趙莎彤，肖小娟，魏 星，張?zhí)烊A，黎曉宇，彭 艷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208)

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis，DGP)是糖尿病的一種慢性胃腸道并發(fā)癥，以胃動(dòng)力障礙、胃電節(jié)律紊亂、排除機(jī)械性梗阻為特征，臨床表現(xiàn)常伴有餐前過早飽腹感，餐后腹脹滿、腹痛、厭食、惡心及食欲減退[1]，因其反復(fù)導(dǎo)致血糖控制不佳，誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)增加并產(chǎn)生抑郁心理，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，降低患者的生活質(zhì)量[2]。目前DGP的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但眾多研究表明，主要與胃腸平滑肌纖維化、自主神經(jīng)病變、胃腸交感及副交感神經(jīng)損傷、高血糖因素、胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal，ICC)病變[3]等因素密切相關(guān)。從細(xì)胞分子水平分析，ICC結(jié)構(gòu)、功能的異常及數(shù)量的改變，可能是DGP發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)[4]。近年來研究[5]及本課題組前期研究表明，DGP發(fā)病過程中ICC可能存在異常的細(xì)胞自噬與凋亡，且兩者在機(jī)體不同生理病理狀態(tài)下具有拮抗或協(xié)同作用[5-8]。電針改善DGP大鼠胃運(yùn)動(dòng)的過程中，細(xì)胞自噬與凋亡發(fā)生了何種變化，是否與電針的調(diào)控機(jī)制有關(guān)？這一問題尚不明確?；谇捌谘芯炕A(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)建立DGP模型大鼠，通過檢測自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、家蠶隔離體蛋白1(sequestosome-1，p62)及胃竇ICC凋亡率，結(jié)合血糖、胃排空率，初步探討電針改善DGP胃動(dòng)力與自噬、凋亡之間的關(guān)系，為臨床針灸治療DGP提供理論依據(jù)。本研究通過湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(批號(hào)IACUC-SJA18081)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠雌雄各半共64只，體質(zhì)量(200～250)g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)部SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)，室溫(20～26 ℃)，相對(duì)濕度40 %～70 %，晝夜循環(huán)，保持12 h光照，自由飲食飲水。

1.2 分組與模型制備

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，從64只大鼠中隨機(jī)抽取13只設(shè)為對(duì)照組，其余51只腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)配合高脂高糖飼料不規(guī)則喂養(yǎng)8周制備DGP模型[9]。期間造模大鼠死亡2只，8周后在造模組和對(duì)照組大鼠中各隨機(jī)抽取3只進(jìn)行胃排空率測定，并驗(yàn)證DGP模型是否成功，造模成功率64.7 %。將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組、胃復(fù)安組每組各10只。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[10]。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)(批號(hào)S0130-1 g)，美國Sigma公司；胃復(fù)安(國藥準(zhǔn)字H41021141)，開封制藥有限公司；水合氯醛(批號(hào)20151217)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LC3、P62、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(貨號(hào)分別為GB11124、GB11531、GB12001，Servicebio)；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量檢測試劑盒、ECL、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、脫脂奶粉(貨號(hào)分別為G2002、G2007、G2026、G2014、G2003、G5002，Servicebio)；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號(hào)AC12L033)，李記生物。

血糖儀及血糖試紙(型號(hào)安穩(wěn)+，三諾)；尿糖試紙(型號(hào)YY/T0478)，高爾寶生物技術(shù)有限公司；電針儀及針灸針(型號(hào)分別為SDZ-Ⅱ型、0.3 mm×13 mm，華佗牌)；紫外分光光度計(jì)(型號(hào)UV1800)，日本島津公司；熒光倒置顯微鏡(型號(hào)CKX53)，日本Olympus公司；AIRTECH 型無菌操作臺(tái)(型號(hào)HVS-1600-U)，蘇凈安泰公司；酶標(biāo)檢測儀(型號(hào)Rt2100c)，Rayto；冷凍離心機(jī)(型號(hào)neofuge 13R)，heal force；轉(zhuǎn)印電泳儀(型號(hào)DYCZ-40 D)，北京六一公司；脫色搖床及勻漿儀(型號(hào)分別為TSY-B、KZ-Ⅱ，Servicebio)、PVDF膜(型號(hào)IPVH00010)，美國millipore公司; Bio-rad Trans-Blot小型轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)170-4156)，美國BIO-RAD公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)Accuri C6)，BD公司。

