰背痛是骨傷科臨床最常見的慢性疼痛疾病，具有患病率高、疾病負(fù)擔(dān)重、容易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者工作效率和生活質(zhì)量。腰椎間盤退行性病變（lumbar intervertebral disc degeneration，LIDD）是引起腰背痛的主要原因。研究表明，在50歲以上人群中，超過80%會出現(xiàn)椎間盤退變相關(guān)病理變化。中藥治療LIDD療效顯著。前期臨床觀察顯示，壯腰通絡(luò)方可有效改善腰椎間盤突出癥患者腰膝酸軟等不適癥狀，但其作用機(jī)制尚未闡明。腰痹通膠囊作為上市中成藥廣泛用于腰腿疼痛的臨床治療，研究表明，其能提高兔椎間盤Ⅱ型膠原含量，下調(diào)腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細(xì)胞介素（IL）-1β mRNA表達(dá)，有效延緩LIDD。因此，本研究以腰痹通膠囊為對照，觀察壯腰通絡(luò)方對模型大鼠椎間盤病理變化及血清炎癥因子表達(dá)的影響，為明確其延緩LIDD的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

健康雄性SD大鼠65只，5月齡，體質(zhì)量（400±20）g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0010，動物質(zhì)量合格證號110324210101287583。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動物房，溫度（25±3）℃，相對濕度（55±10）%，12 h光暗交替，自由攝食飲水，每周更換2次墊料。實(shí)驗(yàn)操作遵守實(shí)驗(yàn)動物福利倫理原則。

1.2 藥物及制備

壯腰通絡(luò)方（杜仲15 g、熟地黃15 g、當(dāng)歸12 g、丹參12 g等9味藥組成），飲片購于中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院藥學(xué)部，由中日友好醫(yī)院制劑室制備，飲片經(jīng)煎煮、過濾后，濃縮至原藥材濃度分別為1.425、0.713、0.356 g/mL，置于-4 ℃冰箱備用。腰痹通膠囊，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，0.42 g/粒，批號18081309885，取內(nèi)容物，配制成0.025 g/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號G1340），大鼠IL-6 ELISA 試劑盒、大鼠TNF-α ELISA試劑盒、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）13抗體、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）抗體、復(fù)合消化液、抗原修復(fù)液（武漢博士德生物工程有限公司，貨號分別為EK0412、EK0526、A00420-2、BA2967-1、AR0022、AR0026）。ASP300 脫水機(jī)（德國徠卡公司），EG1150H 包埋機(jī)（德國徠卡公司），RM2235 切片機(jī)（德國徠卡公司），90型號牙科打磨機(jī)（功成醫(yī)療器械專營店），SynergyH1 酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司），TDZ4A-WS臺式低速離心機(jī)（湖南湘儀儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為空白組，其余55只為造模組。造模前12 h禁食，0.3%戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，剔除腰背部毛發(fā)，俯臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺，碘酊和75%酒精消毒，以大鼠雙側(cè)髂嵴為體表骨性定位標(biāo)志，以腰背部正中線與兩側(cè)髂后上棘連線交點(diǎn)為手術(shù)切口，沿切口上下各延伸1.5 cm左右，鈍性分離，充分暴露L～L棘突及兩側(cè)關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)，使用拉鉤撐開兩側(cè)皮膚和椎旁肌肉，咬骨鉗小心咬除L～L棘突（避免破壞椎板），牙科打磨機(jī)磨除兩側(cè)關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)，逐層縫合傷口，將傷口表面血漬擦除干凈。因麻醉及手術(shù)不當(dāng)死亡4只，剩余51只大鼠隨機(jī)分為模型組、腰痹通膠囊組及壯腰通絡(luò)方高、中、低劑量組。根據(jù)人與大鼠體表面積換算給藥劑量，壯腰通絡(luò)方高、中、低劑量組分別按22.5、11.25、5.625 g/kg灌胃（相當(dāng)于60 kg成人臨床用藥量的2、1、0.5 倍），腰痹通膠囊組按0.394 g/kg灌胃，灌胃體積10 mL/kg，空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)8周。

2.2 取材

給藥結(jié)束后，0.3%戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存，用于血清炎癥因子及生化指標(biāo)檢測。取造模腰椎節(jié)段，剔除其他組織后，將椎體及椎間盤置于4%多聚甲醛中固定，用于Masson染色及免疫組化檢測。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 Masson染色

