張振清， 李晟婷， 范光耀

(1.鐵道警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系， 河南鄭州 450053；2.鐵道警察學(xué)院鄭州市刑事科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南鄭州 450053；3.上海鐵路公安局上海公安處， 上海 201100； 4.紹興文理學(xué)院司法鑒定中心， 浙江紹興 312000；5.刑事檢驗(yàn)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川瀘州 646000)

0 引言

中國(guó)擁有漫長(zhǎng)的鐵路線(xiàn)，線(xiàn)路運(yùn)營(yíng)安全關(guān)系著國(guó)計(jì)民生[1]。鐵路柵欄一直擔(dān)負(fù)著維護(hù)線(xiàn)路安全的重要安防職責(zé)[2]，而鐵路線(xiàn)路破壞及盜竊案件中案犯抵達(dá)作案現(xiàn)場(chǎng)通常無(wú)法回避與鐵路柵欄相互接觸。羅卡德定律(Locard’s principle)指出，接觸即發(fā)生物質(zhì)轉(zhuǎn)移。受承痕體表面形狀所限，要提取鐵路柵欄上遺留的指紋以進(jìn)行個(gè)人識(shí)別往往難度極大。與此同時(shí)，案犯與柵欄接觸后也可遺留來(lái)自人體正常代謝過(guò)程中的脫落上皮細(xì)胞及汗液中的游離DNA。對(duì)此類(lèi)微量接觸性DNA進(jìn)行檢驗(yàn)的，可為偵查破案提供重要線(xiàn)索。盡管如此，由于鐵路線(xiàn)路柵欄上遺留的接觸性DNA常處于野外環(huán)境，物證難以整體提取且不易保存，且受到采樣方法影響，分型成功率一直不高。本文以鐵路柵欄為研究對(duì)象，從被模擬徒手攀爬過(guò)的柵欄上獲取接觸性DNA并進(jìn)行STR分型，分別對(duì)接觸性DNA的采集、提取方法和不同材質(zhì)柵欄上STR(short tandem repeat，短串聯(lián)重復(fù)序列)分型效果進(jìn)行比較分析，以期為鐵路線(xiàn)路破壞及盜竊等實(shí)際案件[3]中遇到的柵欄上接觸性DNA檢驗(yàn)提供重要參考。

1 材料與方法

DNA樣本采集實(shí)驗(yàn)用柵欄，實(shí)驗(yàn)選取在野外處于有效運(yùn)營(yíng)中的鐵路線(xiàn)路上防護(hù)柵欄，柵欄材質(zhì)包括3種：鐵質(zhì)金屬網(wǎng)、噴漆金屬網(wǎng)和鋼筋混凝土防護(hù)柵欄。攀爬及抓握實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)者潔凈雙手1 h后，模擬攀爬動(dòng)作，抓握鐵路柵欄10 s，不同材質(zhì)柵欄分別重復(fù)12次。以上實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行36次。

樣本提取采用棉簽兩次轉(zhuǎn)移法(擦拭法)[4-5]：生物物證提取棉簽，滴加40 μL純水，用該棉簽在遺留有抓握痕跡處反復(fù)擦拭，干棉簽擦拭相同部位，充分轉(zhuǎn)移剩余細(xì)胞(如圖1)，常溫干燥環(huán)境中保存。脫落細(xì)胞粘取器采集法(粘取法)[6]：取出脫落細(xì)胞粘取器，小心揭開(kāi)粘面保護(hù)層，用粘面在有抓握痕跡處反復(fù)粘取多次(如圖1)，然后放回封存盒，常溫干燥環(huán)境中保存。

圖1 鐵路柵欄上接觸性DNA的提取

1.1 主要儀器和試劑

脫落細(xì)胞粘取器(長(zhǎng)春市博坤生物科技有限公司)；生物物證提取專(zhuān)用棉簽(長(zhǎng)春市博坤生物科技有限公司)；Chelex-100Resin樹(shù)脂(美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司)；Microcon?離心式超濾管(美國(guó)密理博Milipore公司)；ABI ProFlexTM熱循環(huán)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司) ;Applied Biosystems GlobalFiler STR試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);3500系列基因分析儀(美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和純化

