繆婷婷，沈風(fēng)飛，張曉曉，邱胡林，徐 波，尹愛國*，石鵬君1，*

（1 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 南昌 330045 2 廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 廣東茂名 525000 3 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 北京 100193）

乳酸菌是一類在自然界中廣泛存在的革蘭氏陽性菌，能夠在生物氧化的過程中獲得能量并生長繁殖。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，最適生長溫度在30～35 ℃，最適pH 值為6.5 左右，是一類兼性異養(yǎng)，兼性厭氧的同型發(fā)酵乳酸菌[1]。植物乳桿菌作為安全的食品發(fā)酵劑，在改善食品風(fēng)味和發(fā)酵特性等方面被廣泛應(yīng)用[2]。其在葡萄酒釀造業(yè)中也發(fā)揮著重要作用。植物乳桿菌是葡萄酒進行蘋果酸乳酸發(fā)酵常見的乳酸菌之一[3]，可在葡萄酒高酒精、低、高溫等苛刻條件下生長[4]，并且其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶對葡萄酒的風(fēng)味有著非常重要的影響[5]，對于葡萄酒的增香具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。

β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，EC3.2.1.21），是一種能夠水解糖苷鍵，從而產(chǎn)生揮發(fā)性香氣物質(zhì)和葡萄糖的糖苷水解酶（glycohydrolase enzyme，GH enzyme）[7]，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能水解結(jié)合于非還原性末端的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D 葡萄糖和相應(yīng)的配基，是纖維素分解酶系中的重要組成成分[8]。另外，還有一類6-磷酸-β-葡萄糖苷酶（6-phospho-β-glucosidase，EC 3.2.1.86）[9]在微生物中基本以胞內(nèi)酶的形式存在，可催化6-磷酸-纖維二糖、6-磷酸-纖維素寡糖等6-磷酸-β-葡萄糖苷類化合物產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸，使纖維素得以分解[10-11]。

6-磷酸-β-葡萄糖苷酶有兩類，分別分布于GH1 和GH4 中。GH1 家族作用殘基多為兩個谷氨酸殘基，靠近N 端的谷氨酸起酸/堿作用，另一谷氨酸起親核試劑的作用[12]。這兩類酶的主要區(qū)別是GH4 的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶催化底物分解時需要金屬離子（Mn2+，Ni2+，Co2+或Fe2+）和NAD+的輔助，而GH1 的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶則可獨立完成催化作用[11，13]。目前關(guān)于β-葡萄糖苷酶的研究很多，而有關(guān)6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的報道很少，鮮見有關(guān)植物乳桿菌來源的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶，原因之一可能是其在異源表達時容易形成包涵體或需要磷酸化底物[14]。牛瑜[15]、尹捷等[16]和劉晴等[17]以pNPβG6P（p-Nitrophenyl-β-D-Glucuronide-6-phospho，對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸）為底物，測定6-磷酸-β-葡萄糖苷酶酶活。

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中的比對信息得到植物乳桿菌WU14 中有8 個6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因。本研究 對8 個基 因BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14和BglHW14 進行基因克隆和異源表達，并對其對應(yīng)的編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

植物乳桿菌（L.plantarum）WU14 篩自腌菜，大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α 克隆菌株、E.coli BL21（DE3）表達菌株購自博邁德生物公司，表達載體pET30a（+）為本實驗室保存。

1.2 工具酶和試劑

限制性內(nèi)切酶Hind III、Nde I，Thermo Scientific 公司；Exnase Ⅱ連接酶，Vazyme 公司；KOD Plus Neo 高保真酶，株式會社東洋紡公司；DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和清潔回收試劑盒，康寧生命科學(xué)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，Solarbio 公司；普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，TIANGEN 公司；鎳柱填料，QIAGEN 公司；TGA Stain-Free Fast Cast Acrylamide Kit 12%，BIO-RAD 公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純，購自北京化學(xué)試劑公司。

1.3 試驗儀器

DK-8D 三孔電熱恒溫水槽，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PCR 儀，Bio-rad 公司；紫外分光光度計，菲勒儀器有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，貝普斯科技有限公司；臺式高速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；pH 計，METTLER TOLEDO 公司；電子天平，上海天美天平儀器有限公司；膠片觀察燈，北京六一儀器廠；電泳儀，北京東方瑞利電泳設(shè)備有限公司；磁力攪拌器，Kylin-bell 實驗儀器公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；脫色搖床，Kylin-bell 實驗儀器公司；潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.4 培養(yǎng)基和相關(guān)溶液

1）LB 培養(yǎng)基 5 g/L 酵母提取物，10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L NaCl，（固體培養(yǎng)基含20 g/L 瓊脂），121 ℃滅菌20 min。