1.4 造模方法及評(píng)定

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后禁食12 h，將STZ臨用前用0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5，4°)配成2 %濃度，按55 mg/kg劑量于左下腹快速注射(對(duì)照組單次注射等劑量0.1 mmol/L，pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)。72 h后尾靜脈采血測血糖、尿糖，血糖值≥16.7 mmol/L，尿糖陽性者視為糖尿病大鼠，之后給予高脂高糖飼料(普通飼料、蔗糖、熟豬油、奶粉、雞蛋之比為 58∶20∶15∶5∶2)不規(guī)則喂養(yǎng)(即采用單日上午和雙日下午進(jìn)食法)[11]持續(xù)8周(對(duì)照組則采用普通飼料喂養(yǎng)8周)，期間于每周一下午測定全部大鼠血糖、尿糖值1次。DGP模型成功標(biāo)準(zhǔn)[9]：監(jiān)測大鼠血糖、尿糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖陽性者；觀察大鼠糞便量和性狀、皮毛色澤、精神狀態(tài)、行為活動(dòng)與對(duì)照組有明顯差異者；大鼠胃排空率與對(duì)照組有顯著差異。

1.5 干預(yù)方法

于8周造模結(jié)束后開始電針及藥物治療，將大鼠仰臥位固定于鼠板上，定位后局部剪毛、絡(luò)合碘消毒，采用0.3 mm×13 mm一次性針灸針進(jìn)行針刺，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]，選取“梁門”(ST21)“足三里”(ST36)“三陰交”(SP6)及三穴直下2 mm取一非穴點(diǎn)作為電針連接的附點(diǎn)進(jìn)行電針治療。電針組0.9 %氯化鈉溶液灌胃(1 mL/100 g)，電針 “足三里”“梁門”“三陰交”三穴及三穴附點(diǎn)直刺進(jìn)針，針刺深度約2～4 mm，穴位接負(fù)極，附點(diǎn)接正極，疏密波(疏波20 Hz，密波100 Hz，疏波時(shí)間10 s，密波時(shí)間15 s)，強(qiáng)度2 mA，時(shí)間15 min，每日單側(cè)穴位針刺，次日左右交替取穴。模型組、對(duì)照組0.9 %氯化鈉溶液灌胃(1 mL/100 g)，捆綁對(duì)照15 min。胃復(fù)安組1.7%濃度胃復(fù)安藥液灌胃(1 mL/100 g)，捆綁對(duì)照15 min。治療期間均普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水，每日1次，持續(xù)治療5 d為1個(gè)療程，期間休息2 d共3個(gè)療程。

1.6 指標(biāo)檢測及取材

1.6.1 血糖測定 取大鼠尾靜脈血用血糖儀及血糖試紙測血糖并記錄造模前、造模后及治療后血糖值。

1.6.2 組織取材 于實(shí)驗(yàn)第19天治療結(jié)束后，所有大鼠禁食24 h、禁水2 h，第20天給予50 mg/dL酚紅溶液2 mL灌胃，20 min后給予10 %水合氯醛按3.5 mL/kg劑量腹腔注射麻醉，仰臥位固定于鼠板，大鼠腹部酒精消毒后剖腹，分離干凈胃旁系膜后結(jié)扎賁門、幽門取胃，沿胃大彎剪開后用0.9 %氯化鈉溶液沖洗并收集胃內(nèi)容物，定容20 mL測定胃排空率。迅速剪取胃竇組織置于含有PBS無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，4 ℃條件下迅速送至生物公司提取ICC原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并鑒定[13]。采用Western blot法檢測LC3、P62蛋白表達(dá)，采用流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞凋亡。

