顧建陽，王宇，孫子琪，張雯雯，常軍亮

長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長春 130012

干擾素（interferon，IFN）是宿主天然免疫中的一類多功能細(xì)胞炎癥因子，具有廣譜抗病毒、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化和機(jī)體免疫功能的作用［1-4］。重組人干擾素α2b（recombinant human interferon α2b，rhIFNα2b）在臨床抗病毒治療中療效明顯，對慢性肝炎、帶狀皰疹、病毒性子宮頸糜爛等具有顯著的治療效果［5-7］，也廣泛應(yīng)用于新型冠狀病毒肺炎的治療［8-9］。

長春生物制品研究所有限責(zé)任公司（以下簡稱長春公司）在注射用rhIFNα2b 原液生產(chǎn)基礎(chǔ)上研發(fā)了大規(guī)格卡式瓶液體制劑，與傳統(tǒng)凍干粉針劑型相比，在藥品質(zhì)量和用藥便捷程度上具有明顯優(yōu)勢。對兩種劑型理化穩(wěn)定性、藥效一致性等比對研究中，需要將樣品進(jìn)行前處理，即分離提取rhIFNα2b 蛋白及其相關(guān)物質(zhì)以進(jìn)行蛋白異質(zhì)性、降解產(chǎn)物和生物有效性分析。從成品制劑中分離目的蛋白最有效的方法為親和層析法，其中單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）親和層析的特異性高、載量大、流速快、蛋白活性損傷程度低等特點(diǎn)使其成為優(yōu)選方法。用于偶聯(lián)的McAb 對rhIFNα2b 及其相關(guān)物質(zhì)的吸附特性是樣品前處理中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。本研究篩選制備rhIFNα2b 的McAb，并驗(yàn)證其與rhIFNα2b 及其蛋白聚體的特異性反應(yīng)，再偶聯(lián)至CNBr 預(yù)活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)，評(píng)價(jià)該介質(zhì)的純化效果，以期為rhIFNα2b 劑型質(zhì)量比對樣品前處理提供可靠的純化方法。

1 材料與方法

1.1原液 rhIFNα2b 原液（批號(hào)為：B20190501）由長春公司細(xì)胞因子室提供。

1.2細(xì)胞株 小鼠骨髓瘤NS-1 細(xì)胞由長春公司生物技術(shù)研究室保存。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB ／ c 小鼠，雌性，體重16 ～18 g，由長春公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（吉）-2017-0005。本實(shí)驗(yàn)對小鼠的所有處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照長春公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)章程規(guī)定進(jìn)行。

1.4主要試劑及儀器 RMPI1640 培養(yǎng)基（Cat：05918）購自日本日水制藥公司；胎牛血清（CellMax）購自蘭州民海生物工程有限公司；弗氏佐劑、HAT、HT、PEG4000 及降植烷均購自美國Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型DAB 顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；濃鹽酸、冰醋酸、碳酸氫鈉、氯化鈉及三羥甲基氨基甲烷等化學(xué)試劑（均為分析純）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BXK16 ／ 20 層析柱（Cat：B-1620）、CNBr-activated BestaroseTM4FF（Cat：AA017912）及AT Protein A Diamond（Cat：AA0273）均購自上海博格隆生物技術(shù)有限公司。

1.5rhIFNα2b熱加速樣品的制備及檢測 將rhIFNα2b原液于56 ℃熱加速處理2、4、6、8、24、30 h，取樣，經(jīng)15%非還原型SDS-PAGE 分析。

1.6rhIFNα2bMcAb 雜交瘤細(xì)胞篩選 將rhIFNα2b原液與弗氏完全佐劑等體積充分乳化后，經(jīng)小鼠背部皮下多點(diǎn)免疫，100 μg ／ 只。將rhIFNα2b 原液與弗氏不完全佐劑等體積充分乳化，初次免疫后每間隔10 d 進(jìn)行1 次免疫，免疫劑量及途徑同上，共免疫3 次；融合前3 d，經(jīng)小鼠尾靜脈進(jìn)行加強(qiáng)免疫，200 μg ／ 只。采用常規(guī)PEG4000 化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞融合［10］，間接ELISA 法檢測融合及陽性克隆細(xì)胞孔上清特異性抗體，有限稀釋法對陽性克隆孔雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選。