將大鼠椎間盤組織置于4%多聚甲醛中固定1周后進(jìn)行脫鈣處理，每周更換2次脫鈣液，脫鈣3周，病理組織脫水機(jī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，切片脫蠟至水，蘇木素染色5 min，自來水沖洗5 min，鹽酸酒精分化5～10 s，蒸餾水浸洗3 min，麗春紅酸性復(fù)紅染色液染色5 min，2%冰醋酸浸洗1 min，1%磷鉬酸分化5～10 s，苯胺藍(lán)染色5 min，0.2%冰醋酸浸洗1 min，脫水、透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.3.2 血清炎癥因子及生化指標(biāo)檢測

取大鼠血清，參照ELISA 試劑盒說明書檢測TNF-α和IL-6含量，全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血尿素氮（BUN）和血肌酐（SCr）水平。

2.3.3 免疫組化檢測

椎間盤組織石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗3 次，PBS 洗2 次，檸檬酸緩沖液高壓鍋抗原修復(fù)3 min，PBS 洗2 次，每次5 min，3%HO室溫靜置10 min，PBS 洗2 次，每次5 min，分別滴加Aggrecan（1∶100）、MMP13（1∶50）一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加二抗，37 ℃孵育50 min，PBS洗3 次，每次5 min，DAB 顯色3～5 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，脫水、透明后，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察，以棕色染色為陽性表達(dá)，計(jì)算陽性表達(dá)的平均光密度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

各組大鼠一般情況良好，正常進(jìn)食，初期因造模后傷口未完全愈合，部分大鼠出現(xiàn)皮下血腫，灌胃時(shí)出現(xiàn)躁動不配合甚至傷口裂開情況。因灌胃損傷等原因，空白組、腰痹通膠囊組各死亡1只，模型組、壯腰通絡(luò)方高、中劑量組各死亡2只。最終空白組9只、模型組9只、壯腰通絡(luò)方高劑量組8只、壯腰通絡(luò)方中劑量組8 只、壯腰通絡(luò)方低劑量組10 只、腰痹通膠囊組9只。

4.1 壯腰通絡(luò)方對模型大鼠椎間盤組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠椎間盤形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，髓核細(xì)胞核呈深藍(lán)色，可見豐富的膠原間質(zhì)，排列有序，椎間盤退變程度最輕；模型組大鼠椎間盤髓核細(xì)胞明顯減少，零星分布，排列不規(guī)則，椎間盤退變程度最重；壯腰通絡(luò)方高劑量組大鼠椎間盤髓核細(xì)胞明顯減少，分布不均勻，椎間盤退變程度較重；壯腰通絡(luò)方中劑量組大鼠椎間盤髓核細(xì)胞分布較規(guī)則，可見明顯膠原纖維，椎間盤退變程度較輕；壯腰通絡(luò)方低劑量組大鼠椎間盤髓核細(xì)胞相對減少，可見膠原纖維散在分布，椎間盤退變程度相對較輕；腰痹通膠囊組大鼠椎間盤髓核細(xì)胞較多，排列較規(guī)則，可見膠原纖維分布，椎間盤退變程度較輕。見圖1。

圖1 各組大鼠椎間盤組織形態(tài)（Masson染色，×400）

4.2 壯腰通絡(luò)方對模型大鼠血清炎癥因子和生化指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α和IL-6含量增加（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TNF-α含量減少（＜0.05），壯腰通絡(luò)方中劑量組和腰痹通膠囊組大鼠血清IL-6含量減少（＜0.05）。見圖2。各組大鼠血清ALT、AST、BUN和SCr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），見圖3。

圖2 各組大鼠血清TNF-α和IL-6含量比較（，每組8～10只）

圖3 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較（，每組8～10只）

4.3 壯腰通絡(luò)方對模型大鼠椎間盤組織聚集蛋白聚糖和基質(zhì)金屬蛋白酶13表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠椎間盤組織Aggrecan表達(dá)明顯降低，MMP13表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組比較，壯腰通絡(luò)方中、低劑量組和腰痹通膠囊組大鼠椎間盤組織Aggrecan表達(dá)明顯升高，MMP13表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見圖4～圖6。

