郭鴻儒 宮田嬌 張春楊 孫繼紅 王 茹 楊淑芳

(吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林吉林 132012)

蛹蟲(chóng)草是我國(guó)重要的人工栽培食藥用真菌之一，因其豐富的營(yíng)養(yǎng)藥用價(jià)值而被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織譽(yù)為“21世紀(jì)的健康食品”[1-2]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蛹蟲(chóng)草的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與功效的研究主要聚焦在多糖、蟲(chóng)草素、萜類等方面[3-5]，隨著多層次多樣蛹蟲(chóng)草價(jià)值的探索，食藥用真菌中活性肽的研究備受矚目，對(duì)深度研發(fā)、蛋白質(zhì)資源高效利用具有重要意義[6-7]。研究表明，以蛹蟲(chóng)草納米粉為基質(zhì)，利用地衣芽孢桿菌發(fā)酵制備的蛹蟲(chóng)草肽是一類具有抗氧化、增強(qiáng)免疫功能以及降血糖作用的小分子生物無(wú)活性物質(zhì)，是蛹蟲(chóng)草深加工的產(chǎn)物，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[8-9]。然而，直接口服生物活性肽極易被生物體內(nèi)的酶分解，其生物活性也隨之消失，使其在醫(yī)藥保健和疾病預(yù)防領(lǐng)域受到很大程度的限制，嚴(yán)重阻礙蛹蟲(chóng)草活性肽的市場(chǎng)研發(fā)[10]。針對(duì)以上問(wèn)題，本研究采用高分子包埋技術(shù)制備蛹蟲(chóng)草肽靶向微囊，不僅可使蛹蟲(chóng)草肽進(jìn)入到人體后在一定的時(shí)間內(nèi)釋放，達(dá)到對(duì)活性肽劑量的有效控制，還可實(shí)現(xiàn)藥物的靶向輸送，達(dá)到緩釋/控釋目的。試驗(yàn)選取天然明膠、半合成材料乙基纖維素及高分子聚合材料聚乳酸，通過(guò)篩選不同囊材制備蛹蟲(chóng)草肽微囊及對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，考察微囊制劑的釋放度和降解性，優(yōu)化工藝條件使其成為理想的靶向劑，為蛹蟲(chóng)草的深加工提供必要的理論及實(shí)踐指導(dǎo)，也為蟲(chóng)草肽類制劑通過(guò)口服途徑應(yīng)用于食品、保健養(yǎng)生等領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

蛹蟲(chóng)草：由吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院北冬蟲(chóng)夏草研究中心提供。

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)E-30，沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

聚乳酸(PLA)、聚乙烯醇(PVA)、明膠、司盤80、二氯甲烷(DCM)、乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸提粉。以上試劑均為分析純。

2 方法

2.1 研究方法

2.1.1 納米級(jí)蛹蟲(chóng)草的制備

以蛹蟲(chóng)草子實(shí)體為原料，高能納米沖擊磨為試驗(yàn)設(shè)備，研磨時(shí)間為5 h，粒徑為0.606 μm，由吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院制得納米級(jí)蛹蟲(chóng)草。

2.1.2 地衣芽孢桿菌的活化

菌液由地衣芽孢桿菌(BacilusLicheniformis)和無(wú)菌水組成。已滅菌完成的白金環(huán)蘸取少許配置好的菌液，在固體培養(yǎng)基上以劃線法劃線后密封，置于恒溫培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)溫度至37℃倒扣活化1 d。

2.1.3 蛹蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基的配制

取2.5%納米級(jí)蛹蟲(chóng)草粉末，逐一添加到6個(gè)250 mL三角瓶中，以1%葡萄糖作為碳源和能源，再分別加入100 mL無(wú)菌水和少量滅菌后的攪拌玻璃珠均勻攪拌1 min，高壓滅菌25 min，待冷卻至室溫后，即為制成的蛹蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基。

2.1.4 納米蛹蟲(chóng)草活性肽的制備

挑取3%接種量的菌至三角瓶液體培養(yǎng)基中，均勻攪拌，35 ℃，150 r/min條件下位于搖床中搖3 d，制備蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液。再將發(fā)酵液于3 500 r/min離心10 min，超濾(N2，0.15 pa)，收集5 000 Da下的溶液，真空冷凍干燥，即得納米蛹蟲(chóng)草活性肽，以下簡(jiǎn)稱蛹蟲(chóng)草肽。

