張欣怡，林翔，劉希樵，張爍，黃宣

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率在全球消化道惡性腫瘤中居第3位。根據(jù)其癥狀，與中醫(yī)“便秘”“泄瀉”“便血”等相關(guān)，主要由于先天不足、飲食失節(jié)或外邪入侵等因素導(dǎo)致正氣虧虛，脾胃失健，濕熱毒邪積聚腸道所致。2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，是由于先天虧虛或后天飲食失節(jié)等，導(dǎo)致肺、脾、腎三臟陰液虧虛，水谷精微納運(yùn)失常，進(jìn)而出現(xiàn)多食、喜飲、多尿等典型癥狀?！爱惒⊥巍笔侵覆捎猛环椒ㄖ委熅哂邢嗤C(jī)的不同疾病。葛根芩連湯出自《傷寒論》，由葛根、黃芩、黃連、甘草組成，用于治療太陽風(fēng)寒表虛誤用下法后，腸胃損傷，邪熱入里，熱迫大腸而下利之證，后世主要用于治療邪熱下迫大腸引起的腸鳴腹瀉等。臨床表明，葛根芩連湯對于CRC和T2DM均有較好的療效。Li 等發(fā)現(xiàn)，服用葛根芩連湯的CRC患者腹痛、腹瀉、里急后重等癥狀得到明顯改善。Lv等通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根芩連湯治療后的小鼠瘤體尺寸明顯小于對照組，表明葛根芩連湯有抑制CRC腫瘤細(xì)胞生長的作用。Meta分析結(jié)果表明，葛根芩連湯對T2DM療效確切。Xu等研究顯示，葛根芩連湯對糖尿病大鼠有明顯的降糖作用。目前對于葛根芩連湯治療CRC與T2DM共同機(jī)制的研究相對不足。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法探索葛根芩連湯治療CRC和T2DM的共同作用機(jī)制，為中醫(yī)“異病同治”的深入研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選及其靶點(diǎn)獲取

通過TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）及中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）檢索葛根芩連湯組方藥物葛根、黃連、黃芩、甘草的化學(xué)成分，根據(jù)TCMSP藥代動力學(xué)參數(shù)（ADME），以口服生物利用度（OB）≥20%和類藥性（DL）≥0.1作為標(biāo)準(zhǔn)篩選活性成分。通過TCMSP檢索活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。使用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），獲得靶點(diǎn)對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)基因名（gene symbol），物種篩選條件為“human”。

1.2 疾病靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)獲取

通過TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“colorectal cancer”“rectal cancer”“colon cancer”為關(guān)鍵詞檢索CRC 相關(guān)靶點(diǎn)，以“type 2 diabetes”“diabetes mellitus,type 2”為關(guān)鍵詞檢索T2DM相關(guān)靶點(diǎn)。刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，使用Draw Venn Diagram 在線分析工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）獲得葛根芩連湯與CRC 和T2DM的交集靶點(diǎn)。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)與活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，利用Analyze Network 功能進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算度值（degree）及介數(shù)中心性（betweenness centrality），并以節(jié)點(diǎn)度值大小為主要依據(jù)構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/），設(shè)定物種為“Homo sapiens”，設(shè)定最低蛋白質(zhì)互作可信度為0.7，隱藏網(wǎng)絡(luò)中孤立靶點(diǎn)，得到蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，保存為tsv文件。利用Cytoscape3.8.2軟件Analyze Network功能對靶基因進(jìn)行拓?fù)浞治?，然后使用其CytoHubba插件，篩選度值排名前50位靶點(diǎn)，作為潛在作用靶點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/gp/index.html），選擇物種為“H.sapiens”，個(gè)性化分析（Custom Analyse），進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。篩選條件為≤0.01，將分析結(jié)果按值從小到大排列，利用微生信在線作圖工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對接