圖4 各組大鼠椎間盤組織Aggrecan陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖5 各組大鼠椎間盤組織MMP13陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖6 各組大鼠椎間盤組織Aggrecan和MMP13表達(dá)比較（，每組8～10只）

5 討論

隨著人口老齡化發(fā)展及生活方式的改變，以LIDD為代表的脊柱退行性疾病患病人數(shù)不斷增加。中醫(yī)藥在治療該類疾病中發(fā)揮了重要作用。LIDD屬中醫(yī)學(xué)“腰痛”“腰腿痛”“腰痹”等范疇，肝主筋，腎主骨，其發(fā)生發(fā)展與肝、腎等臟腑功能及陰陽平衡密切相關(guān)。《雜病源流犀燭》記載：“腰痛，精氣虛而邪客病也……腎虛，其本也；風(fēng)寒濕熱、痰飲、氣滯血瘀、閃挫，其標(biāo)也?！北静《嘁娪谥欣夏昊颊?，以肝腎虧虛為本，臨床常兼夾其他證候，如腎虛感受外邪、風(fēng)寒濕邪兼夾氣滯血瘀等。夏炳江等認(rèn)為，LIDD病機(jī)以五臟虛損為本，痰濁瘀血為標(biāo)。本研究中壯腰通絡(luò)方在補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)治法指導(dǎo)下，以杜仲、熟地黃等入肝、腎經(jīng)藥物為主。杜仲甘溫，偏于補(bǔ)陽，常用于肝腎不足之腰膝酸痛、痿軟無力之證；熟地黃微溫，偏于補(bǔ)陰，具有補(bǔ)血滋陰、益精填髓功效。二者陰陽并補(bǔ)，共奏補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、益精髓功效。腎充則骨強(qiáng)，肝充則筋健，當(dāng)歸、丹參皆可入肝經(jīng)以補(bǔ)血養(yǎng)血、活血祛瘀止痛。該方治療腰椎退行性疾病取得了較好的臨床效果。

LIDD過程復(fù)雜，髓核、纖維環(huán)、軟骨終板等重要組成部分的變化均會影響椎間盤退變。其病變與衰老、遺傳、局部異常應(yīng)力集中、炎癥因子刺激等因素密切相關(guān)。在退變過程中，椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成減少，降解酶類增加，椎間盤內(nèi)Ⅱ型膠原及蛋白聚糖含量顯著降低，Ⅰ型膠原含量顯著增加。Aggrecan是椎間盤蛋白聚糖中最重要的組成部分，通過其硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素鏈維持椎間盤組織的水合作用，其含量下降是椎間盤早期退變的標(biāo)志性事件。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠椎間盤組織Aggrecan表達(dá)降低，導(dǎo)致椎間盤滲透壓逐漸下降，進(jìn)而形成惡性循環(huán)，加速椎間盤退變。壯腰通絡(luò)方和腰痹通膠囊干預(yù)后，能延緩Aggrecan丟失。MMP13是MMPs家族的重要膠原酶，不僅能降解Ⅱ型膠原，還能降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅹ型膠原，在椎間盤及軟骨膠原破壞中扮演重要角色。本研究顯示，模型組大鼠椎間盤組織MMP13表達(dá)升高，壯腰通絡(luò)方和腰痹通膠囊能降低模型大鼠椎間盤組織MMP13表達(dá)。

在LIDD發(fā)展中，IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等炎癥因子刺激導(dǎo)致MMPs和Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶表達(dá)上調(diào)，加劇ECM降解，下調(diào)ECM合成相關(guān)基因表達(dá)。Schistad等研究表明，血清IL-6水平升高不利于腰椎疼痛患者恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，壯腰通絡(luò)方能降低大鼠血清TNF-α和IL-6含量，表明其能抑制炎癥因子表達(dá)，發(fā)揮治療LIDD作用。同時(shí)，血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明壯腰通絡(luò)方給藥后不會造成大鼠肝、腎功能損傷。

綜上所述，壯腰通絡(luò)方可有效延緩大鼠LIDD，且具有較好的安全性，其作用機(jī)制可能與延緩Aggrecan丟失、降低MMP13及血清炎癥因子水平有關(guān)。本研究初步揭示壯腰通絡(luò)方治療LIDD的作用機(jī)制，為今后深入研究奠定基礎(chǔ)。