李艷，趙麗紅，張亞林，魏鋒，馮鴻杰，朱荷琴，馮自力

（棉花生物學國家重點實驗室/中國農業(yè)科學院棉花研究所，河南安陽 455000）

棉花Gossypium hirsutum是我國重要的經濟作物，廣泛種植于新疆等地。然而隨著棉花產業(yè)快速發(fā)展，棉田連作障礙加劇，土壤微生態(tài)失衡，病原體在田間大量積累，進而導致由大麗輪枝菌Verticilliumdahliae引起的棉花黃萎病加重發(fā)生[1-2]。土傳病原真菌大麗輪枝菌具有寄主范圍廣、遺傳變異快、土壤中存活時間久、侵染過程復雜等特點[3-4]。因此，棉花黃萎病防治困難，嚴重影響棉花產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

利用拮抗微生物研發(fā)高效生物防治（簡稱為“生防”）菌劑是如今國內外研究新型生物肥料的熱點[5]。研究表明植物土傳病害不僅與植物自身抗性有關，還與植株根際土壤微生態(tài)環(huán)境密切相關。生防被認為是控制土傳病害最理想的方法，利用拮抗微生物菌劑是控制棉花黃萎病的有效手段之一。微生物菌劑不僅能拮抗病原菌，抑制病害發(fā)生，還能改善土壤微生態(tài)環(huán)境[6]。研究表明，球毛殼菌Chaetomium globosum對植物具有良好的防病促生效果[7]。趙林艷[8]研究發(fā)現球毛殼菌YIM PH30719能顯著抑制三七Panax notoginseng根腐病病原菌Fusarium oxysporum的生長。球毛殼菌No.05的發(fā)酵液對玉米Zeamays大斑病菌Setosphaeriaturcica具有較強抑制效果，在發(fā)酵液與玉米大斑病菌孢子懸浮液1∶4（體積比）混合時能完全抑制玉米大斑病菌生長[9]。同時，球毛殼菌可產生揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抗生素類物質，能夠增強植物某些組織抗氧化能力，從而誘導植物抗病性，促進植物生長[10]。尹成林[11]研究發(fā)現球毛殼菌ND35菌肥對甘薯Ipomoea batatas、馬鈴薯Solanum tuberosum、玉米、黃瓜Cucumissativus等大田作物具有良好的促生效果。

植物內生真菌可以通過抗生、競爭和產生具有抑菌活性的次生代謝產物直接抑制病原菌的侵染和增殖，或者通過誘導植物內在的抗性反應間接抵御病原菌侵染[12-13]。球毛殼菌CEF-082是從棉花健康植株中分離出來的1種內生真菌菌株，對棉花黃萎病菌具有良好抗性[14]。通過微生物發(fā)酵技術將其制成菌劑，可以用來防治棉花黃萎病。因此，本研究通過設置CEF-082單菌種菌劑不同處理方式以及不同施用量的溫室試驗和田間試驗，探討其防治棉花黃萎病的效果和對棉花的促生作用，以期為科學防治棉花黃萎病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試棉花為耐黃萎病品種魯棉研21號[15]，供試菌株為CEF-082和大麗輪枝菌強致病力菌株Vd080，均由中國農業(yè)科學院棉花研究所棉花病害課題組提供。

CEF-082固體菌劑制備方法：將CEF-082孢子懸浮液接種于滅菌后的發(fā)酵基質，在發(fā)酵培養(yǎng)瓶中發(fā)酵14 d，經過烘干粉碎制成。CEF-082菌劑孢子含量為5×108g-1。

1.2 試驗方法

1.2.1溫室試驗。CEF-082菌劑處理方式為底肥法、灌根法和包衣法。

底肥法：將CEF-082菌劑按質量分數5‰、10‰和15‰分別與滅菌蛭石沙土基質（蛭石、沙土、營養(yǎng)土的體積比為3∶2∶1，下同）均勻混合，分裝到無底紙缽（直徑為6 cm，高度為10 cm）中，上部留出2 cm高的空間，分別記為處理D5、D10、D15，以裝填未添加CEF-082菌劑的滅菌蛭石沙土基質作為對照（CK0）。澆足清水并完全浸透后，每缽播10粒棉種，每6個缽作為1個處理，4次重復，然后用滅菌后的沙子覆蓋棉種。待棉花出苗完全后進行定苗，每缽留5株。待棉花幼苗第1片真葉初現時，將紙托盤墊入每個紙缽底部，接種1×107mL-1的Vd080分生孢子懸浮液10 mL。

灌根法：按底肥法的裝填量將滅菌蛭石沙土基質裝入紙缽中，然后按照底肥法相同的方法播種、定苗、留苗。播種后15 d，將CEF-082菌劑用無菌水分別稀釋10、50、100、500倍，以每缽300 mL用量進行灌根處理，分別以T10、T50、T100、T500表示，以300 mL清水灌根作為對照（CK1）。每6個紙缽為1個處理，每處理4次重復。病原菌接種方法同底肥法所述。