2.1.5 蛹蟲(chóng)草肽明膠微囊的制備

取輕質(zhì)液體石蠟15 mL，加入司盤80乳化劑150 μL(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)，即為油相。精準(zhǔn)稱取1 g明膠，加入5 mL蒸餾水，60 ℃水浴加熱，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的明膠溶液，即為水相。油相∶水相的比例為3∶1。水相需在50 ℃水浴加熱攪拌，滴加于油相中，乳化10 min后，改為冰浴。1 h后，滴加0.3 mL甲醛交聯(lián)固化，復(fù)攪拌1 h，轉(zhuǎn)移至小燒杯中4 ℃以下，固化1 d，最后采用適量異丙醇脫水，制得明膠固化球，先用乙醇再用石油醚洗滌兩至三次，1 600 r/min離心3 min，真空冷凍干燥。即為干燥的明膠微囊。

包封率及載藥率的計(jì)算：

取微囊4 mg加到5 mL容量瓶中，蒸餾水定容，在波長(zhǎng)560 nm下，采用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定吸光度并記錄，根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)肽含量。

包封率=(微囊中蟲(chóng)草肽含量/投入肽量)×100%

載藥率=(藥物的質(zhì)量/明膠藥物微囊的質(zhì)量)×100%

2.1.6 蛹蟲(chóng)草肽乙基纖維素微囊的制備

將0.5 g乙基纖維素(壁材)與0.25 g蛹蟲(chóng)草活性肽(芯材)溶于50 mL純水備用，將30 mL無(wú)水乙醇以2 mL/min的速率滴加到備液中，并以150 r/min的速率行攪拌，過(guò)濾懸浮液、25 ℃干燥，制得芯材/壁材分別為1:2的白色粉末狀活性肽微囊。

1)活性肽包封率測(cè)定：將制備得到的微囊懸浮液離心分離后，在286 nm波長(zhǎng)下測(cè)量上清液的吸光度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到上清液中活性肽的含量。

活性肽包封率=1-懸浮液中游離活性肽/活性肽總量

2)載藥率測(cè)定：稱取一定量樣品于干燥的試管中，加入10 mL無(wú)水乙醇，25 ℃下浸提20 min，于286 nm處測(cè)定浸提液中的吸光值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算浸提液中的活性肽含量，即為包裏在微囊中的活性肽，從而計(jì)算出載藥率。

載藥率=微囊中活性肽質(zhì)量/微囊質(zhì)量。

2.1.7 蛹蟲(chóng)草活性肽聚乳酸(PLA)微囊的制備

將活性肽溶液加入一定濃度的PLA二氯甲烷溶液中，冰浴降溫，在超聲波的作用下乳化成白色乳狀液后，立即滴入聚乙二醇外水相溶液中分散，并用磁力攪拌器在25 ℃下攪拌3 h，二氯甲烷完全揮發(fā)后，載藥微囊分散液以5 000 r/min離心10 min，保留上清，沉淀下的微囊以去離子水沖洗3次，最后得到的微囊真空干燥，4 ℃貯藏。

聚乳酸微囊包封率的測(cè)定：

其中，A總為加入的活性肽總量，A游為上清中的活性肽含量。

2.2 檢測(cè)方法

2.2.1 微囊的體外釋藥實(shí)驗(yàn)方法

采取動(dòng)態(tài)膜透析法，將微囊倒入透析袋中，并加入10 mL PBS緩沖溶液，將透析袋系緊后放入盛有190 mL PBS緩沖溶液的燒杯中，25 ℃磁力攪拌。定時(shí)取出1 mL溶液，利用福林酚法測(cè)定多肽含量，并加入1 mL新鮮釋放介質(zhì)。

2.2.2 蛹蟲(chóng)草肽聚乳酸微囊胃內(nèi)微環(huán)境降解過(guò)程體外模擬實(shí)驗(yàn)方法

1)人工胃液配制：取1 mol/L鹽酸16.4 mL，加水約800 mL及胃蛋白酶10 g，攪勻后加水定容至1 000 mL即可。

2)體外模擬實(shí)驗(yàn)：采用動(dòng)態(tài)膜透析法，取0.5 g微囊分別裝于含有上述模擬胃液的透析袋中，磁力攪拌器上低速攪拌，胃液4 h后將微囊取出正置顯微鏡下觀察，腸液24 h后觀察。

