陳耘東，田心保，張金晨,2，賴喆鎣，李小龍，田富寶，林瑞珠,2△，許建峰,2△

(1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，銀川 750004)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床最常見的OA類型，常累及關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織，如關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨和滑膜，最終導致患者膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙[1，2]，其發(fā)病率高、病程長，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨在KOA發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5，6]。成骨細胞作為軟骨下骨中維持骨形成的主要細胞，其凋亡加速會抑制軟骨下骨形成，導致骨重塑失衡，破壞骨穩(wěn)態(tài)，引發(fā)KOA的演變[7，8]。成骨細胞的凋亡與死亡因子(factor associated suicide，F(xiàn)as)、Fas配體(fas ligand，F(xiàn)asL)表達密切相關(guān)[9]，是介導細胞凋亡信號傳導途徑的重要系統(tǒng)。FasL是Fas的配體，通過與Fas結(jié)合激活凋亡信號，使其由細胞表面?zhèn)鲗е良毎麅?nèi)，促進一系列酶介導的級聯(lián)反應，并最終誘導細胞凋亡[10]。因此，調(diào)控軟骨下骨成骨細胞的凋亡及其增殖活化、延緩其功能衰退成為控制KOA病情發(fā)展的關(guān)鍵。目前，對于KOA還沒有很好的治療方法，主要采用非甾體消炎藥物、基因療法、針刺、中藥、手術(shù)等，所有治療方法都是為改善癥狀及關(guān)節(jié)功能[11，12]。團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)熱針療法對KOA實驗兔具有良好的治療效果[13]，但內(nèi)熱針治療KOA作用機制的認識還較缺乏了解。因此本實驗擬探討內(nèi)熱針對兔KOA模型的治療效果，分析其對軟骨下骨成骨細胞凋亡及Fas、FasL 表達的影響，進一步明確其治療KOA的部分作用機制。本研究通過寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學科研倫理審查委員會批準(批準號2018064)。

1 材料與方法

1.1 試劑

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(貨號YT137)，北京百奧萊博科技有限公司；Fas抗體(貨號abs135556，稀釋比1∶200)、FasL抗體(貨號abs130094，稀釋比1∶200)，愛必信(上海)生物科技有限公司；二抗山羊抗兔(貨號ab140509)，美國Abcam 公司；蘇木素與伊紅染色液(貨號PH0516)，福州飛凈生物科技有限公司。

1.2 儀器

內(nèi)熱針(貨號RS15 A，直徑0.5 mm，針總長100 mm，針體長65 mm，針柄長35 mm，針柄直徑2.2 mm)、內(nèi)熱針治療儀(KF型40路內(nèi)熱針治療儀)，中國濟寧佳科醫(yī)療科技有限公司；RM2235型石蠟切片機，Leica公司；BX51型顯微鏡，Olympus公司。

2 方法

2.1 動物與分組

30只6月齡清潔級健康新西蘭大白兔，雌雄各半，體質(zhì)量(2.5±0.2)kg，由西安交大動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)合格證號SCXK(寧)2018-0017。大白兔飼養(yǎng)于西安交大動物中心，單籠飼養(yǎng)，12 h晝夜交替，實驗室維持一定的溫度(22±2)℃和濕度(50%±15%)，動物自由攝食與飲水，所有動物適應性喂養(yǎng)7 d。采用隨機數(shù)字表法將30只新西蘭兔分為空白組10只，造模組20只。采用Hulth法制備兔KOA模型，造模成功后再隨機分為模型組治療組各10只。

2.2 造模方法

采用改良Hulth造模方法[14]，實驗兔適應性喂養(yǎng)7d后開始造模。手術(shù)經(jīng)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶(1 mL/kg)進行麻醉，麻醉后將實驗兔固定于手術(shù)臺上，對左后肢膝關(guān)節(jié)局部剃毛、備皮、鋪巾和消毒。取左膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)進行長約3 cm的縱切口，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶暴露關(guān)節(jié)腔，然后切除內(nèi)側(cè)半月板并切斷前交叉韌帶。止血后沖洗關(guān)節(jié)腔，抽屜實驗檢查陽性后清創(chuàng)縫合敷貼包扎。上述步驟嚴格按無菌操作程序進行，連續(xù)7d對實驗兔進行局部注射青霉素鈉20萬 U/只以避免術(shù)后感染及炎癥反應，術(shù)后傷肢不固定，自主活動，單籠飼養(yǎng)。造模術(shù)后4周可制備兔KOA模型[15]，造模成功后次日進行行為學評價。造模4周后，隨機抽取空白組和造模組各2只實驗兔，麻醉后對實驗兔左膝關(guān)節(jié)行影像學X線檢查。

