周 影 薛鎮(zhèn)海 靳向東 韓建華 康 偉

(吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林吉林 132000)

磷元素是植物生長所必須的營養(yǎng)元素之一。土壤中的磷元素是以無機(jī)化合物和有機(jī)化合物這兩種形式存在，無機(jī)狀態(tài)的磷在一定條件下可以釋放出來，供植物吸收；土壤中的有機(jī)磷不能直接被植物吸收，必須通過微生物作用轉(zhuǎn)變成無機(jī)形式才能被吸收[1]。我國耕地2/3面積的土壤缺磷[2]，土壤中能被直接吸收的磷占土壤全磷含量的2%～3%[3]，開發(fā)土壤中難以吸收的磷元素是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)急需解決的問題。隨著對解磷微生物研究的深入，利用解磷微生物生產(chǎn)的菌肥已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用推廣，但是部分產(chǎn)品存在溶磷效果不穩(wěn)定問題，因此篩選出高效、穩(wěn)定的溶磷菌具有重要意義。本文從蠶沙中篩選解磷菌，以期篩選出溶磷能力強(qiáng)的菌株，為菌肥研究及開發(fā)提供高效解磷菌及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取50頭柞蠶五齡幼蟲，置于室內(nèi)養(yǎng)殖，用鑷子收集其新鮮糞便于無菌的采樣袋中，放于-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離及培養(yǎng)

稱取蠶沙樣品10 g裝入250 mL的錐形瓶中，加入適量玻璃珠和100 mL無菌水，靜置浸泡20 min后，在恒溫?fù)u床中200 r/min 振蕩30 min，形成菌懸液母液，然后依次稀釋至1×10-1～1×10-5，吸取200 μL均勻涂布于無機(jī)磷培養(yǎng)基上[NBRIP：葡萄糖10 g， MgCl2·6H2O 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，Ca3(PO4)2 5 g，瓊脂粉 20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH7.0～7.4]，30 ℃培養(yǎng)10 d。

1.2.2 解磷菌初篩

從培養(yǎng)基平板中挑選出具有溶磷圈的菌落，采用平板劃線的方法在培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化，接種到LB斜面培養(yǎng)基進(jìn)行保藏，將純化后的菌株再接種于無機(jī)磷培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)5 d，測定菌落直徑(R)及溶磷圈直徑(D)，根據(jù)溶磷圈直徑與菌落直徑的比值(D/R)，初步確定溶磷能力較強(qiáng)的菌株。

1.2.3 解磷菌復(fù)篩

1.2.3.1 解磷能力測定

采用鉬銻抗比色法測定上清液中的有效磷含量。

1)繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

在容量瓶中分別加入相應(yīng)體積的100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)磷溶液，加2滴2,6-硝基苯酚作指示劑，用稀硫酸和10%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，加鉬銻抗顯色劑5 mL，定容至刻度，使標(biāo)準(zhǔn)磷濃度分別為0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L和1.0 mg/L，搖勻，在室溫下(25 ℃左右)反應(yīng)30 min后用紫外分光光度計在660 nm處比色，根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2)培養(yǎng)液中可溶磷含量的測定

將初篩得到的解磷菌株接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12～24 h，調(diào)整菌液濃度在OD600=1左右；制備好的種子液以2%比例接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)5～7 d，每株菌做3個重復(fù)，以不接菌為空白對照。培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至無菌的50 mL離心管中，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min后取2.5 mL上清液于50 mL容量瓶中加2滴2,6-二硝基苯酚作指示劑，加1滴稀硫酸至反應(yīng)液為無色，加鉬銻抗顯色劑5 mL，定容，發(fā)生反應(yīng)。用紫外分光光度計測定上清液于660 nm處的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出上清液中的有效磷含量。

1.2.4 解磷菌的形態(tài)觀察

將解磷細(xì)菌接種在無機(jī)磷或有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，5 d后觀察單菌落特征，記錄其大小、顏色、形狀、透明度、表面光澤度、邊緣特征、隆起程度等。