1.7McAb 的制備及鑒定 采用小鼠體內(nèi)誘生法制備McAb 腹水［11］，腹水經(jīng)飽和硫酸銨（50%和33%）分級(jí)沉淀粗純后，用AT Protein A 親和層析進(jìn)行純化；經(jīng)12%還原型SDS-PAGE 鑒定純化McAb 的純度；Western blot 法鑒定McAb 與rhIFNα2b 及其聚合蛋白的特異性反應(yīng)［12］，rhIFNα2b 及其聚合蛋白上樣量均為15 μg；以篩選的抗rhIFNα2b McAb（1.0 mg／mL）作為一抗，稀釋度為1 ∶1 000；以HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 作為二抗，稀釋度為1 ∶2 000。

1.8McAb親和層析介質(zhì)的制備 將McAb用0.1mol／L Na2CO3+ 0.5 mol ／ L NaCl（pH 8.3）溶液，于2 ～8 ℃平衡16 h，紫外-可見分光光度法測定蛋白濃度。用2 ～8 ℃預(yù)冷的1.0 mmol ／ L HCl 與CNBr-activated BestaroseTM4FF 凝膠按100 ∶1 的體積比混懸，洗滌5 次，靜置沉降，去上清，即為預(yù)活化介質(zhì)。用0.5倍體積1.0 mmol ／ L HCl 分散預(yù)活化介質(zhì)，與預(yù)平衡McAb 等體積混合，于20 ℃，100 r ／ min 振搖偶聯(lián)［6］，每隔1 h 取上清和凝膠樣本，至4 h。紫外-可見分光光度法測定上清McAb 蛋白濃度，12%還原型SDS-PAGE 驗(yàn)證凝膠抗體蛋白偶聯(lián)程度。待上清蛋白濃度不再下降后，于2 ～8 ℃靜置過夜，使其充分偶聯(lián)。

1.9偶聯(lián)介質(zhì)親和效果驗(yàn)證 根據(jù)上清蛋白濃度計(jì)算預(yù)活化凝膠對McAb 的最大偶聯(lián)量；凝膠沉淀用5 倍體積封閉液（0.1 mol ／ L Tris-HCl，pH 8.3）洗滌1 次，再用5 倍體積封閉液于20 ℃，100 r ／ min 振搖封閉5 h；5 倍體積的封閉液和0.2 mol ／ L 醋酸交替清洗偶聯(lián)介質(zhì)5 次，5 min ／ 次；用20 mmol ／ L PBS（pH 7.0）溶液洗滌，2 ～8 ℃保存?zhèn)溆谩cAb偶聯(lián)親和層析介質(zhì)填裝BXK16 ／ 20 層析柱，柱床體積6 mL，以20 mmol ／ L PBS（pH 7.0）+ 0.5%吐溫20 為平衡液，5 mL ／ min 流速淋洗柱床5 個(gè)體積；以0.1 mol ／ L GLY-HCl（pH 3.0）緩沖液為洗脫液，對rhIFNα2b 原液及56 ℃熱加速24 h 樣品進(jìn)行上樣吸附和洗脫，洗脫樣品進(jìn)行15%非還原型SDS-PAGE 和Western blot 檢測（同1.7 項(xiàng)）。

2 結(jié) 果

2.1rhIFNα2b 熱處理樣品的鑒定 rhIFNα2b 原液經(jīng)56 ℃熱加速24 h 后，可產(chǎn)生明顯蛋白聚體，見圖1。

圖1 rhIFNα2b 原液經(jīng)56 ℃熱加速處理樣品的非還原SDS-PAGE 分析Fig.1 Non-reduced SDS-PAGE profile of bulk of rhIFNα2b treated by accelerated heating at 56 ℃

2.2McAb 的篩選及純化產(chǎn)物的鑒定 經(jīng)雜交瘤制備和篩選，確定以4E2 抗體作為偶聯(lián)McAb，其AT Protein A 親和層析純化產(chǎn)物經(jīng)12%還原型SDS-PAGE 分析，可見相對分子質(zhì)量約50 000 和25 000 的目的蛋白條帶，大小與預(yù)期相符，純度> 95%，見圖2；且可與rhIFNα2b 及其蛋白聚體發(fā)生特異性反應(yīng)，見圖3。

圖2 親和層析純化McAb 4E2 的還原型SDS-PAGE 分析Fig.2 Reduced SDS-PAGE profile of McAb 4E2 purified by affinity chromatography

圖3 親和層析純化McAb 4E2 的Western blot 檢測Fig.3 Western blotting of McAb 4E2 purified by affinity chromatography