選取潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5位靶點(diǎn)作為受體蛋白，取關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)排名前5位的活性成分作為配體小分子，進(jìn)行分子對接。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中找到靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)模式，保存為“PDB”格式文件。從TCMSP下載5種活性成分的結(jié)構(gòu)模式，保存為“MOL2”格式。使用AutoDockTools1.5.6軟件對受體蛋白和配體小分子進(jìn)行去水分子、添加非極性氫、計(jì)算蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的電荷、搜索配體分子的可旋轉(zhuǎn)化學(xué)鍵等操作，并輸出為PDBQT格式文件。根據(jù)受體與配體的結(jié)構(gòu)大小設(shè)定合適的對接盒子及對接參數(shù)，設(shè)定對接形式為半柔性對接，即受體蛋白設(shè)置為剛性，配體分子設(shè)置為柔性。根據(jù)受體-配體結(jié)合能選取部分對接結(jié)果，利用PyMOL軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 葛根芩連湯活性成分與靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索及篩選，共得到葛根芩連湯活性化學(xué)成分204種，包括葛根7種、黃連21種、黃芩51種、甘草125種，其中8種為共有成分。OB值前30位活性成分見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索對應(yīng)靶蛋白，通過UniProt數(shù)據(jù)庫檢索對應(yīng)靶蛋白名稱，去重并校對后得到333個(gè)作用靶點(diǎn)。

表1 葛根芩連湯主要活性成分（OB值前30位）

2.2 疾病靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)

檢索GeneCards、TTD、DrugBank、OMIM 數(shù)據(jù)庫，經(jīng)篩選及合并去重后得到CRC相關(guān)靶點(diǎn)3 323個(gè)、T2DM相關(guān)靶點(diǎn)3 301個(gè)，將葛根芩連湯治療2種疾病的靶點(diǎn)取交集，得到210個(gè)交集靶點(diǎn)，即葛根芩連湯“異病同治”2種疾病的潛在作用靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 葛根芩連湯治療CRC和T2DM交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

由葛根芩連湯活性成分及藥物與疾病交集靶點(diǎn)構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，包括369個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 091條邊，節(jié)點(diǎn)分別為210個(gè)交集靶點(diǎn)、4種藥物和155種活性成分。關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)前5位活性成分為槲皮素（Quercetin）、芹菜素（Apigenin）、山柰酚（Kaempferol）、葛根素（Puerarin）、漢黃芩素（Wogonin）。此類成分為多目標(biāo)和多效應(yīng)化合物。槲皮素關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)最多，為123個(gè)。研究表明，槲皮素可改善糖脂代謝紊亂，能通過免疫激活和增加細(xì)胞黏附而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。PTGS2（前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2）關(guān)聯(lián)的活性成分?jǐn)?shù)量最多，有137種。前10位活性成分見表2。藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖2。

圖2 葛根芩連湯治療CRC和T2DM藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 葛根芩連湯治療CRC和T2DM藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)度值前10位活性成分

2.4 交集靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置蛋白互作可信度≥0.7，獲得包含210個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 120條邊的網(wǎng)絡(luò)，其中孤立靶點(diǎn)4個(gè)。將該網(wǎng)絡(luò)以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape3.8.2進(jìn)行拓?fù)浞治?。使用該軟件的Cytohubba插件，選取度值前50位靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖3），該網(wǎng)絡(luò)由50個(gè)節(jié)點(diǎn)、670條邊組成。AKT1（RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）、IL6（白細(xì)胞介素6）、TP53（腫瘤蛋白P53）、MAPK8（絲裂原激活蛋白激酶8）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長因子A）、TNF（腫瘤壞死因子）是葛根芩連湯治療CRC和T2DM的潛在核心靶點(diǎn)。度值前30位靶點(diǎn)及其拓?fù)浞治鼋Y(jié)果見表3。

表3 葛根芩連湯治療CRC和T2DM交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)前30位靶點(diǎn)拓?fù)浞治?/p>

圖3 葛根芩連湯治療CRC和T2DM交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析得到生物過程（BP）2 622條，細(xì)胞組分（CC）133條，分子功能（MF）206條。值前10位條目見圖4。交集靶點(diǎn)主要參與毒性物質(zhì)反應(yīng)、創(chuàng)傷應(yīng)激、對無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、凋亡信號通路等生物過程，主要分布于胞膜、囊泡空腔、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等細(xì)胞組分，與調(diào)控蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子受體等物質(zhì)的結(jié)合及活性、調(diào)節(jié)磷酸轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能關(guān)聯(lián)性較大。

