照日格吐，孫志剛，焦杰，劉悅

[1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院胸外科，內(nèi)蒙古 010020；2.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院（襄陽(yáng)市中心醫(yī)院）消化內(nèi)科，湖北襄陽(yáng) 441021]

食管癌是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤。外科手術(shù)是早期患者主要的治療方法，中晚期患者以放化療為主，但效果欠佳，且毒副作用會(huì)加重患者痛苦；中醫(yī)藥治療可幫助食管癌患者術(shù)后的調(diào)理和恢復(fù)，并能配合西醫(yī)，改善患者的生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生命，且毒副作用小，有相輔相成之效[1-4]。銀杏葉提取物是從銀杏葉中提取的有藥理活性的混合物，主要成分包括黃酮類(lèi)、萜內(nèi)脂類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等，具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗氧化和抗腫瘤等作用[5-6]。有研究報(bào)道銀杏葉提取物能誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7]；還可能通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）信號(hào)通路抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]；可能通過(guò)抑制胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases, ERK）/NF-κB/基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase, MMP-2）信號(hào)通路抑制胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移[9]。然而銀杏葉提取物對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響及機(jī)制尚不清楚。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）是一種細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在體內(nèi)可被其最常見(jiàn)的上游激酶——酪氨酸激酶（tyrosine kinase, JAK）磷酸化激活，JAK/STAT3 信號(hào)通路的異?；罨艽龠M(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，JAK/STAT3 信號(hào)通路的靶向抑制劑可抑制腫瘤發(fā)展[10-11]。有研究[12]報(bào)道LINC01535 通過(guò)激活JAK/STAT3 通路促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌增殖并抑制凋亡。還有研究報(bào)道缺血性腦卒中后銀杏葉提取物可通過(guò)抑制JAK2/STAT3 通路抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)2（lipocalin-2, LCN2）表達(dá)并減輕神經(jīng)炎癥損傷[13]。然而銀杏葉提取物是否通過(guò)JAK2/STAT3 信號(hào)通路影響食管癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移尚不清楚?；诖?，本實(shí)驗(yàn)研究銀杏葉提取物對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706 的增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響及其機(jī)制是否與JAK2/STAT3 信號(hào)通路有關(guān)，為中藥治療食管癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

食管癌細(xì)胞EC9706 購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司。胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，銀杏葉提取物（純度> 98%）購(gòu)自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司，白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）購(gòu)自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，RIPA 蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）購(gòu)自北京凱瑞基生物科技有限公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙錠（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，Transwell 小室、Matrigel 膠購(gòu)自美國(guó)BD 公司，一抗、二抗購(gòu)自武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司。CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組

食管癌細(xì)胞EC9706 用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將EC9706 細(xì)胞以每孔10×104個(gè)細(xì)胞接種到6 孔板中，每孔體積100 μL，分別用100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 的銀杏葉提取物培養(yǎng)，記為不同濃度銀杏葉提取物組，用等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組，用400 mg/L銀杏葉提取物和20 ng/mL IL-6 培養(yǎng)的細(xì)胞為銀杏葉提取物+IL-6 組。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

對(duì)照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+ IL-6 組，5 組細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種在6 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)48 h，每孔添加10 μL CCK-8 溶液，在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD）值，代表細(xì)胞增殖活性。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

對(duì)照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+IL-6 組，5 組細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種在6 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)48 h，室溫下1 000 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞；用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞2 次，1 000 r/min 離心5 min，洗滌細(xì)胞；加入300 μL 的1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；重懸后加入10 μL Annexin V-FITC，混勻后4℃避光孵育10 min， 再加入5 μL PI， 避光染色5 min。CytoFLEX 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western blotting 檢測(cè)Ki-67、Cleavedcaspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量

細(xì)胞裂解液提取對(duì)照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+IL-6 組的細(xì)胞總蛋白，用BCA 試劑盒定量。分別取50 μL 各組蛋白，煮沸10 min 變性后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后通過(guò)電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，封閉1 h；分別加稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日取出PVDF 膜，PBST 充分漂洗（5 min×3 次），加入稀釋的二抗，室溫孵育60 min，PBST 充分漂洗（5 min×3 次）后，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影。β-actin 為內(nèi)參。用Image J 軟件分析各蛋白條帶的灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶/β-actin條帶。其中，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組檢測(cè)Ki-67、Cleaved-caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量；對(duì)照組、400 mg/L 銀杏葉提取物組、銀杏葉提取物+IL-6 組檢測(cè)MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

