鄭德有，顧愛(ài)星，左東云，王巧蓮，張友平，呂麗敏，程海亮，宋國(guó)立*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊 830000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000）

棉花Gossypium hirsutum在中國(guó)乃至世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位[1-2]。早期我國(guó)棉花種植都是采取直播模式，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植棉水平的提高，育苗移栽也逐漸成為部分地區(qū)棉花栽培的重要模式[3]；此外，棉花育種、病蟲(chóng)害防治等相關(guān)研究也需要在溫室進(jìn)行大量的棉苗培育。所以，高效的溫室棉花育苗成為研究的熱點(diǎn)之一。在棉花的溫室育苗過(guò)程中，會(huì)遇到多種病害的侵?jǐn)_，對(duì)棉花育苗造成極大的影響[4]。棉花枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum[5]，主要危害棉花的維管束等部位[6]，在棉花整個(gè)生育期均可侵染，造成危害[7]，且一旦發(fā)生很難根治。棉花最易在苗期感染枯萎病，染病后會(huì)導(dǎo)致幼苗生長(zhǎng)慢、根系不健全，不能很好地吸收養(yǎng)分和水分[8]，威脅棉苗生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)溫室棉花育苗移栽和實(shí)驗(yàn)室相關(guān)試驗(yàn)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

棉花枯萎病的常規(guī)防控措施包括選育抗性品種和應(yīng)用化學(xué)殺菌劑[9]，其中最有效的防控措施為選育抗性品種；但是棉花新品種的培育較為費(fèi)時(shí)，而且枯萎病菌的變異性和適應(yīng)寄主抗性的能力較強(qiáng)，常會(huì)導(dǎo)致棉花品種喪失抗性[10]，所以在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)棉花枯萎病仍要進(jìn)行化學(xué)防治[11]。目前防治棉花枯萎病的殺菌劑種類(lèi)眾多，對(duì)枯萎病的防治效果（防效）也各有不同。邱生等[12]研究發(fā)現(xiàn)寧南霉素對(duì)棉花枯萎病具有良好的防效；吡唑醚菌酯為新型廣譜性殺菌劑，對(duì)多種真菌引起的植物病害具有良好的防效，并對(duì)作物有促生長(zhǎng)作用[13]。春雷霉素，又名春日霉素，是放線菌產(chǎn)生的一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，屬于低毒農(nóng)用殺菌劑，自研發(fā)以來(lái)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，對(duì)水稻Oryza sativa稻瘟病、水稻火疫病、煙草Nicotiana tabacum葉霉病、玉米Zea mays小斑病有顯著的防治效果[14]。嘧菌環(huán)胺是具有保護(hù)、治療作用和葉片穿透及根部?jī)?nèi)吸活性的高效安全殺菌劑[15]。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑早在20世紀(jì)40年代就已應(yīng)用于棉花[16]，主要用于控制棉花定向生長(zhǎng)、塑造株型、促進(jìn)早熟和提高產(chǎn)量[17]?；舫删萚18]、Pennucci等[19]研究發(fā)現(xiàn)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑具有與殺菌劑類(lèi)似的效果，對(duì)病原菌分生孢子的形成和萌發(fā)具有抑制作用，且對(duì)植株具有促生、抗病的作用，但植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑單一使用無(wú)法達(dá)到穩(wěn)定、高效的病害防效；而植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與殺菌劑混用能將調(diào)節(jié)作用、促進(jìn)作用和治療作用同時(shí)作用于植物體上，從而達(dá)到降低用藥量、減少對(duì)環(huán)境及有益生物的危害、穩(wěn)定防治病害的效果[20]。因此，高效低毒的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與殺菌劑組合成為有效防治棉花枯萎病的重要研究方向之一。

本研究以溫室病株上分離的棉花枯萎病病原菌為材料，旨在篩選高效低毒的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與殺菌劑的組合，合理有效地防治溫室育苗過(guò)程中頻發(fā)的棉花枯萎病，減少棉花育苗過(guò)程中的棉苗損失，為溫室棉花育苗移栽及其他棉花苗期相關(guān)試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試棉花材料。試驗(yàn)所用陸地棉品種為中棉所12[21]，種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所種質(zhì)庫(kù)提供。該品種高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，兼抗枯萎病和黃萎病，纖維品質(zhì)較好。

1.1.2供試菌種。供試菌種為尖孢鐮刀菌7號(hào)生理小種（FOV7），為強(qiáng)致病力菌株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花病害實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