圖4 葛根芩連湯治療CRC和T2DM靶點(diǎn)GO功能富集分析

KEGG通路富集分析得到通路375條，值前20位通路見圖5。交集靶點(diǎn)主要作用于癌癥、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF和IL-17信號通路、內(nèi)分泌抑制和Th17細(xì)胞分化等通路，與上述通路關(guān)聯(lián)最多的靶點(diǎn)為AKT1。

圖5 葛根芩連湯治療CRC和T2DM靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結(jié)果

一般認(rèn)為，分子對接結(jié)合能小于0 kcal/mol表明兩者之間對接良好，結(jié)合能數(shù)值越小表明兩者之間的結(jié)合越緊密。度值前5 位的核心靶蛋白分別為AKT1、TP53、IL6、MAPK8、TNF，關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)前5位的活性成分分別為槲皮素、芹菜素、山柰酚、葛根素和漢黃芩素。運(yùn)用AutoDockTools軟件對核心靶點(diǎn)與主要活性成分進(jìn)行分子對接，結(jié)果各靶點(diǎn)與活性成分的對接結(jié)合能均小于0 kcal/mol，表明受體蛋白與配體小分子之間均存在良好的結(jié)合活性，分子對接結(jié)果見表4。TP53蛋白較其他蛋白與活性成分之間有較高的結(jié)合活性，選取TP53與5種配體小分子之間的結(jié)合通過PyMOL進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖6。

表4 核心靶點(diǎn)與主要活性成分分子對接平均結(jié)合能（kcal/mol）

圖6 TP53與葛根芩連湯核心成分分子對接模式

3 討論

“異病同治”是重要的中醫(yī)治則，相關(guān)研究證實(shí)該理論用于臨床的正確性。CRC與T2DM在病機(jī)上都存在脾胃運(yùn)化失調(diào)，水谷精微輸布失常的特點(diǎn)。葛根芩連湯方中葛根有生津止渴、健脾升陽止瀉之功，黃芩和黃連有清熱解毒燥濕之力，甘草有補(bǔ)中調(diào)脾胃之效，臨床用于T2DM和CRC療效確切。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM與CRC在發(fā)病、診斷、治療等方面關(guān)系密切，T2DM會影響CRC的早期篩查。長期服用降糖藥可以改善CRC術(shù)后患者的預(yù)后，延長其生存期。有數(shù)據(jù)顯示，二甲雙胍可提高CRC患者的生存率，同時(shí)改善T2DM合并CRC患者的免疫微環(huán)境和腸道微環(huán)境。相關(guān)數(shù)據(jù)分析也發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯存在對CRC和T2DM的治療靶點(diǎn)。本研究基于中醫(yī)“異病同治”理論，以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為分析工具，從葛根芩連湯治療CRC和T2DM的共同靶點(diǎn)出發(fā)，分析其核心靶點(diǎn)及通路。

通過分析交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，得出AKT1、IL-6、TP53等是葛根芩連湯治療CRC和T2DM的潛在核心靶點(diǎn)。AKT1是AKT的主要亞型之一，是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活信號通路的中心節(jié)點(diǎn)，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）是AKT的上游蛋白，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶mTOR是AKT1的下游蛋白，三者組成的PI3K/AKT/mTOR軸是介導(dǎo)腫瘤生長代謝與轉(zhuǎn)移的經(jīng)典途徑，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)等物質(zhì)合成，抑制細(xì)胞自噬等分解代謝。研究表明，該信號通路能通過增強(qiáng)瓦伯格效應(yīng)（Warburg effect）維持腫瘤細(xì)胞的能量補(bǔ)給，并在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程（EMT）中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)CRC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。AKT1是T2DM的重要治療靶點(diǎn)。Yin等通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)，AKT1/AKT2基因變異患者T2DM 的發(fā)病率明顯升高，提示PI3K/AKT/mTOR可能參與了T2DM的發(fā)病過程。研究表明，胰島素是PI3K/AKT 途徑調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的主要配體，PI3K/AKT信號途徑激活能使過量葡萄糖轉(zhuǎn)移至胞外用于組織吸收，可以減輕肥胖和胰島素抵抗，并且有調(diào)節(jié)糖尿病患者腸道菌群的作用。Toda 等發(fā)現(xiàn)，AKT1/AKT2敲除會導(dǎo)致與胰島素受體敲除類似的糖異生基因表達(dá)增加和糖耐量受損的現(xiàn)象。本研究KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，PI3K/AKT/mTOR途徑是葛根芩連湯治療CRC和T2DM的重要通路。