采用8.0 μm 聚碳酸酯膜Transwell 小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)：對(duì)照組、400 mg/L 銀杏葉提取物組、銀杏葉提取物+IL-6 組細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基以1×104個(gè)/mL 的密度懸浮，將100 μL 懸浮液添加到上室，將600 μL 含血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液添加到下室，溫育48 h 后，用棉簽小心地擦去聚碳酸酯膜表面上未遷移的細(xì)胞；4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用PBS 輕輕清洗2 次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：用Matrigel膠包被Transwell 小室的上室，其余與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟相同。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較行t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組EC9706細(xì)胞OD值比較

對(duì)照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+IL-6 組，5 組細(xì)胞的OD 值分別為（1.246±0.08）、（1.015±0.09）、（0.602±0.05）、（0.418±0.04）及（1.108±0.11），5 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=181.344，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，不同濃度銀杏葉提取物組EC9706 細(xì)胞的OD 值均降低（P<0.05），細(xì)胞活性降低，且呈濃度依賴(lài)性；銀杏葉提取物+IL-6 組與400 mg/L 銀杏葉提取物組比較，銀杏葉提取物+IL-6組EC9706 細(xì)胞活性升高（t=17.895，P=0.000）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組EC9706細(xì)胞OD值的比較

2.2 各組EC9706細(xì)胞凋亡率的比較

對(duì)照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+IL-6 組，5 組的細(xì)胞凋亡率分別為（6.29±0.52）%、（10.03±0.91）%、（19.12±1.72）%、（25.09±2.13）%及（9.13±0.82）%，5 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=301.217，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，不同濃度銀杏葉提取物組EC9706 細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05），且呈濃度依賴(lài)性；銀杏葉提取物+IL-6 組與400 mg/L 銀杏葉提取物組比較，銀杏葉提取物+ IL-6 組EC9706 細(xì)胞凋亡率降低（t=21.639，P=0.000）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組EC9706細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖

400 mg/L 銀杏葉提取物能顯著抑制EC9706 細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，故選取400 mg/L 銀杏葉提取物為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

2.3 各組細(xì)胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

對(duì)照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+IL-6 組細(xì)胞的Ki-67、Cleaved-caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組Ki-67 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均降低（P<0.05），銀杏葉提取物+IL-6 組Ki-67 蛋白相對(duì)表達(dá)量較400 mg/L 銀杏葉提取物組升高（t=23.255，P=0.000）；100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組Cleaved-caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均升高（P<0.05），銀杏葉提取物+ IL-6 組Cleavedcaspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量較400 mg/L 銀杏葉提取物組降低（t=15.363，P=0.000）。對(duì)照組、400 mg/L銀杏葉提取物組、銀杏葉提取物+ IL-6 組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，400 mg/L 銀杏葉提取物組較對(duì)照組均降低（P<0.05），銀杏葉提取物+IL-6 組較400 mg/L 銀杏葉提取物組均升高（P<0.05）。見(jiàn)圖3、4 和表1、2。

圖3 對(duì)照組及不同濃度銀杏葉提取物組細(xì)胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達(dá)

圖4 400 mg/L銀杏葉提取物組與銀杏葉提取物+IL-6組細(xì)胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達(dá)

表1 各組細(xì)胞Ki-67、Cleaved-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表1 各組細(xì)胞Ki-67、Cleaved-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與100 mg/L 銀杏葉提取物組比較，P <0.05；③與200 mg/L 銀杏葉提取物組比較，P <0.05；④與400 mg/L銀杏葉提取物組比較，P<0.05。

Cleaved-caspase-3 0.29±0.02 0.39±0.03①0.62±0.05①②0.79±0.07①②③0.37±0.03④200.719 0.000組別對(duì)照組100 mg/L銀杏葉提取物組200 mg/L銀杏葉提取物組400 mg/L銀杏葉提取物組銀杏葉提取物+IL-6組F 值P 值Ki-67 0.92±0.09 0.82±0.08①0.52±0.05①②0.35±0.03①②③0.88±0.06④130.856 0.000