Chelex-100提取法剪取接觸客體的棉簽尖端部分適量，置于1.5 mL離心管中，加入150 μL Chelex-100懸濁液(5%)與10 μL蛋白酶K溶液(10 mg/mL)，恒溫干熱器上56 ℃孵育12 h，煮沸8 min，離心5 min(13 000 r/min)后，取上清液適量擴(kuò)增。

Chelex-100聯(lián)合Microcon純化柱提取法(簡(jiǎn)稱(chēng)Chelex聯(lián)合Microcon法)[7-8]重復(fù)Chelex-100法操作步驟，取Chelex-100法離心后的上清液約100 μL轉(zhuǎn)入Microcon?超濾離心管中，離心4～5 min(6 500 r/min)，反轉(zhuǎn)離心1 min(14 000 r/min)收集濃縮液約10 μL，取濃縮液適量擴(kuò)增。

1.2.2 DNA擴(kuò)增和檢驗(yàn)

擴(kuò)增按照GlobalFiler試劑盒擴(kuò)增按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中反應(yīng)體系縮小至10 μL，模板DNA用量1 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI 3500 GeneticAnalyzer遺傳分析儀上使用POP-4凝膠進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢驗(yàn)。進(jìn)樣參數(shù):12 s，3.0 kV。用GeneMapper?ID-Xv1.2軟件對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3 DNA分型結(jié)果分類(lèi)

通過(guò)觀察來(lái)自受試者(模擬攀爬者)STR基因座中有效等位基因數(shù)量的多少，來(lái)評(píng)估STR分型系統(tǒng)對(duì)該DNA提取方法的魯棒性。各基因座等位基因峰值檢測(cè)閾值為200 RFU。每個(gè)樣本的等位基因檢出率(Detection Rate of Alleles，DRA)可定義為，實(shí)際觀察到的受試者有效等位基因個(gè)數(shù)與期望檢出的全部受試者等位基因個(gè)數(shù)之比的百分?jǐn)?shù)。為便于分析比較，將DRA大致劃分為4組：0%、1%～49%、50%～99%、100%。應(yīng)用GlobalFiler試劑盒對(duì)受試者外周血中DNA進(jìn)行擴(kuò)增，觀察到的各基因座上全部等位基因個(gè)數(shù)為37個(gè)。

2 結(jié)果

2.1 采集方法比較

采用擦拭及粘取兩種方法，分別采集柵欄表面接觸性DNA(不區(qū)分柵欄材質(zhì)，每種各9份)，Chelex-100法提取DNA，進(jìn)行STR分型，統(tǒng)計(jì)每份檢材檢出率DRA，結(jié)果見(jiàn)表1。粘取法檢出率有2份樣本介于50%～99%，優(yōu)于檢出率全部小于49%的擦拭法。

表1 兩種不同DNA采集方法的等位基因檢出率比較

9份檢材期望檢出全部受試者等位基因數(shù)應(yīng)為333(37×9)個(gè)，采用棉簽擦拭法，實(shí)際檢出61個(gè)，總檢出率為18.3%；采用粘取法，實(shí)際檢出99個(gè)，總檢出率為29.7%。

2.2 接觸性DNA提取方法的比較

對(duì)由粘取法采集的DNA(不區(qū)分柵欄材質(zhì))，分別用Chelex-100法及Chelex聯(lián)合Microcon法提取并純化DNA(每種各9份)，比較兩種方法提取后的STR分型圖譜中每個(gè)基因座上等位基因的峰高、峰面積及等位基因丟失率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兩種DNA提取方法效果的比較

兩種DNA提取方法分型結(jié)果的等位基因檢出率情況如表3。

表3 兩種 DNA提取方法的等位基因檢出率比較

9份檢材期望檢出全部受試者等位基因數(shù)應(yīng)為333(37×9)個(gè)，采用Chelex-100法，實(shí)際檢出94個(gè)，總檢出率為28.2%；采用Chelex聯(lián)合Microcon法，實(shí)際檢出68個(gè)，總檢出率為20.4%，由此可知采用Chelex-100法，相比于Chelex聯(lián)合Microcon法，等位基因檢出率較高。然而，Chelex提取法的DNA混合現(xiàn)象明顯，等位基因個(gè)數(shù)達(dá)到或超過(guò)3個(gè)以上的基因座高達(dá)53個(gè)，占全部基因座個(gè)數(shù)(24×9)的24.5%，而經(jīng)過(guò)Microcon純化后，檢出此類(lèi)基因座數(shù)量有40個(gè)，占全部基因座個(gè)數(shù)(24×9)的18.5%，分型圖譜中的等位基因即雜峰相對(duì)減少。