1.6.3 胃排空測定 將收集的20 mL胃內(nèi)容物加入0.5 mmol/L NaOH溶液20 mL攪拌均勻，靜置1 h后取5 mL上清液，加0.5 mL 20 %三氯乙酸去蛋白，混勻后3500 r/min離心(離心半徑0.1 m)10 min，取上清液用分光光度計(jì)在560 nm波長處測吸光度(OD)值。另取2 mL酚紅溶液，依次加入蒸餾水18 mL、0.5 mmol/L NaOH溶液20 mL、20 %三氯乙酸4 mL，混勻后測定OD 值為標(biāo)準(zhǔn)酚紅OD值。胃排空率=(1-實(shí)測標(biāo)本OD值/標(biāo)準(zhǔn)酚紅OD值)×100 %。

1.6.4 Western blot法檢測胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞LC3、P62蛋白表達(dá) 培養(yǎng)ICC原代細(xì)胞，用PBS清洗ICC細(xì)胞2次，使用移液器徹底吸干殘留液，將PIPA裂解液與蛋白酶抑制劑混勻并使其充分接觸，用細(xì)胞刮刀把細(xì)胞和試劑刮下，以BCA進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)到PVDF膜上；5%的脫脂牛奶密封1 h，TBST洗膜3次，加入LC3(1∶1000)、p62(1∶500)和β-actin(1∶1000)抗體，并在4 ℃過夜孵育一抗。將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30 min，TBST洗滌后滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，暗室曝光、顯影和定影。將膠片進(jìn)行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6.5 流式細(xì)胞儀檢測胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞凋亡 將ICC原代細(xì)胞接種至6孔板，37 ℃ 5%CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至60 %～70 %時(shí)開始處理，把細(xì)胞培養(yǎng)基吸至15 mL離心管內(nèi)，離心5 min棄上清，收集細(xì)胞PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，先用0.5 mL預(yù)冷的 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞, 依次加入5 μL Annexin V-FITC和Propidium Todide(PI)10 μL混勻, 室溫下避光孵育15 min后，于1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測Cajal間質(zhì)細(xì)胞凋亡。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖值比較

圖1示，造模后與對(duì)照組比較，造模組(模型組、電針組、胃復(fù)安組)血糖值均顯著升高(P<0.01)；除對(duì)照組外，模型組、電針組、胃復(fù)安組造模前后自身比較血糖值均呈明顯升高(P<0.01)。治療后與模型組比較，電針組血糖水平降低(P<0.05)，胃復(fù)安組血糖值有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；電針組、胃復(fù)安組治療前后比較血糖值均顯著下降(P<0.01)；電針組、胃復(fù)安組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：造模前后自身比較：▲▲P< 0.01；治療前后自身比較：△△P< 0.01；與對(duì)照組比較：**P< 0.01；與模型組比較：#P< 0.05

2.2 各組大鼠胃排空率比較

與對(duì)照組比較，模型組胃排空率顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，電針組、胃復(fù)安組胃排空率均顯著上升(P<0.01)；電針組和胃復(fù)安組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(詳見圖2)。

注：與對(duì)照組比較：**P< 0.01；與模型組比較：##P< 0.01

2.3 各組大鼠胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠 LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62相對(duì)表達(dá)量均顯著上升(P<0.01)；與模型組比較，電針組、胃復(fù)安組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及P62相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)。電針組、胃復(fù)安組組間比較LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、P62相對(duì)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(詳見圖3)。

注：與對(duì)照組比較：**P< 0.01；與模型組比較：##P< 0.01；A.為模型組；B.為電針組；C.為胃復(fù)安組；D.為對(duì)照組

2.4 各組大鼠胃竇Cajal間質(zhì)細(xì)胞凋亡率比較

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，電針組和胃復(fù)安組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.01或P<0.05)。與電針組比較，胃復(fù)安組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)(詳見圖4)。