2.3最適McAb 偶聯(lián)時(shí)間 平衡后McAb 4E2 的濃度為35 mg ／ mL，與CNBr-activated BestaroseTM4FF 偶聯(lián)0、1、2、3、4 h 時(shí)，上清的抗體蛋白濃度分別為16.91、4.14、2.68、2.48、2.51 mg ／ mL。3 h 后抗體蛋白濃度趨于平穩(wěn)，換算預(yù)活化凝膠介質(zhì)抗體蛋白吸附率約為30 mg ／ mL，此時(shí)凝膠介質(zhì)偶聯(lián)抗體蛋白量趨于飽和，見圖4。為使偶聯(lián)更加充分，確定最佳偶聯(lián)時(shí)間為4 h。

圖4 不同偶聯(lián)時(shí)間凝膠樣品的還原型SDS-PAGE 分析Fig.4 Reduced SDS-PAGE profile of McAb coupled to CNBr-activated BestaroseTM 4FF for various hours

2.4偶聯(lián)介質(zhì)親和效果驗(yàn)證 rhIFNα2b 原液及其56 ℃熱加速24 h 樣品的McAb 親和層析柱洗脫產(chǎn)物經(jīng)15%非還原SDS-PAGE 分析，可見rhIFNα2b 單體及蛋白聚體條帶，與洗脫前一致，見圖5；且均可與純化4E2 McAb 發(fā)生特異性結(jié)合，見圖6。表明偶聯(lián)介質(zhì)可有效吸附rhIFNα2b 及其蛋白聚體，且洗脫樣品保持與McAb 結(jié)合活性。

圖5 McAb 親和層析純化樣品的非還原SDS-PAGE 分析Fig.5 Non-reduced SDS-PAGE profile of McAb purified by affinity chromatography

圖6 McAb 親和層析純化樣品的Western blot 檢測Fig.6 Western blotting of McAb purified by affinity chromatography

3 討 論

rhIFN 藥物在長期臨床使用過程中，為病毒感染性疾病的治療和預(yù)防、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用等提供了多種有效干預(yù)手段，臨床療效顯著［13-14］。由于早期蛋白質(zhì)純化技術(shù)的限制，初期上市rhIFN 制品多采用小鼠McAb 親和層析方法進(jìn)行純化，價(jià)格昂貴，但其在特異性、載量、收率方面均具有明顯優(yōu)勢［15-16］。本研究制備的rhIFNα2b McAb 親和層析介質(zhì)在長春公司rhIFNα2b 凍干注射劑與大規(guī)格卡式瓶制劑穩(wěn)定性比對的樣品前處理過程中得到有效應(yīng)用，對制備的rhIFNα2b 進(jìn)行異質(zhì)性蛋白、降解產(chǎn)物、修飾產(chǎn)物和生物有效性差異的檢測能夠較全面真實(shí)地反映劑型中目的蛋白及其相關(guān)物質(zhì)的天然狀態(tài)，也間接表明該親和層析介質(zhì)的良好性能［17］。

偶聯(lián)McAb 的生物特性決定了McAb 親和層析介質(zhì)的性能，其親和力過高，所吸附目的蛋白難以洗脫；若識(shí)別結(jié)合表位過于保守，則難以全面吸附相關(guān)蛋白。本研究結(jié)果表明，篩選的小鼠McAb 4E2 對rhIFNα2b 蛋白及其聚體蛋白具有廣譜結(jié)合性，且用于填裝層析柱后，在純化緩沖體系中能夠確保目的蛋白充分吸附和洗脫，并保持洗脫樣品蛋白譜完整性及與McAb 的結(jié)合活性。CNBr 預(yù)活化的瓊脂糖介質(zhì)可將含伯氨基（-NH2）的多種類型蛋白偶聯(lián)至該介質(zhì)上［18］，而采用含伯氨基的小分子鹽類（Tris）進(jìn)行封閉可降低對目的蛋白的非特異性吸附。本研究對抗體蛋白偶聯(lián)優(yōu)化時(shí)間結(jié)果顯示，偶練3 h 后可達(dá)飽和，4 h 可使封閉更完全，因此確定4 h 為最適偶聯(lián)時(shí)間。

目前，雖然McAb 親和層析法在多種藥物制備工藝中已被替代，但在藥物分析小量樣品處理方面仍具有不可替代的地位。本研究對rhIFNα2b 及其他重組蛋白藥物研究分析提供了參考。