如圖2所示，同為噴漆金屬網(wǎng)上接觸性DNA分型，Chelex-100法提取的DNA所檢出受試者等位基因明顯多于Chelex-100聯(lián)合Microcon法，但檢出來(lái)自其他不明混雜成分DNA的等位基因數(shù)量也明顯多于后者?？梢?jiàn)，由于應(yīng)用了Microcon進(jìn)行純化，雖然總體等位基因數(shù)量減少，混雜污染卻得以大大減輕。

圖2 噴漆金屬網(wǎng)上接觸性DNA分型圖譜

2.3 不同材質(zhì)柵欄DNA分型效果的比較

對(duì)由粘取法采集的DNA(不區(qū)分DNA提取及純化方法)，分別對(duì)鐵質(zhì)金屬網(wǎng)、噴漆金屬網(wǎng)和鋼筋混凝土防護(hù)柵欄上DNA分型效果進(jìn)行比較(每種各6份)。

6份檢材期望檢出全部受試者等位基因數(shù)應(yīng)為222(37×6)個(gè)，鐵質(zhì)金屬網(wǎng)上等位基因?qū)嶋H檢出51個(gè)，總檢出率為23.0%；噴漆金屬網(wǎng)上實(shí)際檢出83個(gè)，總檢出率為37.4%；鋼筋混凝土防護(hù)柵欄上實(shí)際檢出53個(gè)，總檢出率為23.9%。相較于鐵質(zhì)金屬網(wǎng)及鋼筋混凝土防護(hù)柵欄，噴漆金屬網(wǎng)上接觸性DNA的DRA顯然更高。

表4 3種材質(zhì)鐵路柵欄的等位基因檢出率比較

3 討論

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法比較了兩種常用接觸性DNA采集方法，結(jié)果顯示，脫落細(xì)胞粘取器在基因座檢出率可達(dá)29.7%，該方法優(yōu)于棉簽擦拭法。分析可能由于野外鐵路柵欄附著大量灰塵、腐殖質(zhì)、油脂或是鐵銹等PCR抑制物，生物物證提取棉簽在潤(rùn)濕后，將表層脫落細(xì)胞及抑制物一同采集，從而影響后期的PCR反應(yīng)。脫落細(xì)胞粘取器則主要集中粘附表面脫落上皮細(xì)胞，粘附承痕體上的各類(lèi)抑制物較少。同時(shí)，脫落細(xì)胞在孵育及變形過(guò)程中釋放出的核酸成分能夠進(jìn)入溶液，而粘附的含抑制物顆粒相對(duì)不易松脫和解離，較少地進(jìn)入到下一步離心擴(kuò)增環(huán)節(jié)。可見(jiàn)，脫落細(xì)胞粘取器采集法，相比于棉簽擦拭法，在鐵路柵欄上接觸性DNA分型效果上具有一定的優(yōu)勢(shì)。本研究中，在已知有抓握痕跡處進(jìn)行反復(fù)用粘面粘取，是模擬接觸部位已知的理想狀態(tài)。盡管如此，脫落細(xì)胞粘取器采集法在實(shí)踐操作中仍應(yīng)十分小心，現(xiàn)場(chǎng)勘查人員應(yīng)盡可能選取疑似攀爬或抓握過(guò)的部位，否則實(shí)際被粘取到的脫落細(xì)胞可能遠(yuǎn)沒(méi)有帶入的各類(lèi)污染更多，這勢(shì)必會(huì)極大影響對(duì)此類(lèi)微量物證的檢出率。由此看來(lái)，對(duì)潛在集中接觸部位的準(zhǔn)確預(yù)判，實(shí)際上對(duì)提取DNA的質(zhì)與量都兼具影響，這需要豐富的現(xiàn)場(chǎng)勘查經(jīng)驗(yàn)和較強(qiáng)的生物物證發(fā)現(xiàn)設(shè)備及能力。另一方面值得注意的是，應(yīng)盡量控制對(duì)微量生物物證粘取的次數(shù)和力度，過(guò)大的力度和粘取次數(shù)會(huì)攜帶走更多的抑制物，特別是針對(duì)野外現(xiàn)場(chǎng)；而過(guò)小的力度則可能僅粘走承痕體表面附著的細(xì)微顆粒物，這些顆粒物凸起的表面體積微小，本身殘留DNA的量十分有限。采用的粘取次數(shù)和力度應(yīng)有一個(gè)最適范圍，以最大限度提高微量DNA的檢出率。然而，由于不同的承痕體及其所處的環(huán)境不同，實(shí)踐中對(duì)粘取次數(shù)進(jìn)行規(guī)范統(tǒng)一仍有較大難度，但對(duì)于微量DNA采集和提取方法的科學(xué)研究，則應(yīng)盡量采用相同粘取次數(shù)和力度，以減小此類(lèi)因素在組間對(duì)比時(shí)所帶來(lái)的干擾。

