陳凌，茅松，朱若塵，徐敏，吳良霞，石文靜

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院兒科，上海 200233

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是常見的慢性氣道炎癥性疾病，近年發(fā)病率逐年升高，現已成為全球性公共健康問題。據統(tǒng)計，目前全球已有超過3 億哮喘患者，其中兒童發(fā)病率呈快速增長趨勢［1-2］。糖皮質激素是哮喘治療一線用藥，可有效緩解哮喘患者的臨床癥狀，但仍有部分患者對激素治療不敏感，病情未得到良好控制［3］。對哮喘發(fā)病機制的深入研究發(fā)現，激素不敏感及重癥哮喘患者的氣道炎癥多以中性粒細胞浸潤為主，這類患者的外周血、痰液及肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的中性粒細胞數量、Th17 細胞數量及IL-17A、IL-17F 等炎癥因子的表達水平均明顯升高，且與疾病嚴重程度密切相關［4-5］。

Th17 細胞主要分泌IL-17A、IL-17F 等細胞因子，其分化過程受多種因素調［6］。T 淋巴細胞分化初期，在轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）和IL-6 的共同作用下，通過磷酸化STAT-3 途徑，誘導轉錄因子維A 酸相關孤兒受體（retinoid-related orphan receptor-gamma-t，RORγt）表達，從而促進Th0細胞向Th17 細胞分化［7］。近年研究發(fā)現，含熱蛋白結構域3 的富含亮氨酸重復序列的核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-binding oligomerization domainleucine-rich repeats containing pyrin domain 3，NLRP3）信號通路及下游因子IL-1β 也參與Th17 細胞的調控［8-9］。Th17 細胞分泌的主要細胞因子IL-17A 通過作用靶細胞分泌IL-6、粒細胞-巨細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF）、TNF-α 等炎癥因子，募集及活化中性粒細胞，參與氣道炎癥反應［10-11］。另有報道指出，NLRP3 炎癥小體及下游因子IL-1β、IL-18 在哮喘肺組織高表達［12］，可見NLRP3 ／ IL-1β ／ IL-17A 信號通路在哮喘氣道炎癥形成過程中可能發(fā)揮十分重要的作用。因此推測，抑制NLRP3 的活化可能減輕中性粒細胞性哮喘氣道炎癥反應及氣道損傷。

NLRP3 蛋白是NOD 樣受體（NOD-like receptor，NLR）家族中最重要成員之一，其與凋亡相關點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1的前體（procysteinyl aspartate specific proteinase 1，procaspase-1）組成大分子炎癥小體，其具有廣泛的免疫調節(jié)和抗微生物作用，與自身免疫性疾病和感染性疾的發(fā)生病密切相關［13-14］。MCC950 為新發(fā)現的NLRP3抑制劑，可特異性抑制NLRP3 炎癥小體的活化，從而發(fā)揮抗炎作用。本研究通過建立中性粒細胞性哮喘動物模型，觀察MCC950 在動物體內對中性粒細胞性哮喘的作用，并探討相關機制，以期為此類哮喘的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、完全弗氏佐劑（complete Freund adjuvant，CFA）及MCC950均購自美國Sigma 公司；RNAlater 及PowerUpTMSYBRTMGreen 預混液均購自美國Thermo Fisher 公司；小鼠IL-18 ELISA 試劑盒購自中國MultiSciences 公司；IL-17A 及IL-1β ELISA 試劑盒購自美國eBioscience 公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）測試盒（比色法）購自南京建成生物工程研究所；PrimeScriptTMⅣ1st strand cDNA Synthesis Mix 及TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 均購自日本TaKaRa 公司。

1.2實驗動物 SPF 級BALB ／ c 小鼠，雌性，6 ～8周齡，體重16 ～18 g，購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部，動物許可證號為：SCXK（滬）2018-0006。小鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院動物實驗中心屏障系統(tǒng)內。本實驗對小鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照上海市第六人民醫(yī)院動物倫理相關規(guī)定進行（文件號為：2020-0074）。