2.3 干預方法

于造模4周后進行治療干預。將治療組實驗兔固定于兔臺上，在兔左膝關(guān)節(jié)周圍進行內(nèi)熱針布點：選髕上正中點與肢體縱軸的垂直線兩側(cè)各定位 1點，共計2點；髕下正中定1點，內(nèi)外膝眼各1點，共計5點。進針后針尖抵觸骨膜后停止進針，針體連接內(nèi)熱針治療儀后設定溫度為 42 ℃，治療時間為20 min，每周1次，共治療4次。其他2組實驗兔僅兔臺固定相同時間不采取任何干預。

2.4 行為學評價

于干預前和末次內(nèi)熱針干預后次日根據(jù)改良Lequesne MG量表進行各組實驗兔行為學評價，包括局部疼痛度(0～3 分)、步態(tài)(0～3 分)、關(guān)節(jié)腫脹程度(0～2 分)、關(guān)節(jié)活動范圍(0～3 分)4個方面，分數(shù)越高提示病變越嚴重。①疼痛程度(局部疼痛刺激反應：用手指擠壓膝關(guān)節(jié)，按刺激反應程度不同分為4個等級)：無異常疼痛反應記0分；患肢出現(xiàn)收縮記1分；患肢收縮、痙攣伴輕度全身反應記2分；患肢劇烈收縮痙攣、全身顫抖、亂竄、掙扎記3分；②步態(tài)改變(按照患肢行走、奔跑時的步態(tài)分為4個等級)：正常行走記0分；患肢奔跑時輕度跛行、踏地有力記1分；患肢參與行走但跛行明顯記2分；患肢不能參與行走、不能觸地、蹬地記3分；③關(guān)節(jié)活動范圍(按照患肢膝關(guān)節(jié)活動范圍角度分為4個等級，其中以伸直位為 0°)：0分為≥90°；1 分為≥45°且<90°；2分為≥15° 且<45°；3分為≤15°；④關(guān)節(jié)腫脹程度(按照關(guān)節(jié)的腫脹程度分為3個等級)：無腫脹記0分；輕度腫脹、骨性標記線變淺記1分；重度腫脹、骨性標記線消失記2分。

2.5 軟骨下骨取材

行為學評價后，3組實驗兔均采用空氣栓塞法處死，每組各取材10只。將處死的實驗兔固定于兔臺上，伸直實驗兔左后肢，用手術(shù)刀暴露膝關(guān)節(jié)腔，咬骨鉗截取脛骨干骺端完整地剔除周圍軟組織，精確分離關(guān)節(jié)軟骨下骨。得到的軟骨下骨組織分為2份，一份置于40 g/L 多聚甲醛液固定 2 d，10%EDTA 脫鈣液 2 周，常規(guī)脫水石蠟包埋、切片，制備石蠟切片，用于HE染色、TUNEL染色法檢測；另一份置于凍存管內(nèi)，放入-80 ℃冰箱保存，供蛋白免疫印跡法和實時熒光定量PCR檢測使用。

2.6 HE染色

觀察各組實驗兔左膝關(guān)節(jié)軟骨下骨組織的病理學改變。取石蠟包埋塊4 μm切片，脫蠟后常規(guī)HE染色，光鏡下觀察軟骨下骨組織病理學改變。

2.7 TUNEL法檢查成骨細胞凋亡情況

取石蠟包埋塊，蠟塊切成4 μm的切片，常規(guī)脫蠟后行TUNEL染色、封片，光學顯微鏡下觀察軟骨下骨的病理改變。TUNEL 染色陽性標記為核染色為黃或棕黃色，并計算細胞凋亡率。

2.8 蛋白免疫印跡法檢測軟骨下骨組織中Fas、FasL蛋白表達

取-80 ℃冰箱保存的軟骨下骨組織約50 mg，液氮下研磨至粉末狀，用PBS洗滌1次后加入裂解液，提取軟骨下骨總蛋白測量其濃度，制備分離膠和濃縮膠，上樣并經(jīng)過SDS-Page凝膠電泳、剝膠、轉(zhuǎn)膜，分別加入Fas、FasL一抗，4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h，然后ECL 顯影、定影、洗片、凝膠、成像。采用Image-Pro Plus軟件分析，參照以GAPDH為內(nèi)參蛋白，以目標蛋白與內(nèi)參的灰度值比值作為目標蛋白的相對表達量。