注：與對(duì)照組比較：**P< 0.01；與模型組比較：##P< 0.01，#P< 0.05；與電針組比較：★P< 0.05；A.模型組；B電針組；C.胃復(fù)安組；D對(duì)照組

3 討論

根據(jù)DGP典型臨床表現(xiàn)其屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”兼“痞滿”“腹痛”“嘔吐”等病證范疇[14]。明·孫一奎《赤水玄珠》記載：“一日夜小便二十馀度……味且甜……飲食減半，神色大瘁……不能食者必傳中滿鼓脹”，所言“中滿”與本病密切相關(guān)。其病機(jī)變化復(fù)雜，因消渴病日久氣陰虧虛，或致氣滯、痰濕、食積、瘀血等病理產(chǎn)物阻滯，導(dǎo)致中焦氣機(jī)升降失常，總屬本虛標(biāo)實(shí)之證[15，16]。研究表明，針灸治療胃腸疾病具有良好的雙向調(diào)節(jié)作用，可將趨于亢進(jìn)或減弱的胃腸功能恢復(fù)平衡[17，18]。本實(shí)驗(yàn)選用“足三里”“梁門”“三陰交”穴位旨在健脾和胃，疏肝理氣，是臨床常用調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)的腧穴。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，電針“足三里”等穴位后可有效降低DGP模型大鼠的血糖值，促進(jìn)胃排空，這與我們前期研究結(jié)果一致[19]。胃復(fù)安組治療前后自身比較時(shí)血糖值顯著下降，但與模型組比較血糖雖呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。胃排空率顯著上升，提示胃復(fù)安作為促胃動(dòng)力藥，可阻斷胃腸多巴胺受體，引起食管及近端小腸平滑肌運(yùn)動(dòng)，加速胃腸蠕動(dòng)，促進(jìn)胃排空[20]。糖尿病患者存在胃運(yùn)動(dòng)障礙，多與高血糖或胃排空延遲有關(guān)，兩者可互為因果[21]，推測胃復(fù)安促進(jìn)胃運(yùn)動(dòng)、胃內(nèi)潴留減少使得血糖得到控制[22]。

近年來，ICC損傷被認(rèn)為是DGP發(fā)病的主要因素。ICC主要存在于胃腸道的肌肉層，是自主神經(jīng)系統(tǒng)與平滑肌細(xì)胞之間的雙向通信中介[23]，在胃腸運(yùn)動(dòng)的起搏和調(diào)控中扮演著重要角色。研究顯示，糖尿病患者ICC超微結(jié)構(gòu)損傷、數(shù)量減少，是導(dǎo)致DGP胃腸功能下降的罪魁禍?zhǔn)譡24，25]。上調(diào)ICC的數(shù)量[26]和改善受損的超微結(jié)構(gòu)[27]，可能是針灸治療DGP改善胃腸動(dòng)力的關(guān)鍵機(jī)制之一。自噬是細(xì)胞通過溶酶體對(duì)受損細(xì)胞器進(jìn)行自我消化的過程，生理狀態(tài)下細(xì)胞處于低自噬水平，當(dāng)缺氧、營養(yǎng)不良或應(yīng)激狀態(tài)時(shí)則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬進(jìn)行自我更新為機(jī)體提供營養(yǎng)，倘若自噬行為發(fā)生異常，則會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡或自噬性死亡[28]。LC3是自噬體形成的標(biāo)志蛋白，自噬啟動(dòng)時(shí)定位于胞漿的LC3-I與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體內(nèi)外膜上，在晚期自噬小體、溶酶體融合之前，從自噬體膜去除[29]，因此檢測LC3-Ⅱ/I的比值可反映自噬啟動(dòng)水平，兩者比值增加說明自噬體被誘導(dǎo)，但當(dāng)自噬體與溶酶體發(fā)生融合障礙時(shí)，亦可出現(xiàn)LC3-Ⅱ/I比值增加[30]，因此尚需結(jié)合其他自噬因子綜合分析。目前認(rèn)為P62是一種選擇性自噬效應(yīng)器，在溶酶體中被降解[31]，其含量與自噬水平呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)后期自噬小體與溶酶體融合發(fā)生障礙時(shí)，LC3Ⅱ升高，同時(shí)P62也因在溶酶體中無法降解同時(shí)升高[32]。本研究結(jié)果顯示，模型組LC3-Ⅱ/I比值與P62蛋白表達(dá)較對(duì)照組均明顯升高，提示自噬流受到抑制，經(jīng)電針處理后，LC3-Ⅱ/I比值與P62蛋白表達(dá)均明顯下降，說明電針“足三里”等穴位可有效改善自噬小體與溶酶體融合障礙，促進(jìn)自噬通量。