包衣處理：以6 g·L-1的羧甲基纖維素鈉溶液為膠結劑，按1 kg種子200 mL的用量加至棉花種子中充分攪拌，使種子表面均勻布滿膠結劑；將CEF-082菌劑加至棉花種子中，攪拌均勻，使菌劑均勻包裹在棉花種子表面。5個包衣處理的CEF-082菌劑用量如下：50、100、200、300、350 g·kg-1，分別以B50、B100、B200、B300、B350表示，以只用包衣膠結劑包衣為對照（CK2）。將以上處理后的種子于陰涼處風干后播種于裝有滅菌蛭石沙土基質的紙缽中，播種、定苗、留苗方法同底肥法。每6個紙缽為1個處理，每處理4次重復。病原菌接種方法同底肥法所述。

生物量測定方法：棉花出苗后7周，測定棉株總生物量。每個處理中隨機選取20株，測量棉花株高。將棉花植株及根系小心從基質中挖出，用自來水輕輕沖洗，除去泥沙并用紙巾吸干。稱量植株總鮮物質質量，自根莖分界處剪斷，分別測定地上部鮮物質質量、根鮮物質質量和根長。

黃萎病病害調查：上述處理均在接菌后25 d進行發(fā)病率和病情分級調查。棉花黃萎病的病情分級參照5級分級法，并計算病情指數和防治效果（防效）[16]。

1.2.2田間試驗。試驗地為連年棉花黃萎病發(fā)病嚴重的試驗田。底肥法處理：播種時，每666.7 m2撒施2 kg的CEF-082菌劑，對照處理撒施等量未接菌的發(fā)酵基質（以下簡稱為無菌基質）。灌根處理：待棉花出苗完全后，按每666.7 m2用1kg的CEF-082菌劑進行灌根，對照為無菌基質灌根。包衣處理：按1.2.1中包衣處理方法處理棉花種子，菌劑用量為300 g·kg-1，對照只用包衣膠結劑包衣（無菌包衣）。以上3種處理按隨機區(qū)組排列，3次重復，每個小區(qū)6行，行長10 m，行距0.5 m。棉花出苗后進行定苗，每行留苗50株，株距為20 cm。

黃萎病病害調查：播種后45 d和80 d時進行調查，黃萎病調查方法參照《棉花黃萎病抗性鑒定技術規(guī)程》，并計算病情指數和防效[17]。

產量測定方法：于成熟期收取各處理小區(qū)棉花，計算籽棉產量。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2019軟件進行數據處理及作圖。用SPSS（V25.0）軟件對室內試驗數據進行單因素方差分析（經正態(tài)性檢驗，發(fā)病率數據符合方差分析的要求），選擇鄧肯多重范圍檢驗進行多重比較；田間試驗的病情指數采用t檢驗確定處理與對照的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 CEF-082菌劑在溫室試驗中對棉花黃萎病的防效

溫室條件下CEF-082菌劑3種處理對棉花黃萎病的防效結果如表1所示。在底肥法處理中，與對照CK0相比，施用一定劑量的CEF-082菌劑可不同程度降低棉花黃萎病發(fā)病率。當該菌劑施用劑量為5‰時，黃萎病發(fā)病率顯著低于對照，為37.26%，防效為43.08%；該菌劑施用劑量為15‰時，棉花黃萎病發(fā)病率高于對照。因此，5‰為底肥法施用CEF-082菌劑防治棉花黃萎病的最適宜用量。

在灌根法處理中，該菌劑對棉花黃萎病的防效隨著稀釋倍數的增加呈現先增高后降低的趨勢（表1）。其在稀釋50倍時對棉花黃萎病防效最高，其次是稀釋100倍。由此可知，CEF-082菌劑稀釋50～100倍灌根處理，對棉花黃萎病有明顯的防效。

包衣法處理中，該菌劑用量為50～350 g·kg-1時對棉花黃萎病均有一定防效，其中用量為300 g·kg-1時，棉花黃萎病發(fā)病率最低，防效為78.08%（表1）。因此，300 g·kg-1為該菌劑包衣法防治棉花黃萎病的最佳用量。

表1 溫室條件下各處理對棉花黃萎病的防效

2.2 溫室測定CEF-082菌劑對棉花幼苗的促生作用

由表2可知，底肥法施用CEF-082菌劑對棉花幼苗的生長具有顯著促進作用。菌劑施用劑量為5‰～15‰時，棉花的株高、根長、地上部鮮物質質量和總鮮物質質量均顯著高于對照CK0，其中菌劑施用劑量為10‰時，棉花總鮮物質質量增幅最大，較對照提高37.59%。

采用灌根法處理時，菌劑不同稀釋倍數對棉花幼苗生物量具有不同程度的影響（表2）。其中菌劑稀釋50倍處理時，對棉花株高、地上部鮮物質質量、總鮮物質質量的促生效果最好，與對照CK1相比棉花幼苗的地上部鮮物質質量提高了29.91%。