2.2.3 蛹蟲(chóng)草肽聚乳酸微囊腸道內(nèi)微環(huán)境降解過(guò)程體外模擬實(shí)驗(yàn)方法

1)人工腸液配制：取磷酸二氫鉀6.8 g加水500 mL。用0.4%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8；另取胰酶10 g加水適量使溶解，將兩液混合后，加水定容至1 000 mL即可。

自1932年但采爾回德國(guó)至蔡元培病逝的8年間，兩人雖未曾再謀面，但一直保持著頻繁的書(shū)信交流，但采爾也成為蔡元培交往時(shí)間最長(zhǎng)、感情最深的一名外國(guó)學(xué)者。

2)采用動(dòng)態(tài)膜透析法，取0.5 g微囊分別裝于含有上述模擬腸液的透析袋中，磁力攪拌器上低速攪拌，在模擬腸液中反應(yīng)24 h將微囊取出正置顯微鏡下觀察。

2.2.4 微囊的外部形態(tài)特征的觀察方法

采用光學(xué)顯微鏡觀察所制微囊懸浮液的整體形狀及微囊的形態(tài)，將所制微囊懸浮液滴1滴到載玻片上，進(jìn)行檢測(cè)；采用Quanta 250型的掃描電鏡觀察微囊的表面形貌； 取少量微囊樣本，加入蒸餾水，超生震蕩使其粒子分散，再取少量樣品溶液置于銅托上，用紅外燈照射干燥，再進(jìn)行樣品檢測(cè)。

2.2.5 紅外光譜測(cè)試方法

在檢測(cè)樣品制備中，首先稱取適量溴化鉀以紅外燈105 ℃干燥3 h，備用。以空氣為參比，用溴化鉀壓片成空白片。取0.3 mg樣品，復(fù)用紅外燈105 ℃干燥3 h，加入溴化鉀100 mg，在研缽中充分研磨，用壓片機(jī)壓制成片狀。掃描范圍在4 000-500 cm-1。

2.2.6 蛹蟲(chóng)草肽微囊穩(wěn)定性試驗(yàn)

1)3種微囊的儲(chǔ)存穩(wěn)定性試驗(yàn)：將各種微囊放置于冷藏條件下(4 ℃)6個(gè)月后，各取100 mg檢測(cè)肽含量減損情況。

2)蛹蟲(chóng)草活性肽微囊在人工胃液中穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取100 mg 3種蛹蟲(chóng)草肽微囊并各自加入10 mL 人工胃液 (按2005年版中國(guó)藥典配制)中，置37 ℃，120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于規(guī)定時(shí)間取出，10 000 ×g 離心，檢測(cè)上清液及微囊中肽含量。同時(shí)以未處理的微囊為對(duì)照并設(shè)置其肽含量為100%。

2.2.7 三種微囊細(xì)胞毒性測(cè)定試驗(yàn)

在96孔板中，每孔接種200 μL細(xì)胞懸液。設(shè)置空白組(無(wú)細(xì)胞)，對(duì)照組(有細(xì)胞)和試驗(yàn)組(有細(xì)胞)，每組設(shè)3～5個(gè)復(fù)孔，在37 ℃的 CO2的培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。次日吸棄培養(yǎng)液，加入200 μL各微囊，相應(yīng)質(zhì)量濃度設(shè)置1 mg·mL-1、2 mg·mL-1、3 mg·mL-1、4 mg·mL-1的無(wú)酚紅DMEM完全培養(yǎng)液。在2 d后取出96孔板，每孔吸剔100 μL培養(yǎng)液，同時(shí)加入10 μL MTT(5mg·mL-1)，37 ℃孵育4 h，吸掉上清，每孔加入100 μL DMSO，震蕩混勻至沉淀完全溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm測(cè)定各孔的吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 乳化交聯(lián)法制備蛹蟲(chóng)草肽明膠載藥微囊