表2 3組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表2 3組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與400 mg/L銀杏葉提取物組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組400 mg/L銀杏葉提取物組銀杏葉提取物+IL-6組F 值P 值p-STAT3 0.72±0.07 0.32±0.03①0.65±0.06②131.075 0.000 MMP-2 0.86±0.08 0.42±0.04①0.82±0.08②111.000 0.000 MMP-9 0.78±0.06 0.30±0.03①0.70±0.06②220.444 0.000 p-JAK2 0.80±0.07 0.42±0.04①0.79±0.07②111.079 0.000

2.4 3組EC9706細(xì)胞遷移數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)的比較

對(duì)照組、400 mg/L 銀杏葉提取物組及銀杏葉提取物+ IL-6 組EC9706 細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，400 mg/L 銀杏葉提取物組EC9706 細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)較對(duì)照組減少（t=19.004 和15.264，均P=0.000），銀杏葉提取物+ IL-6 組EC9706 細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)較400 mg/L 銀杏葉提取物組增多（t=18.264 和10.619，均P=0.000）。見(jiàn)表3和圖5。

表3 3組EC9706細(xì)胞遷移數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)的比較（個(gè)，±s）

表3 3組EC9706細(xì)胞遷移數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)的比較（個(gè)，±s）

組別對(duì)照組400 mg/L銀杏葉提取物組銀杏葉提取物+IL-6組F 值P 值細(xì)胞遷移數(shù)152.22±13.15 61.02±5.86 141.06±11.23 200.428 0.000細(xì)胞侵襲數(shù)112.43±10.08 56.49±4.39 96.06±9.14 109.255 0.000

圖5 3組EC9706細(xì)胞的遷移和侵襲 （倒置顯微鏡×200）

3 討論

中醫(yī)藥在防治食管癌術(shù)后的并發(fā)癥、減輕放化療的毒副作用等方面起重要作用，能延長(zhǎng)患者的生存期、提高患者的生活質(zhì)量，提高患者的綜合治療效果[14-16]。有研究[17]報(bào)道銀杏葉提取物能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力，還能通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白p53、Bcl-2、Bax 的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。銀杏葉提取物還可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制甲狀腺癌TPC-1 細(xì)胞株的增殖[18]。銀杏葉提取物可抑制小鼠黑素瘤B16 細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。銀杏葉提取物可能通過(guò)抑制蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases, p38 MAPK）通路下調(diào)熱休克蛋白27（heat-shock protein 27, HSP27）的表達(dá)，從而降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 和H441 的遷移能力[20]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度銀杏葉提取物組食管癌細(xì)胞EC9706 與對(duì)照組比較，Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)降低，Cleavedcaspase-3 蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞遷移數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)降低。表明銀杏葉提取物可抑制食管癌細(xì)胞EC9706 增殖、侵襲、遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

JAK/STAT3 信號(hào)通路是細(xì)胞信號(hào)通路中重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖有關(guān)鍵作用，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[21]。有研究[22]表明中醫(yī)藥可通過(guò)調(diào)節(jié)JAK/STAT3 信號(hào)通路影響腫瘤的進(jìn)展，如姜黃素可以通過(guò)抑制JAK/STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)骨巨細(xì)胞瘤的凋亡，抑制其遷移、侵襲。竹節(jié)香附素通過(guò)抑制JAK/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[23]。黃芪多糖可能通過(guò)沉默JAK2/STAT3/c-myc 信號(hào)通路抑制口腔鱗癌細(xì)胞SCC-25 移植瘤的生長(zhǎng)[24]。本研究結(jié)果顯示，銀杏葉提取物處理的食管癌細(xì)胞EC9706 中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)降低，這提示銀杏葉提取物可抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路的激活。有研究[25]表明IL-6可激活JAK/STAT3 信號(hào)通路，因此本研究用IL-6 和銀杏葉提取物同時(shí)作用食管癌細(xì)胞EC9706，研究激活JAK/STAT3 信號(hào)通路是否影響銀杏葉提取物對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706 的作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)IL-6 處理后，EC9706 細(xì)胞活性升高，凋亡率降低，細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)增多，表明IL-6 可以逆轉(zhuǎn)銀杏葉提取物對(duì)EC9706 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。經(jīng)過(guò)IL-6 處理后，細(xì)胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)均升高，Cleaved-caspase-3、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)均降低，表明IL-6 可通過(guò)激活JAK2/STAT3 信號(hào)通路作用于食管癌細(xì)胞EC9706。

綜上所述，銀杏葉提取物可能通過(guò)阻斷JAK2/STAT3 信號(hào)通路抑制食管癌細(xì)胞EC9706 增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。