本實(shí)驗(yàn)采用了Chelex-100法和Chelex聯(lián)合Microcon法提取接觸性DNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用Chelex聯(lián)合Microcon法得到的等位基因檢出率(20.4%)要小于Chelex-100法(28.2%)。Chelex聯(lián)合Microcon法所得到的STR分型圖譜中峰面積的平均值(3 209.5)也要略低于使用Chelex-100法(4 119.1)。Chelex-100法提取操作流程少，最大程度上減少了模板的流失，然而其抗污染能力較差[9]。Microcon純化法相對(duì)于磁珠法或硅珠法操作步驟簡(jiǎn)單，省時(shí)高效，常被用在法醫(yī)微量、降解的生物檢材提取純化實(shí)驗(yàn)[10]。在對(duì)槍彈的金屬和合成材料客體表面的接觸性DNA研究中，Microcon純化法有著不俗的表現(xiàn)[11]。本實(shí)驗(yàn)中，柵欄上接觸性DNA經(jīng)過(guò)Chelex-100法提取后，上清液中除含核酸外還含有大量抑制物，直接用于擴(kuò)增效果并不理想，雖然我們能夠檢出的受試者等位基因相對(duì)聯(lián)合法較多，但是分型圖譜中卻能觀察到大量的來(lái)自非受試者DNA的污染情況，這對(duì)后期的分析解讀極為不利。從證據(jù)證明力的角度，這樣的檢測(cè)結(jié)果甚至不如僅能檢出較少等位基因，但混合現(xiàn)象卻大幅改善的Microcon純化法。

采用Chelex聯(lián)合Microcon法，通過(guò)濃縮純化能夠有效去除提取到的混合DNA，減少STR分型圖譜中的雜峰。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們可以觀察到，大多數(shù)Microcon純化后檢出的等位基因都能在同一樣本Chelex-100法檢出的圖譜中找到，這提示我們常規(guī)檢案中遇到類(lèi)似混雜顯現(xiàn)明顯的檢材，不應(yīng)輕易放棄，可結(jié)合純化的方法進(jìn)一步探究其等位基因所屬個(gè)體。

從噴漆金屬網(wǎng)上接觸性DNA的STR分型圖譜中可以看出，其相較于鐵質(zhì)金屬網(wǎng)及鋼筋混凝土防護(hù)柵欄DRA更高。分析其原因，可能由于來(lái)自鐵質(zhì)金屬網(wǎng)上鐵銹成分及鋼筋混凝土防護(hù)柵欄上各種離子成分對(duì)PCR的抑制作用。采用粘取法仍不能有效避免將大量PCR抑制物帶入后續(xù)PCR反應(yīng)中，從而難以獲取較為理想的DNA分型效果。為此，可設(shè)計(jì)專(zhuān)門(mén)針對(duì)磚石類(lèi)或含鐵銹檢材的PCR抑制物純化方法或PCR增強(qiáng)劑以應(yīng)對(duì)這一難題，這也是后續(xù)研究中的努力方向。

4 結(jié)論

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)鐵路柵欄上接觸性DNA進(jìn)行檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)并歸納出對(duì)柵欄上接觸性DNA進(jìn)行采集和提取的優(yōu)勢(shì)方法。該研究為同行在鐵路線(xiàn)路破壞及盜竊等實(shí)際案件中有效應(yīng)對(duì)此類(lèi)疑難生物檢材提供參考和借鑒。