IL-6可由人體多種細(xì)胞產(chǎn)生，在高壓或應(yīng)激狀態(tài)下主要通過棕色脂肪組織產(chǎn)生并持續(xù)維持在較高水平，能促進(jìn)肝臟糖原異生，導(dǎo)致機(jī)體血糖升高。酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是IL-6的下游靶點(diǎn)，IL-6/JAK2/STAT3是致癌信號通路之一，IL-6分泌增多引起STAT3升高，會抑制多種抗腫瘤細(xì)胞的成熟活化，誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制，并通過影響間充質(zhì)干細(xì)胞增殖促進(jìn)CRC的轉(zhuǎn)移。研究表明，靶向IL-6可增強(qiáng)腫瘤特異性Th1反應(yīng)，靶向IL-6或STAT3聯(lián)合免疫治療可提高抗腫瘤療效。

除上述核心靶點(diǎn)外，其余靶點(diǎn)對葛根芩連湯治療CRC和T2DM也可能發(fā)揮作用。VEGFA能促進(jìn)CRC微血管生成，是影響CRC轉(zhuǎn)移的重要因子。雌激素受體1（ESR1）能促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）表達(dá)，并提高胰島素敏感性，改善血糖穩(wěn)態(tài)。上述研究進(jìn)一步論證了中藥復(fù)方多靶點(diǎn)協(xié)同治療疾病的特色。

分子對接結(jié)果顯示，AKT1、IL-6、TP53等核心靶點(diǎn)與槲皮素、芹菜素、葛根素等葛根芩連湯的核心成分結(jié)合程度良好?？梢暬治鲲@示核心成分與TP53之間有緊密的化學(xué)鍵連接，也進(jìn)一步證明葛根芩連湯可能通過槲皮素、葛根素等成分作用于TP53、AKT1等核心靶點(diǎn)，進(jìn)而對CRC和T2DM起到改善作用。

GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，葛根芩連湯治療CRC和T2DM主要涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、影響激素分泌與物質(zhì)代謝、細(xì)胞的分化成熟凋亡等機(jī)制，提示葛根芩連湯在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面有一定的作用。此外，葛根芩連湯可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響蛋白質(zhì)及酶類的合成代謝，繼而影響癌細(xì)胞的生長或轉(zhuǎn)移，同時(shí)影響糖酵解、糖原異生等重要糖代謝途徑，在血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。在激素分泌方面，葛根芩連湯可能通過PI3K/AKT信號途徑改善胰島素抵抗進(jìn)而發(fā)揮降糖作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法對葛根芩連湯“異病同治”CRC與T2DM的作用機(jī)制進(jìn)行蛋白與通路層面的分析，表明葛根芩連湯的成分與CRC和T2DM的共同靶點(diǎn)之間存在良好的化學(xué)連接，葛根芩連湯可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)、介導(dǎo)物質(zhì)代謝、影響細(xì)胞存活/凋亡途徑等共同途徑治療CRC與T2DM，且與PI3K/AKT、IL-6/JAK2/STAT3等信號通路密切相關(guān)，可為中醫(yī)“異病同治”理論及臨床治療CRC和T2DM提供分子依據(jù)。但本研究僅為生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，仍需后續(xù)研究進(jìn)一步完善相關(guān)機(jī)制的論證。