3.1.1 明膠膠囊的形態(tài)觀察及性能測(cè)試

如圖1A所示，在顯微鏡下明膠微囊光鏡檢測(cè)為純白色。從圖1B電鏡檢測(cè)所示微囊表面平滑，微囊中央部位不透光，但黑色囊心物，邊緣處呈半透光。實(shí)驗(yàn)條件下包封率為50.84%，載藥量為23%。

1A 明膠微囊的光鏡檢測(cè) 1B 明膠微囊的掃面電鏡檢測(cè) 1C 明膠微囊紅外光譜檢測(cè)圖1 蛹蟲(chóng)草肽的明膠微囊

3.1.2 明膠微囊的釋藥性能

采用2.2.1的方法，發(fā)現(xiàn)明膠微囊在48 h內(nèi)累積釋藥量可達(dá)到48%。

3.2 采用油相分離法制備乙基纖維素蛹蟲(chóng)草活性肽膠囊

3.2.1 乙基纖維素膠囊的形態(tài)觀察及性能測(cè)試

如圖2B所示，乙基纖維素膠囊呈表面光滑、分散均勻的球形粒子(粒徑大約為200 nm～1 μm)，少量微囊有黑色囊心。如圖2C所示，2 965 cm-1與2 884 cm-1這兩處的吸收峰均為乙基纖維素-CH鍵的伸縮振動(dòng)特征峰，表明包埋成功。在該試驗(yàn)條件下，包封率為83%，載藥量為21%。

2A 乙基纖維素膠囊的光鏡檢測(cè) 2B 乙基纖維素膠囊的掃描電鏡 2C 乙基纖維素膠囊的紅外光譜圖2 蛹蟲(chóng)草肽的乙基纖維素微囊

3.2.2 乙基纖維素微囊的釋藥性能

采用2.2.1的方法，發(fā)現(xiàn)乙基纖維素微囊釋藥量變化在36 h內(nèi)釋藥率達(dá)到28%，然而隨即開(kāi)始下降至48 h的20%。

3.3 復(fù)相乳液法制備蛹蟲(chóng)草肽聚乳酸載藥微囊

3.3.1 聚乳酸微囊的形態(tài)觀察及包封率和載藥量檢測(cè)

如圖3中所示，復(fù)相乳液法制備的蛹蟲(chóng)草肽聚乳酸微囊凍干粉呈白色，在顯微鏡下為球狀，無(wú)黑色囊心。在該試驗(yàn)條件下，包封率為79.2%，成球率為86.90%，載藥量為58%。

3A 聚乳酸微囊凍干粉 3B聚乳酸微囊顯微鏡觀察 3C 聚乳酸微囊的掃描電鏡觀察圖3 蛹蟲(chóng)草肽的聚乳酸微囊

3.3.2 聚乳酸微囊的釋藥性能

采用2.2.1的方法，發(fā)現(xiàn)聚乳酸微囊釋藥量在48 h內(nèi)呈遞增趨勢(shì)且最大峰值為67%。圖4為釋藥前聚乳酸微囊，其外表圓潤(rùn)充裕且無(wú)裂縫但釋藥中卻發(fā)現(xiàn)有縫隙出現(xiàn)。藥物釋出一般通過(guò)表面蝕解、整體崩解等方式表達(dá)，其緩釋過(guò)程如下圖5所示。

A 釋藥前 B 釋藥過(guò)程中圖4 顯微鏡下蛹蟲(chóng)草肽釋藥聚乳酸微囊體外釋藥狀態(tài)觀察

蛹蟲(chóng)草聚乳酸微囊 表面蝕解 整體崩解的過(guò)程圖5 蛹蟲(chóng)草肽的聚乳酸微囊緩釋過(guò)程

3.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲(chóng)草肽聚乳酸微囊制備工藝

因素水平表，見(jiàn)表1。響應(yīng)面分析參數(shù)見(jiàn)表2，響應(yīng)面圖分析四個(gè)提取因素對(duì)蛹蟲(chóng)草肽包埋率的影響見(jiàn)圖6。

表1 因素水平表

表2 響應(yīng)面分析參數(shù)