1.3動物分組及給藥 將小鼠隨機分為PBS 對照組、中性粒細胞性哮喘組（NA 組）、干預組（MCC950 組），每組6 只。NA 組小鼠于第0 天經皮下注射20 μg OVA、75 μL CFA、25 μL PBS 的混合液，第21 及22 天均以1% OVA 的混懸液霧化吸入激發(fā)10 min［15］；MCC950 組小鼠處理同NA 組，于霧化吸入前連續(xù)3 d經腹腔注射MCC950，50 μg ／ g 體重；PBS 對照組小鼠于相同時間點給予相同劑量PBS 經皮下／ 腹腔注射或霧化吸入。

1.4小鼠氣道高反應性檢測 末次霧化結束后，小鼠清醒狀態(tài)下，采用有創(chuàng)肺功能儀檢測小鼠自主呼吸，依次用3.125、6.25、12.5、25、50 mg／mL 濃度的醋甲膽堿霧化3 min，間隔2 min，連續(xù)監(jiān)測并記錄5 min。采用生物記錄儀測定小鼠氣道氣流和壓力變化，計算小鼠肺通氣阻力值。

1.5MCC950 對小鼠BALF 中炎性細胞總數及細胞分類計數影響的檢測 末次霧化24 h 后，用3%戊巴比妥過量麻醉，經氣管插管行肺泡灌洗，400 μL 生理鹽水灌洗全肺，重復3 次，回收BALF 約1.0 mL，4 000 ×g離心10 min，取上清，-80 ℃凍存；用0.9%氯化鈉溶液將細胞沉淀重懸，用血球計數板計數，計算每毫升BALF 細胞總數，并涂片，Wright-Giemsa 染色，進行細胞分類計數。

1.6MCC950 對小鼠BALF 中IL-17A、IL-18 及IL-1β表達水平影響的檢測 采用相應ELISA 試劑盒檢測BALF 中IL-17A、IL-18 及IL-1β 的表達水平。

1.7MCC950 對各組小鼠BALF 中MPO 活力影響的測定 采用MPO 測試盒（比色法）檢測各組小鼠BALF 中MPO 活力。

1.8MCC950 對小鼠肺組織NLRP3、caspase-1、IL-1β及RORγt基因mRNA 相對表達量影響的檢測 按1.5 項處理小鼠，取左肺組織，置RNAlater 中，于-80 ℃凍存。根據GenBank 中登錄的小鼠NLRP3、caspase-1、IL-1β、RORγt及GAPDH基因序列，應用Oligo 7.0 軟件設計引物，引物序列見表1，由上海鉑尚生物技術有限公司合成。用RNA 提取試劑盒提取各組小鼠肺組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，以其為模板進行PCR 擴增。PCR 反應條件為：95 ℃2 min；95 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃60 s，共40 個循環(huán)。2-△△CT法計算mRNA 相對表達量。

1.9各組小鼠肺組織的病理分析 取1.8 項中各組小鼠的右肺組織，用4%多聚甲醛固定48 h，HE 染色，觀察氣道炎癥細胞浸潤情況。氣道炎癥評分為0 ～4 分：0 分表示支氣管周圍無炎癥細胞浸潤；1 分表示偶有袖套樣炎癥細胞浸潤；2 分表示大部分的細支氣管周圍可見炎癥細胞浸潤，且為單層細胞包繞；3 分表示大部分細支氣管周圍可見炎癥細胞浸潤，且為2 ～4 層細胞包繞；4 分表示細支氣管周圍浸潤炎癥細胞層數超過4 層。每只動物觀察3 張切片，每張切片隨機選擇5 個視野，取均數作為該動物的代表值，氣道空腔和切片空白處面積不計算在內［16］。

1.10統(tǒng)計學分析 應用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，試驗結果均以均值±標準差（x±s）表示，多組間比較采用ANOVA分析，組間多重比采用Bonferroni檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1小鼠氣道的高反應性 與PBS 對照組比較，在低濃度醋甲膽堿溶液（3.125 mg ／ mL）激發(fā)下，NA組小鼠肺通氣阻力差異無統(tǒng)計學意義（t= 2.453，P＞0.05），高濃度醋甲膽堿溶液（6.25、12.5、25、50 mg ／ mL）激發(fā)下，NA 組小鼠氣道阻力明顯升高（t分別為3.324、5.871、16.910 和11.840，P均＜0.05）。在濃度為12.5、25、50 mg ／ mL 的醋甲膽堿溶液激發(fā)下，與NA 組比較，MCC950 組小鼠氣道阻力明顯降低（t分別為3.289、6.491 和5.402，P均＜0.05）。見圖1。