2.9 實時熒光定量PCR檢測軟骨下骨組織中Fas、FasL的mRNA表達

取-80 ℃冰箱保存的軟骨下骨組織約50 mg，液氮下研磨至粉末狀，細胞裂解法提取軟骨下骨總RNA，并用核酸蛋白檢測儀檢測每個樣本濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配成逆轉(zhuǎn)錄體系，得到cDNA待用，以其為模板進行RT-PCR擴增。引物序列如下：Fas：F 5′-CCTGTATTGCTGGCTCACTG-3′，R 5′-GTG TACTCCTCCCCTTCCTG-3′; FasL：F 5′-TGGCTCA CTGTCCACAAGTA-3′，R 5′-TGTCTGTGTACTCCT CCCCT-3′; GAPDH：F 5′-CACTTGAAGGGTGGAGC CAAA-3′，R 5′-GCATTGCTGACAATCTTGAGTGA-3′。反應條件：95 ℃預變性30 s 循環(huán)1次；95 ℃ 5s，62 ℃ 30 s 循環(huán)40次；95 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s 循環(huán)1次。每個樣本設3個復孔，根據(jù)各組Ct值計算2-△△Ct值。

2.10 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 KOA實驗兔模型的建立

圖1示，KOA實驗兔模型建立結(jié)束后，分別對空白組及模型組2只實驗兔進行影像學X線檢查。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組實驗兔左膝關(guān)節(jié)間隙變窄，有骨贅形成，表明造模成功。

圖1 造模后空白組與造模組實驗兔左膝關(guān)節(jié)影像學X線結(jié)果比較

3.2 各組實驗兔行為學 Lequesne MG 評分比較

表1示，干預前與空白組比較，模型組、治療組實驗兔Lequesne MG 評分均升高(P<0.05)，提示造模成功。干預后與模型組比較，治療組實驗兔Lequesne MG 評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組實驗兔干預前后 Lequesne MG 量表評分結(jié)果比較(分，

3.3 各組實驗兔軟骨下骨組織形態(tài)學結(jié)果比較

圖2示，HE染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組實驗兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨存在骨小梁變細、斷裂、連續(xù)性中斷、排列疏松、間隙變大等改變；干預后與模型組比較，治療組實驗兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨可見骨小梁增粗增多，排列密集，間隙變窄。

圖2 各組實驗兔HE染色(放大倍數(shù)×200)檢查軟骨下骨組織形態(tài)學變化

3.4 TUNEL染色觀察各組實驗兔軟骨下骨組織中成骨細胞凋亡水平比較

圖3示，通過TUNEL染色分析軟骨下骨中成骨細胞凋亡，與空白組比較，模型組成骨細胞凋亡陽性表達明顯增加，且凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。經(jīng)內(nèi)熱針干預后，成骨細胞凋亡陽性表達明顯減少且凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

注：與空白組比較：***P < 0.001；與模型組比較：###P < 0.001；紅色△→成骨細胞凋亡的陽性表達

3.5 各組實驗兔軟骨下骨組織中Fas、FasL mRNA及蛋白表達的比較

圖4示，與空白組比較，模型組軟骨下骨組織中Fas、FasL蛋白及mRNA表達水平顯著升高(P<0.001)；干預后與模型組比較，治療組軟骨下骨組織中Fas、FasL的蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，治療組軟骨下骨組織中Fas、FasL的mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。

注：與空白組比較：***P<0.001；與模型組比較： #P<0.05，###P<0.001

4 討論

KOA是一種常見于中老年人群的以膝關(guān)節(jié)軟骨退變、骨贅增生、軟骨下骨改變和滑膜炎為特征的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病[16]，主要表現(xiàn)為進行性膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬及功能障礙等，給患者和家庭社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔[17]。因此，尋求有效防治KOA的方法不僅可以提高患者的生活質(zhì)量，還可以降低KOA晚期膝關(guān)節(jié)置換率，減輕疾病給患者帶來的痛苦及社會經(jīng)濟負擔。