研究證實(shí)，P62表達(dá)增加可能表明其自噬降解不足，同時(shí)也導(dǎo)致對(duì)凋亡的抵抗[31]。細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)式程序性細(xì)胞死亡，凋亡與自噬之間可能存在某種相互作用的關(guān)系。賈亞萌[33]發(fā)現(xiàn)，巴西蘇木素能抑制舌癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，同時(shí)調(diào)控AMP激活蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(amp-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin，AMPK/mTOR)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，提示誘導(dǎo)細(xì)胞自噬使細(xì)胞進(jìn)行代謝，同時(shí)導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖，兩者具有協(xié)同作用。王卓怡[34]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可能通過促進(jìn)細(xì)胞自噬而減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷，提示自噬拮抗凋亡。宋峰[35]表示白介素-1β可誘導(dǎo)大鼠INS-1胰島β細(xì)胞自噬，促進(jìn)INS-1胰島β細(xì)胞凋亡，證明誘導(dǎo)自噬可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，自噬與凋亡可能具有如下3種關(guān)系[8]：一是自噬與凋亡呈協(xié)同作用，兩者均在對(duì)方不足時(shí)補(bǔ)足缺陷共同促進(jìn)細(xì)胞死亡；二是自噬抗凋亡，自噬能調(diào)節(jié)凋亡蛋白而使正常細(xì)胞存活；自噬促凋亡，自噬能調(diào)節(jié)正常細(xì)胞使有害細(xì)胞發(fā)生凋亡。前期研究已經(jīng)證明，糖尿病胃動(dòng)力障礙大鼠模型ICC數(shù)量減少并呈凋亡改變[6,36]，在其他病變模型中電針治療可促進(jìn)細(xì)胞自噬[37]，亦可抑制細(xì)胞自噬[38]，同時(shí)抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡改變[39]，提示電針具有良性的雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)，可適度調(diào)整異常的自噬行為并相應(yīng)改變凋亡狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，模型組凋亡率顯著升高，電針和胃復(fù)安分別處理后凋亡率均明顯下降，而電針組凋亡率下降更為顯著。結(jié)合LC3、P62結(jié)果提示，電針和胃復(fù)安均可有效改善自噬通量，同時(shí)降低ICC細(xì)胞凋亡，但電針效果優(yōu)于胃復(fù)安。從整體觀察，凋亡趨勢與自噬趨勢相反，提示電針可能通過調(diào)節(jié)ICC自噬抑制ICC凋亡，推測在本研究中自噬與凋亡屬于上述第2種關(guān)系。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)DGP的發(fā)生與胃竇ICC自噬抑制、ICC凋亡率升高有關(guān)，其自噬小體與溶酶體融合障礙是其主要的病理基礎(chǔ)，電針處理能使DGP模型大鼠胃竇ICC凋亡率下降，促進(jìn)胃竇ICC自噬，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)自噬蛋白LC3、P62的表達(dá)及細(xì)胞凋亡有關(guān)。然而這一過程涉及到的機(jī)制十分復(fù)雜，電針是通過何種途徑調(diào)控自噬與凋亡，保護(hù)胃竇ICC，改善胃動(dòng)力，尚有待后續(xù)進(jìn)一步研究。