1.1.3供試藥劑。選用嘧菌環(huán)胺、寧南霉素、吡唑醚菌酯、乙蒜素、春雷霉素5種殺菌劑和乙烯利、萘乙酸、芐氨基嘌呤3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行試驗(yàn)，具體藥劑相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 供試藥劑名稱、有效成分含量、劑型和廠家信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1室內(nèi)毒力測(cè)定。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定5種藥劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力。設(shè)計(jì)嘧菌環(huán)胺、寧南霉素、吡唑醚菌酯、乙蒜素和春雷霉素5個(gè)質(zhì)量濃度（6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 mg·L-1）和1個(gè)空白對(duì)照（無(wú)菌水），重復(fù)3次。將殺菌劑原藥用無(wú)菌水配制成所需質(zhì)量濃度的10倍系列濃度，取5 mL配制好的藥液加入到溫度45℃左右、已滅菌的定量（45 mL）馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基中，以加入等量無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，搖勻后分別倒入3個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，制成PDA培養(yǎng)基平板（PDA平板）[22]。用直徑5 mm的打孔器在培養(yǎng)好的病原菌菌落上取同一菌齡的菌餅，然后接種在混有所試藥劑的PDA平板上，將菌餅帶菌絲的一面與培養(yǎng)基接觸。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，然后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算抑制率[23]。

抑 制 率 計(jì) 算 公 式：I＝[（D1-5）-（D2-5）]/（D1-5）×100%。式中：I為抑制率；D1為空白對(duì)照中菌落的直徑（mm）；D2為供試平板中形成的菌落直徑（mm）。

根據(jù)藥劑質(zhì)量濃度以10為底的對(duì)數(shù)值（x）與對(duì)應(yīng)抑制率的概率值（y）作回歸分析，得到回歸曲線y＝ax+b，并給出回歸曲線的決定系數(shù)（R2），計(jì)算供試藥劑對(duì)枯萎病菌的致死中濃度（EC50）[24]。

1.2.2室內(nèi)盆栽試驗(yàn)。取飽滿的棉花種子，在28℃下用無(wú)菌水浸種24 h。單獨(dú)使用殺菌劑時(shí)可直接根據(jù)藥劑的EC50進(jìn)行藥劑配制。以單獨(dú)使用試驗(yàn)篩選出的效果較好的殺菌劑與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行混用試驗(yàn)。先配制質(zhì)量濃度為所需劑量2倍的溶液，其中乙烯利、萘乙酸和芐氨基嘌呤的質(zhì)量濃度分別為20 mg·L-1、100 mg·L-1和10 mg·L-1，殺菌劑配制質(zhì)量濃度為其EC50的2倍，然后將殺菌劑與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑分別按體積比1∶1混勻。在單用和混用試驗(yàn)中，用配制好的藥劑分別進(jìn)行浸種，10 mL浸種30粒，對(duì)照采用等量無(wú)菌水浸種，2 h后將藥劑中的種子倒出晾干，等待播種。將在PDA平板上活化的病原菌接種在察氏培養(yǎng)基中，在25℃、160 r·min-1的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)4 d，將病原菌接種在滅菌的蛭石玉米培養(yǎng)基（玉米糝和蛭石按體積比1∶1混勻）中，25℃下培養(yǎng)，直至菌絲長(zhǎng)滿克氏瓶，取出培養(yǎng)物，在陰涼處風(fēng)干，備用；將制備好的病原菌蛭石玉米培養(yǎng)物以0.6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的接種量混到蛭石沙土基質(zhì)（蛭石和河沙按體積比6∶4混合）中，將混勻的基質(zhì)裝入營(yíng)養(yǎng)缽（直徑6 cm，高度6 cm）內(nèi)，將備用的棉花種子播于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，每缽播種3粒，出苗后留苗1株；每10個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽為1個(gè)處理，每處理重復(fù)3次；棉苗在日光溫室中培養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在20～30℃，土壤相對(duì)濕度在60%以上，光照良好，定時(shí)、定量澆水；由于殺菌劑單用與其混用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的高效期不同，單用殺菌劑的高效期較早，所以單用殺菌劑時(shí)在出苗后7 d觀察病情，兩者混用時(shí)在出苗后7 d和15 d時(shí)觀察發(fā)病情況[25]，計(jì)算病情指數(shù)和防效。棉花苗期枯萎病的分級(jí)、病情指數(shù)和防效計(jì)算均參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《棉花抗病蟲(chóng)性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范 第4部分：枯萎病》（GB/T 22101.4-2009）[26]。公式：病情指數(shù)＝Σ（病害級(jí)數(shù)×該病級(jí)株數(shù)）/（調(diào)查的總株數(shù)×4）×100；防效（%）＝（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

增效作用的判定采用Mansour等[27]的二元混劑等毒法。設(shè)混用藥劑分別為A和B，單用防效分別表示為Ca和Cb，混用實(shí)際防效為CS，A、B混用的理論防效為C1＝Ca+（1-Ca）×Cb，則增效系數(shù)（CTC）＝（CS-C1）×100。CTC≥20表示增效，CTC≤-20表示拮抗，-20＜CTC＜20表示相加作用。