2.2MCC950 對小鼠BALF 中炎性細胞總數及細胞分類計數的影響 各組小鼠BALF 中炎性細胞總數、中性粒細胞數、巨噬細胞數差異有統(tǒng)計學意義（F分別為174.2、384.3 和262.6，P均＜0.001）。與PBS 對照組比較，NA 組小鼠BALF 中炎性細胞總數、中性粒細胞數、巨噬細胞數、嗜酸性粒細胞數、淋巴細胞數均明顯升高（t分別為18.17、25.40、22.80、14.94和7.62，P均＜0.01）；與NA 組比較，MCC950 組小鼠BALF 中炎性細胞總數、中性粒細胞數、巨噬細胞數及淋巴細胞數明顯降低（t分別為12.79、22.31、13.39和4.28，P均＜0.05），見表2。表明NA 組小鼠氣道炎性細胞浸潤明顯增多，以中性粒細胞為主；MCC950的干預顯著降低了哮喘小鼠BALF 中炎癥細胞的數量。

表2 各組小鼠BALF 中的炎性細胞總數及分類計數（× 103 個／ mL，± s，n = 6）Tab.2 Total and classified inflammatory cell counts in BALF of mice in various groups（× 103 cells ／ mL，± s，n = 6）

表2 各組小鼠BALF 中的炎性細胞總數及分類計數（× 103 個／ mL，± s，n = 6）Tab.2 Total and classified inflammatory cell counts in BALF of mice in various groups（× 103 cells ／ mL，± s，n = 6）

注：與PBS 對照組比較，aa 表示P ＜0.01，aaa 表示P ＜0.001；與NA 組比較，b 表示P ＜0.05，bb 表示P ＜0.01。

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2.3MCC950 對小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A、IL-18表達水平的影響 各組小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A和IL-18 的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F分別為54.63、636.1 和75.44，P均＜0.001），與PBS 對照組比較，NA 組小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A、IL-18 的表達水平均顯著升高（t分別為10.37、35.44 和12.01，P均＜0.001）；與NA 組比較，MCC950 組小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A 及IL-18 表達水平明顯降低（t分別為6.302、21.200 和8.231，P均＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A、IL-18 的表達水平（pg ／ mL，± s，n = 6）Tab.3 Expression levels of IL-1β，IL-17A and IL-18 in BALF of mice in various groups（pg ／ mL，± s，n = 6）

表3 各組小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A、IL-18 的表達水平（pg ／ mL，± s，n = 6）Tab.3 Expression levels of IL-1β，IL-17A and IL-18 in BALF of mice in various groups（pg ／ mL，± s，n = 6）

注：與PBS 對照組比較，aaa 表示P ＜0.001；與NA 組比較，bb 表示P ＜0.01。

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2.4MCC950 對小鼠BALF 中MPO 活力的影響PBS 對照組、NA 組、MCC950 組小鼠BALF 中MPO活力分別為65.94±10.68、215.00±16.46、151.30±11.43。與PBS 對照組比較，NA 組小鼠BALF 中MPO 活力明顯升高（t= 13.92，P＜0.001）；與NA組比較，MCC950 組小鼠BALF 中MPO 活力明顯降低（t= 3.945，P＜0.01）。

2.5MCC950 對小鼠肺組織NLRP3、caspase-1、IL-1β及RORγtmRNA 相對表達量的影響 各組小鼠肺組織NLRP3、IL-1β 及RORγtmRNA 相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（F分別為64.78、51.93 和76.80，P均＜0.001）。與PBS 對照組比較，NA 組小鼠肺組織NLRP3、IL-1β、RORγtmRNA 相對表達量均顯著升高（t分別為10.72、9.780 和12.37，P均＜0.01）；與NA組比較，MCC950 組小鼠肺組織IL-1β、RORγtmRNA相對表達量顯著降低（t分別為7.373 和5.463，P均＜0.01），NLRP3、caspase-1mRNA 的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（t分別為2.047 和1.581，P均＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、RORγt 基因mRNA 的相對表達水平（± s，n = 6）Tab.4 Relative transcription levels of NLRP3，caspase-1，IL-1β and RORγt mRNAs in lung tissues of mice in various groups（± s，n = 6）