1.2.5 菌株的分子鑒定

將解磷菌分別接種于250 mL裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于30 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，離心后收集菌絲體，然后用OMEGA有限公司的細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒提取菌株DNA用于PCR鑒定。選用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其引物序列：27F( 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3')；1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3’)。擴(kuò)增體系擴(kuò)增采用25 μL體系：DNA模板l μ、2x Taq Mix 12.5 μL、引物各l μL、ddH2O 9.5 μL。 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min， 35個循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后，純化回收目的條帶，送上海生工生物股份有限公司測序。 將所測得的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行Blast 分析比對，確定其近緣種屬關(guān)系。

2 結(jié)果分析

2.1 解磷菌的篩選結(jié)果

在培養(yǎng)基上具有溶磷圈的菌株共計9 株，并對其進(jìn)行分離純化。用游標(biāo)卡尺測量出水解圈和菌落的直徑，測量3次，取平均值計算溶磷圈直徑與菌落直徑的比值(D/R)，結(jié)果如表1，溶磷圈直徑與菌落直徑的比值最大的菌株為L10，數(shù)值是4.786，比值最小的是L12，數(shù)值是2.150，具體如表1。

表1 溶磷圈直徑與菌落直徑的比值(D/R)

2.2 解磷菌形態(tài)特征

9 株菌都能在無機(jī)磷培養(yǎng)基上生長，菌落顏色呈多樣性，有近白色，黃色，黃白色等，菌落的形態(tài)大多為圓形，表面光滑，不透明，濕潤，邊緣整齊。具體如表2。

表2 菌落形態(tài)特征

2.3 解磷能力的測定結(jié)果

平板解磷圈大小只是定性的表明菌株的解磷特性，解磷能力的測定還需結(jié)合定量的方法——液體培養(yǎng)法，通過測定上清液磷濃度并計算其解磷率來表示菌株解磷能力的大小。

2.3.1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

溶性磷酸鹽在酸性條件下可與鉬酸銨結(jié)合生產(chǎn)磷鋁酸酰胺，這種化合物經(jīng)對苯二酚還原成藍(lán)色化合物，用可見光分光光度計在波長660 nm處測定鉬銻抗的吸光值，以定量分析可溶性磷的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 發(fā)酵液解磷能力測定

磷鉬藍(lán)比色法測定液體培養(yǎng)基中磷含量，試驗結(jié)果表明解磷能力最高的菌株是F6，解磷量是113.8 mg/L，其次是H6，解磷量是87.9 mg/L，如圖2?？傮w上，菌種解磷圈大小與發(fā)酵液解磷能力二者不存在正相關(guān)關(guān)系。

圖2 解磷菌解磷效果

2.4 菌株鑒定

選取解磷能量大于50 mg/L的菌株進(jìn)行16S rRNA基因測序，結(jié)果表明，L10、H10、H16為不動桿菌(Acinetobactersp.)，F(xiàn)6、H4、L12為假單胞菌(Pseudomonassp.)，F(xiàn)1、F4株為克呂沃爾菌(Kluyverasp.)，C1株為糖多胞菌(Saccharopolysporasp.)。

3 討 論

磷元素是土壤中吸收效率最低的營養(yǎng)元素之一，土壤中的磷酸鹽礦物只有在理化作用和微生物作用下分解的磷才能供作物生長，溶磷微生物在磷的地球化學(xué)循環(huán)中起著重要作用[4]。 蠶沙中含有大量的有益微生物，李慶榮等[5]在發(fā)酵的蠶沙中篩選出一株具有良好解磷效果的菌株，本研究從蠶沙中篩選出9株具有解磷圈的菌株，并采用液體發(fā)酵方式對其解磷量進(jìn)行測定，分別為不動桿菌、假單胞菌、克呂沃爾菌、糖多胞菌。在平板篩選時, 雖然部分菌株溶磷圈直徑較大, 如菌株L10、C1, 但其在液體培養(yǎng)條件下的溶磷效果較差。有研究認(rèn)為這種現(xiàn)象可能是由于培養(yǎng)基條件不同，菌落大小及在平板堆積情況的差異造成水解圈大小不同[6-7]。本研究篩選出一株解磷能力最高的菌株, 解磷量最高的是113.8 mg/L，然而這種溶磷條件還是試驗性的，要想進(jìn)一步應(yīng)用到生產(chǎn)實際中去，還須進(jìn)行田間試驗。