圖6 響應(yīng)面圖分析四個(gè)提取因素對(duì)蛹蟲(chóng)草肽包埋率的影響

方差分析表明：決定系數(shù)(R2=0.9328)，僅有0.7%的總變量在模型中沒(méi)能解釋，矯正決定系數(shù)(Adj.R2=0.8658)說(shuō)明模型有1.35%的變異，能夠比較真實(shí)地反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果。變異系數(shù)值(C.V.%)僅為1.84，更加清晰的證明實(shí)驗(yàn)值的高度精確和可靠?？梢圆捎没貧w模型對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。

利用Design Expert對(duì)上表的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，建立蛹蟲(chóng)草肽包封率與PLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、溫度(C)油水比(D)的回歸方程為：

包封率(%)=84.76+4.91A+8.03B+5.64C+1.15D-5.92AB-4.18AC-2.13AD+4.00BC-3.27BD+1.45CD-6.94A2-5.88B2-9.67C2-2.88D2。

該模型的F值為13.88，相對(duì)于的P值小于0.000 1，說(shuō)明該模型極顯著，同時(shí)失擬項(xiàng)P值為0.253 5 >0.05，失擬不顯著，說(shuō)明所選用的二次回歸模型是合適的，并且各因素對(duì)包封率影響程度大小依次是PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)>溫度>PLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)>油水比。

由該模型得到的最佳條件為包封率87.2%，PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.56%，溫度為40.8℃，PLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.11%，油水比為1∶8。在此條件下重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到包封率為87.2%±0.02%，進(jìn)一步證明該模型合理。

3.4 PLA微囊粒徑及形態(tài)觀察

PLA微囊的掃描電鏡結(jié)果如圖7所示，不難看出聚乳酸微囊錯(cuò)落有致地均勻分布在掃面電鏡下，平均粒徑為50.4 μm。

圖7 PLA 微囊的掃描電鏡結(jié)果

3.5 蛹蟲(chóng)草肽聚乳酸微囊制備工藝優(yōu)化后的紅外光譜及掃描電鏡檢測(cè)

從圖8A中可判斷出甲基的伸縮振動(dòng)峰和彎曲振動(dòng)分別發(fā)生在2 948 cm-1和1 458 cm-1，該紅外數(shù)據(jù)說(shuō)明成功制備了聚乳酸微囊，且在制備過(guò)程中未發(fā)生其他化學(xué)變化。從掃描電鏡的結(jié)果圖8B可以看出，聚乳酸微囊外形橢圓，表面光滑，包封率良好，符合微囊要求。

8A聚乳酸微囊的紅外光譜圖

8B 聚乳酸微囊的掃描電鏡圖圖8 蛹蟲(chóng)草肽聚乳酸微囊紅外光譜及掃描電鏡圖

3.6 聚乳酸蛹蟲(chóng)草肽微囊體外降血糖活性檢測(cè)

3T3-L1脂肪細(xì)胞是否分化完全主要從細(xì)胞形態(tài)與油紅O染色兩個(gè)方面來(lái)進(jìn)行觀察。如圖9A所示，未分化的3T3-L1前脂肪呈現(xiàn)為纖維狀、不規(guī)則梭型，用油紅O染色后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有脂肪滴。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，在12 d時(shí)，細(xì)胞逐漸變?yōu)闄E圓，在倒置顯微鏡下可以觀察到，大約90%以上的細(xì)胞均誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞(圖9B)，3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示， 在48 h后加入1 mmol/L的DEX和3 mmol/L的DEX胰島素均出現(xiàn)了較為明顯的變化。由圖9C可以看出，在40 h后3 mmol/L的DEX胰島素抵抗效果要優(yōu)于1 mmol/L的DEX抵抗效果，可以用于構(gòu)建胰島素抵抗模型并進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

9A 未分化的脂肪細(xì)胞 9B 分化12 d的脂肪細(xì)胞 9C 胰島素抵抗模型的建立圖9 建立3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型

本研究采用包埋好的3種蛹蟲(chóng)草肽微囊，利用3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型進(jìn)行降血糖活性檢測(cè)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10。圖中顯示，對(duì)照組與正常組比較，葡萄糖消耗量下降極顯著，陽(yáng)性組對(duì)葡萄糖的利用率顯著提高。但乙基纖維素微囊組對(duì)葡萄糖的利用率與對(duì)照組差異不顯著，明膠微囊組與對(duì)照組相比，差異稍顯著，而聚乳酸微囊組與對(duì)照組比較，差異極顯著。以上結(jié)果說(shuō)明3種處理中，聚乳酸微囊制備過(guò)程中對(duì)蛹蟲(chóng)草肽活性具有保護(hù)作用，而其他2種處理由于化學(xué)試劑的使用可能降低了蛹蟲(chóng)草肽活性。