表4 各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、RORγt 基因mRNA 的相對表達水平（± s，n = 6）Tab.4 Relative transcription levels of NLRP3，caspase-1，IL-1β and RORγt mRNAs in lung tissues of mice in various groups（± s，n = 6）

注：與PBS 對照組比較，aa 表示P ＜0.01，aaa 表示P ＜0.001；與NA 組比較，bb 表示P ＜0.01。

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2.6各組小鼠肺組織的病理分析 PBS 對照組、NA組、MCC950 組小鼠肺組織炎癥指數分別為0.58 ±0.23、3.56 ± 0.38、2.57 ± 0.33。與PBS 對照組比較，NA 組小鼠支氣管及小血管周圍炎癥細胞浸潤明顯增多，炎癥指數明顯升高（t= 11.43，P＜0.001）；與NA 組比較，MCC950 組小鼠肺組織內炎性細胞滲出明顯減輕，炎癥指數明顯降低（t=3.816，P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織病理切片的鏡下觀察（HE 染色，×400）Fig.2 Microscopy of histopathological sections of lung tissues of mice in varous groups（HE staining，× 400）

3 討 論

哮喘是發(fā)病機制復雜，由多種細胞及細胞組分參與的慢性炎癥性疾病，以氣道炎性細胞浸潤、氣道高反應、黏液分泌增加及氣道重塑為主要病理特征。有研究認為，嗜酸性粒細胞在氣道內聚集和浸潤是哮喘的主要炎癥特征，隨著對哮喘發(fā)病機制的深入研究，發(fā)現約50%成人哮喘和部分兒童哮喘表現為中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等參與的非嗜酸細胞性炎癥，尤其是重癥哮喘及激素抵抗型哮喘患者，多以中性粒細胞氣道浸潤為特征，且氣道阻塞的可逆性較差，氣道重塑也更為顯著［17-18］。臨床研究數據顯示，診斷為重癥哮喘的患者，除臨床表現更為嚴重外，其外周血、痰液及BALF 中Th17 細胞的數量及IL-17A 的表達水平均明顯升高［19-20］。另有研究指出，激素發(fā)揮抗炎作用需與細胞表面的糖皮質激素受體-α（glucocorticoid receptor-α，GR-α）結合；中性粒細胞表面主要表達GR-β，缺乏與激素結合的反應元件，是激素抵抗型哮喘的病理基礎之一，IL-17A 除募集和活化中性粒細胞外，還可促進氣道上皮細胞表達GR-β，同時抑制GR-α 的表達，進而影響激素治療的敏感性［21-22］。因此，IL-17A 在以中性粒細胞氣道炎癥為表現的激素抵抗型哮喘的病理過程中發(fā)揮十分重要的促進作用。本研究采用OVA 聯(lián)合CFA建立哮喘動物模型，結果顯示，模型小鼠氣道反應性明顯增強，氣道炎性滲出顯著增加，BALF 細胞分類以中性粒細胞為主，且MPO 活性顯著增強（P＜0.001），BALF 中IL-17A 表達水平明顯升高（P＜0.001），肺組織中調控Th17 細胞的轉錄因子RORγtmRNA 表達也顯著上調（P＜0.01），該結果與上述研究結論一致，符合中性粒細胞性哮喘氣道炎癥表現。