在菌劑包衣處理試驗中，包衣量對棉花幼苗的生物量有顯著影響（表2）。CEF-082菌劑包衣用量為50 g·kg-1時，對棉花的促生效果最好，棉花幼苗株高、根長、地上部鮮物質質量和總鮮物質質量分別較對照CK2增加10.71%、5.37%、18.48%和9.56%；而隨著該菌劑包衣用量逐漸增加，其對棉花幼苗的促生長作用逐漸減小。在棉株總鮮物質質量方面，低劑量菌劑包衣具有明顯的促進作用，但高劑量時甚至低于對照。

表2 溫室條件下各處理棉花幼苗生長指標比較

2.3 田間條件下CEF-082菌劑對棉花黃萎病的防效及對棉花產量影響

如表3所示，在田間試驗中，該菌劑在3種處理方式下均顯著減輕了棉花黃萎病的發(fā)病程度。菌劑灌根處理在播種后45 d時防效達57.15%。在播種后80 d，菌劑灌根、菌劑包衣、菌劑撒施處理對棉花黃萎病的防效分別為49.41%、46.74%和47.63%，其中菌劑灌根處理的防效最高。

表3 CEF-082菌劑在田間條件下對棉花黃萎病的防效及產量的影響

該菌劑在3種使用方式下均能提高棉花的產量，在灌根法、包衣法和底肥法處理下的籽棉產量較相應對照分別增加10.01%、6.19%和4.89%。

3 討論與結論

棉花黃萎病一直是棉花病害防治的重點和難點，目前已有的防治方式主要依靠化學農藥、微生物農藥、生物有機肥、間套作和輪作等[18-19]。大量研究實踐證明“以菌治菌”的微生物防治植物病害手段成效明顯[20-22]。CEF-082是1種棉花內生真菌，易定植并且能夠產生多種可直接作用于黃萎病菌的活性物質[14]。本研究通過在溫室和大田中設置CEF-082菌劑不同使用方式和劑量處理，對其防治棉花黃萎病效果和對棉花的促生作用進行了驗證。

在溫室試驗中，底肥法施用CEF-082菌劑在劑量為5‰時對棉花黃萎病防效最佳，達到43.08%，而當其劑量為15‰時無防效；灌根法施用CEF-082菌劑在稀釋50倍時防效最佳，達到77.15%，菌劑劑量過高或過低時，防效均降低；CEF-082菌劑進行種子包衣處理時，劑量與防效之間規(guī)律不明顯，包衣用量為300 g·kg-1時防效最高，為78.08%，其次是50 g·kg-1。出現CEF-082菌劑使用量增加而防效不明顯的原因可能是其用量過大導致棉花根系微生態(tài)紊亂，致使棉株抵御病原菌的能力下降。有研究發(fā)現，利用生防放線菌防治棉花枯黃萎病時，過低或過高的劑量都會導致生防菌的防效降低甚至無防效[23]。因此，在CEF-082菌劑實際應用中應選擇適宜的使用量。

促生作用調查結果表明，CEF-082菌劑對棉苗促生效果最佳時的使用劑量與對棉花黃萎病防效最高時的使用劑量并不完全一一對應。球毛殼菌CEF-082能夠定植到棉花植株內，并且誘導棉株的抗病性，對棉株有一定的促生長效果，菌劑對棉花的促生長機理還有待進一步深入研究。在實際應用中以菌劑的防效為主要考慮因素，其次是促生長作用。底肥法處理下，CEF-082菌劑劑量為5‰～15‰時，對棉花幼苗均具有一定促生長作用，結合對病害的防效、降低成本綜合考慮，底肥法的合理劑量為5‰；在灌根法處理下，CEF-082菌劑稀釋50倍時的防效和促生作用均最佳；包衣法使用時，結合防效與促生效果認為最適劑量為200 g·kg-1。

在田間試驗中，CEF-082菌劑灌根、包衣和撒施（底肥法）處理對棉花黃萎病都具有良好防效，并能提高棉花產量。在播種后80 d，3種處理對棉花黃萎病的防效為46.74%～49.41%，其中以灌根處理最高，這與溫室試驗的結果相似。但是該菌劑對棉花黃萎病的田間防效明顯低于溫室條件下的防效，可能是因為田間試驗存在諸多不可控因素，且土壤環(huán)境較復雜，使得其活力降低，進而導致棉株抵御病原菌效果不理想。前人也有類似的研究發(fā)現，如棉花內生真菌枝頂孢霉CEF-193處理棉花的大田防效相比溫室有所降低[24]。因此，CEF-082菌劑在田間的作用穩(wěn)定性是其應用上的一大難題，后續(xù)將進一步研究。

本研究驗證了CEF-082菌劑在3種使用方式下均能有效減輕棉花黃萎病的發(fā)病程度，對棉苗有一定的促生作用，并可提高棉花產量；初步得出了該菌劑的田間使用量范圍，可為有效防治棉花黃萎病提供技術支持。