圖10 蛹蟲(chóng)草肽細(xì)胞水平上的體外降血糖活性檢測(cè)

3.7 蛹蟲(chóng)草活性肽微囊穩(wěn)定性

3.7.1 3種微囊的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將各種微囊放置于冷藏條件下(4 ℃)6個(gè)月后，各取100 mg檢測(cè)肽含量減損，各種微囊肽含量未發(fā)生流失，說(shuō)明冷藏條件下各種活性肽微囊很穩(wěn)定。

3.7.2 蛹蟲(chóng)草活性肽微囊在人工胃液中的穩(wěn)定性

采用2.2.6中的方法，發(fā)現(xiàn)將各微囊制劑置于人工胃液3 h后，聚乳酸微囊的肽含量為100%，乙基纖維素微囊的肽含量為75%，明膠微囊含量為70%。可見(jiàn)，聚乳酸微囊具有較好的抗胃酸及胃蛋白酶穩(wěn)定性。

3.8 3種微囊細(xì)胞毒性試驗(yàn)

細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果如圖11所示。左圖為24 h各樣品的處理結(jié)果，其中1、2、3、4 為乙基纖維素微囊在4個(gè)不同質(zhì)量濃度下對(duì)細(xì)胞毒性的影響，5、6、7、8為聚乳酸微囊在4個(gè)不同質(zhì)量濃度下對(duì)細(xì)胞毒性的影響，9、10、11、12 為明膠微囊在4個(gè)不同質(zhì)量濃度下對(duì)細(xì)胞毒性的影響。從左圖結(jié)果可以看出，在乙基纖維素及明膠微囊制劑作用下，細(xì)胞生存能力與對(duì)照組不存在顯著差異，說(shuō)明二者不抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，無(wú)細(xì)胞毒性，而聚乳酸微囊肽處理則對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)能力略有促進(jìn)(P<0.01)，推測(cè)與聚乳酸微囊載藥量較大及釋放量較高有關(guān)。右圖為48 h各樣品的處理結(jié)果，顯示各處理與對(duì)照相比較其細(xì)胞生存能力無(wú)明顯差異?？梢?jiàn)，各種微囊對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。

圖11 MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié) 論

本研究分別以藥用明膠、乙基纖維素及聚乳酸為囊材制備蛹蟲(chóng)草肽微囊，并對(duì)其性能及生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行了檢測(cè)。研究結(jié)果表明，從包封率、載藥量及48 h的釋藥量三個(gè)主要指標(biāo)比較，聚乳酸微囊的性能最優(yōu)。

本項(xiàng)研究在篩選了載肽微囊不同囊材的基礎(chǔ)上，獲得且優(yōu)化了蛹蟲(chóng)草肽聚乳酸微囊的制備工藝。由該模型得到的最佳條件為包封率87.2%，PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.56%，溫度為40.8 ℃，PLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.11%，油水比為1：8。在此條件下重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到包封率為87.2%±0.02%。

在此工藝條件下，蛹蟲(chóng)草肽聚乳酸微囊具備如下性能。一是靶向性。體外釋藥過(guò)程研究表明，在含有胃蛋白酶的酸性環(huán)境中，聚乳酸微囊未被水解，而在含有胰蛋白酶的堿性環(huán)境中，聚乳酸微囊裂解并釋放蛹蟲(chóng)草肽，證明聚乳酸微囊具有明顯的靶向性。二是控釋性。聚乳酸微囊作為藥物載體具有良好的緩控釋性能。蛹蟲(chóng)草肽微囊穩(wěn)定性研究的結(jié)果，冷藏條件下各種蛹蟲(chóng)草肽微囊很穩(wěn)定；蛹蟲(chóng)草肽微囊在人工胃液中穩(wěn)定性，聚乳酸微囊具有較好的的抗胃酸及胃蛋白酶穩(wěn)定性。

本研究以明膠、乙基纖維素、聚乳酸(PLA)為囊材制備的3種納米蛹蟲(chóng)草活性肽微囊經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。