1.2.3數(shù)據(jù)處理及分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行整理，使用IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)回歸分析計(jì)算室內(nèi)毒力回歸方程；將病情指數(shù)和防效經(jīng)過(guò)描述統(tǒng)計(jì)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，均符合正態(tài)分布，然后采用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法（least significant difference,LSD法）進(jìn)行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌的室內(nèi)毒力

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果（表2）表明，5種藥劑對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，但其抑制效果不同。在供試的5種藥劑中，寧南霉素和乙蒜素的抑菌效果較好，其EC50分別為8.034mg·L-1和16.084 mg·L-1，嘧菌環(huán)胺和吡唑醚菌酯次之；而春雷霉素EC50最高，抑菌效果較差。

表2 5種殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌的室內(nèi)毒力

2.2 室內(nèi)防效

2.2.1殺菌劑單獨(dú)使用防效。在出苗后7 d時(shí)的病情調(diào)查結(jié)果表明，5種殺菌劑單獨(dú)處理均能降低枯萎病的病情指數(shù)，但各殺菌劑間防效差異明顯。5種殺菌劑中寧南霉素的防效最顯著，乙蒜素次之，嘧菌環(huán)胺、吡唑醚菌酯和春雷霉素的防病作用相對(duì)較差，與室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果一致；因此，挑選寧南霉素和乙蒜素用于和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合防治（表3）。

表3 5種殺菌劑處理后的棉花在出苗后7 d的枯萎病病情指數(shù)及防治效果

2.2.2植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與殺菌劑組合防效。棉花出苗后7 d和15 d時(shí)的病情調(diào)查結(jié)果（表4）表明，在7 d時(shí)使用殺菌劑的防效較好，在6種組合中僅萘乙酸與寧南霉素和芐氨基嘌呤與乙蒜素組合防效略好于單用相應(yīng)的殺菌劑，增效系數(shù)為-2.52和-2.45，均表現(xiàn)為相加作用。出苗后15 d時(shí)，殺菌劑防效減弱，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑防效增強(qiáng)；6種組合中乙烯利與寧南霉素、芐氨基嘌呤與乙蒜素和萘乙酸與寧南霉素組合的病情指數(shù)均顯著低于單獨(dú)使用相應(yīng)殺菌劑；其中萘乙酸與寧南霉素組合的防效最好，顯著優(yōu)于單獨(dú)使用寧南霉素，芐氨基嘌呤與乙蒜素組合的防效次之，顯著高于單獨(dú)使用乙蒜素，這2種組合的增效系數(shù)分別為28.43和21.77，均大于20，表現(xiàn)為增效作用，剩余組合的增效系數(shù)均在-20～20，均表現(xiàn)為相加作用。

表4 不同藥劑及組合處理的棉花枯萎病病情指數(shù)、防治效果及增效作用

3 討論與結(jié)論

在棉花苗期多種病害中，枯萎病對(duì)育苗具有嚴(yán)重威脅，是棉花生產(chǎn)中常見(jiàn)的毀滅性病害[28]；因此，篩選出綠色安全的防治棉花枯萎病藥劑對(duì)棉花種植具有重要的意義。

已有研究表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與殺菌劑混用對(duì)棉花病害具有很好的防效。蔣家珍等[29]發(fā)現(xiàn)使用油菜素內(nèi)酯與丙環(huán)唑混合拌種對(duì)棉苗紅腐病、立枯病、炭疽病均有很好的防效；王成菊等[30-31]研究表明利用多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與殺菌劑組合對(duì)棉花立枯病進(jìn)行防治也有很好的效果，而且增效作用明顯。本研究發(fā)現(xiàn)使用3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與殺菌劑組合拌種對(duì)棉花枯萎病具有良好的防效和增效作用，其中萘乙酸與寧南霉素組合防效最好，在出苗后15 d時(shí)增效系數(shù)可達(dá)28.43。

本研究結(jié)果可為溫室棉花育苗過(guò)程中棉花枯萎病的防治提供一定的參考。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和殺菌劑組合拌種可以延緩棉花枯萎病抗藥性發(fā)生，同時(shí)可以提高藥效，進(jìn)而有效降低藥劑的使用量。在本研究中，萘乙酸與寧南霉素組合拌種在出苗后15 d時(shí)對(duì)棉花枯萎病的防效顯著高于單獨(dú)使用殺菌劑和其他組合，因此在溫室育苗過(guò)程中建議使用萘乙酸與寧南霉素拌種進(jìn)行棉花枯萎病的防治。但本研究只進(jìn)行了室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，環(huán)境條件較為穩(wěn)定，而大田環(huán)境復(fù)雜多樣，因此該藥劑組合在田間應(yīng)用能否獲得穩(wěn)定持久的防效還有待驗(yàn)證。