KOA屬于中醫(yī)學痹病范疇，本病的病因病機的論述可追溯到《黃帝內(nèi)經(jīng)》。《素問·痹論篇》記載：“風寒濕三氣雜至，合而為痹”，指出其基本病機為肝腎不足，風寒濕邪侵襲，導致關(guān)節(jié)運動障礙，造成局部疼痛[10]。因此對于 KOA 的治療應以補肝益腎、祛風寒濕、溫經(jīng)通絡為主[18]。而中醫(yī)學認為內(nèi)熱針療法可溫經(jīng)散寒、活血通絡、緩解局部腫脹、松解黏連組織，加強針刺的作用[19]。內(nèi)熱針療法作為一種新的以軟組織外科學無菌性炎癥致痛學說為理論依據(jù)的非藥物療法[20]，在治療KOA的臨床研究中表明，可有效改善患者臨床癥狀，減輕膝關(guān)節(jié)疼痛效果[21，22]。

研究表明，軟骨下骨的骨重塑異常被認為是KOA的發(fā)病機制和病理過程的重要因素[23]。在KOA的發(fā)展過程中，軟骨下骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)間隙變窄等形態(tài)學改變最終導致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[24]。X線檢查是診斷KOA最重要的方法之一[25]，因此，在本實驗中我們進行影像學X線檢查，以鑒定采用Hulth法制備的KOA模型。X線檢查結(jié)果顯示，與空白組比較，造模組實驗兔左膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙變窄并有骨贅形成，表明成功制備了兔KOA模型。本實驗采用手術(shù)誘導中Hulth法成功制備兔KOA模型，在其病理進展初期即出現(xiàn)軟骨下骨改變，即HE染色結(jié)果表明，模型組實驗兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨存在骨小梁變細、斷裂、連續(xù)性中斷、排列疏松、間隙變大等改變，經(jīng)內(nèi)熱針干預后可明顯改善上述病理變化。上述結(jié)果與YANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)誘導法制備的KOA模型軟骨損傷繼發(fā)于軟骨下骨改變的結(jié)果相一致。

正常軟骨下骨的骨重塑通過成骨細胞的成骨活性和破骨細胞降解活性維持一個動態(tài)平衡[27]。在KOA的病程發(fā)展過程中，動態(tài)平衡破壞，成骨細胞代謝活動改變，軟骨下骨出現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的改變，導致軟骨下骨的骨重塑失衡，破壞骨穩(wěn)態(tài)[28]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨成骨細胞凋亡加速，骨形成下降，導致骨量減少，骨重塑異常[29]。在本研究采用TUNEL染色檢測軟骨下骨成骨細胞凋亡情況，結(jié)果顯示內(nèi)熱針能顯著降低KOA模型兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨下骨中成骨細胞數(shù)量及凋亡指數(shù)，提示內(nèi)熱針干預抑制KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨下骨成骨細胞的凋亡，修復和減輕膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的損傷。

而有研究表明，F(xiàn)as、FasL能夠調(diào)控軟骨下骨成骨細胞的凋亡[9]。Fas是位于細胞膜上的一個受體，屬Ⅰ型膜蛋白及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族成員；FasL是Ⅱ型膜蛋白，胞外區(qū)與腫瘤壞死因子家族高度同源。FasL是Fas的配體，通過與Fas結(jié)合激活凋亡信號，使其由細胞表面?zhèn)鲗е良毎麅?nèi)，促進一系列酶介導的級聯(lián)反應，并最終誘導細胞凋亡[10]。武中慶等[30]探究右歸飲對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡機制研究發(fā)現(xiàn)，中藥右歸飲能通過下調(diào)Fas、FasL蛋白表達顯著抑制KOA模型中軟骨細胞的過度凋亡，控制KOA的進一步發(fā)展。所以，此次實驗在上述研究基礎(chǔ)上，進一步探討內(nèi)熱針對KOA模型中軟骨下骨成骨細胞凋亡的可能機制。而本研究同樣證明，內(nèi)熱針治療兔KOA模型能通過下調(diào)Fas、FasL的表達，緩解KOA中軟骨下骨成骨細胞的凋亡，達到緩解膝關(guān)節(jié)軟骨下骨組織損傷的目的。

綜上所述，內(nèi)熱針療法能顯著改善 KOA 實驗兔的組織病理學變化，抑制 KOA中軟骨下骨成骨細胞的凋亡，其作用途徑可能與下調(diào)Fas和FasL的表達密切相關(guān)，其對KOA實驗兔的損傷修復具有積極作用。但是KOA的發(fā)生發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果，內(nèi)熱針療法是否能通過其他途徑抑制軟骨下骨成骨細胞的凋亡或促進軟骨下骨的修復，有待進一步的研究與驗證。