氣道上皮細胞在哮喘炎癥形成過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，且哮喘疾病嚴重程度與氣道上皮細胞的數量、功能密切相關。近來研究發(fā)現，NLRP3 在氣道上皮細胞中表達，且在上皮細胞介導的炎癥反應中發(fā)揮重要作用［23］。NLRP3 正常情況下處于非活化的抑制狀態(tài)，受到病原微生物或危險信號等的刺激后活化，通過N-末端熱蛋白結構域（pyrin domain，PYD）與ASC 結合，后者募集效應蛋白pro-caspase-1，從而相互作用形成炎癥小體，促進caspase-1 成熟活化，進一步將pro-IL-1β、pro-IL-18 水解活化為成熟的IL-1β、IL-18 而發(fā)揮作用，參與調節(jié)免疫炎癥反應［24-25］。本研究結果顯示，與PBS 對照組比較，NA 組小鼠的BALF中IL-1β、IL-18 的表達均明顯升高（P＜0.001），肺組織中NLRP3、NLRP3、IL-1β、RORγtmRNA 表達顯著上調（P＜0.01）。IL-1 家族是固有免疫和獲得性免疫反應的關鍵因子，IL-1β 作為該家族重要成員，是調節(jié)免疫炎癥反應的重要介質，同時也是NLRP3 炎癥小體下游調控的主要細胞因子，上述結果表明，OVA 誘導的哮喘動物模型中NLRP3 炎癥小體被激活，促進了下游炎癥因子的表達。有研究證實，IL-1β 與IL-6、TGF-β 協(xié)調作用，共同促進了Th17 細胞的分化成熟，Th17 細胞高表達IL-1 受體（IL-1R），而該受體的缺乏可導致IL-17A、IL-17F、IL-22 等炎癥因子的分泌明顯減少，因此，IL-1β 除了參與Th17 細胞的分化成熟過程外，對其分泌功能亦十分重要［26-27］。IL-17A作為Th17 細胞最重要的效應因子，通過誘導氣道上皮細胞、平滑肌細胞分泌GM-CSF、CXC 趨化因子、IL-8 等炎癥介質募集和活化中性粒細胞，促進氣道炎癥形成，同時IL-17A 促進中性粒細胞產生彈性蛋白酶、基質金屬蛋白酶-9 等，并促進表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）的表達及成纖維細胞的增殖和遷移，參與氣道重塑過程［28-31］。由此可見，NLRP3 ／ IL-1β ／ IL-17A 信號通路在中性粒細胞性氣道炎癥形成中發(fā)揮重要促進作用，因此通過阻斷或調控該通路，進而減輕哮喘的氣道炎癥反應及氣道重塑，具有理論可行性。

MCC950 是選擇性NLRP3 拮抗劑，能夠顯著抑制NLRP3 的活化，已應用于多種疾病的研究中［32-33］。本研究結果表明，與NA 組比較，MCC950 組小鼠的氣道高反應性顯著下降（P＜0.01），BALF 中炎性細胞總數、中性粒細胞比例、MPO 活力及IL-1β、IL-18、IL-17A 等炎癥因子的表達均顯著下調（P＜0.01）；HE 染色結果也顯示，小鼠肺組織的支氣管及小血管周圍炎性細胞滲出顯著減少。綜上所述，MCC950 通過抑制NLRP3 的活化，干擾炎癥小體的形成，從而減少下游細胞因子IL-1β、IL-18 的表達，并進一步通過干預Th17 細胞的分化成熟及其分泌功能，減少IL-17A等炎癥因子的表達，抑制氣道內中性粒細胞的募集和活化，有效減輕中性粒細胞性氣道炎癥，從而證實抑制NLRP3 ／ IL-1β ／ IL-17A 信號通路是減輕中性粒細胞性哮喘氣道炎癥反應的有效手段。實時熒光定量PCR 結果顯示，IL-1β、RORγtmRNA 表達被顯著抑制（P＜0.01），NLRP3、caspase-1mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.01），表明MCC950 可能僅調控NLRP3 的活化及影響其與ASC 和pro-caspase-1 的相互作用，并不抑制NLRP3 的表達［34］。NLRP3 炎癥小體在哮喘疾病中的作用機制、抑制NLRP3 對效應細胞表達GR-α ／ β 的影響及Treg 細胞的功能由此受到影響等問題需進一步研究。

綜上所述，本實驗采用OVA 聯(lián)合CFA 成功建立了以氣道中性粒細胞浸潤為特征的哮喘動物模型，初步探討了NLRP3 抑制劑MCC950 在動物體內對NLRP3 ／ IL-1β ／ IL-17A 信號通路的調控作用及相關機制，證實了抑制NLRP3 的活化可有效減輕中性粒細胞性氣道炎癥反應。本實驗為以中性粒細胞氣道浸潤為特征的重癥哮喘及激素抵抗型哮喘的治療提供了實驗依據。