2）MRS 液體培養(yǎng)基 蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，K2HPO42.0 g，檸檬酸銨2.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 mL，MgSO4·7H2O 0.50 g，MnSO4·2H2O 0.25 g，調(diào)節(jié)pH 值為7.0，加入蒸餾水補至1 L。

3）10×SDS-PAGE 緩沖液 188 g 甘氨酸，10 g SDS，30.3 g Tris 堿，蒸餾水900 mL 25 ℃水浴攪拌溶解，定容至1 L，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

4）考馬斯亮藍(lán)R250 染色液 0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 考馬斯亮藍(lán)R250，10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 冰醋酸，25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）異丙醇，蒸餾水定容1 L，過濾去除雜質(zhì)，室溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

5）卡那霉素 配制母液50 mg/mL，濾器過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6）NTA 緩沖液 20 mol/L Tris-Hcl 緩沖液，0.5 mol/L NaCl，20～300 mmol/L 咪唑，每個梯度調(diào)pH 7.4。

7）IPTG 配制母液24 mg/mL，濾器過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8）50×TAE Buffer Tris 242 g，Na2EDTA·2H2O 37.2 g，冰乙酸57.1 mL，蒸餾水定容至1 L，調(diào)pH 8.5，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 方法

1.5.1 菌種活化 從-80 ℃冰箱中取出保藏菌株植物乳桿菌WU14 在MRS 固體平板上劃線，挑取單菌落接種到4 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，后按1%接種量接種至100 mL MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。

1.5.2 基因組DNA 提取及濃度純度檢測 使用購自Solarbio 公司的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，提取植物乳桿菌WU14 總基因組，操作步驟按照試劑盒說明書進行，提取的基因組DNA 用超微量蛋白核酸分析儀檢測，確定提取的DNA 的濃度和純度是否合格，將合格的基因組DNA 置于-20 ℃冰箱保存。

1.5.3 目的基因的PCR 擴增 引物是由華大基因公司合成，PCR 擴增特異引物序列依次為：

表1 基因擴增引物Table 1 The primers used for gene cloning

PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：KOD buffer 5 μL、dNTP 5 μL、MgSO43 μL、WU14 基因組1 μL、引物各1.5 μL、KOD 酶1 μL，加ddH2O 至50 μL。

PCR 擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min、98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min 30 s，35 個循環(huán)，最后4 ℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR 擴增產(chǎn)物，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)留圖分析。

1.5.4 pET30a（+）空載體雙酶切 使用下列快切酶體系（50 μL）對pET30a（+）空載體進行雙酶切37 ℃金屬浴4 h，并使用PCR 清潔試劑盒回收酶切產(chǎn)物，測好濃度，保存在-20 ℃冰箱中備用。

酶切體系：

pET30a（+） 20 μL

Hind III 限制性內(nèi)切酶 1.5 μL

NdeⅠ限制性內(nèi)切酶 1.5 μL

FD buffer 5 μL

ddH2O 22 μL

總體積 50 μL

1.5.5 無縫連接目的片段與酶切載體 使用購自康寧生命科學(xué)有限公司的DNA 凝膠回收試劑盒回收目的基因，然后使用pET30a（+）載體系統(tǒng)，按照下列無縫連接體系（10 μL），37 ℃連接45 min。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化參照大腸桿菌DH5α 感受態(tài)的轉(zhuǎn)化方法進行。

Exnase Ⅱ連接酶 1 μL

pET30a（+） 1 μL

目的基因回收片段 1 μL

ddH2O 5 μL

buffer 2 μL

總體積 10 μL

1.5.6 重組質(zhì)粒的提取及轉(zhuǎn)化 用含有Kana（K+） 抗生素的LB 培養(yǎng)基活化已驗證正確的含有重組克隆載體的大腸桿菌DH5α 感受態(tài)菌株，37 ℃振蕩培養(yǎng)6～8 h，取1～4 mL 的菌液用于提取重組質(zhì)粒，質(zhì)粒的提取參照康寧生命科學(xué)有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒的提取方法。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化參照大腸桿菌BL21 感受態(tài)的轉(zhuǎn)化方法進行。

1.5.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化和檢測 將過夜培養(yǎng)的重組質(zhì)粒種子液按1%接種于200 mL LB（K+）液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.4～0.8，加入終濃度為0.6 mmol/L 的IPTG 37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h。收集誘導(dǎo)完成的發(fā)酵液菌體，利用超聲破碎儀將細(xì)胞破碎，收集破碎上清液和破碎沉淀，用鎳柱純化蛋白，并用不同濃度的咪唑洗脫純化蛋白，然后用SDS-PAGE 分析蛋白表達情況。

1.5.8 測序及生物信息學(xué)分析 將1%瓊脂糖凝膠電泳驗證正確的菌液送至華大基因公司測序。測序完成后，將得到的堿基序列翻譯為氨基酸序列，隨后進行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌WU14 全基因組的提取

利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取植物乳桿菌 WU14 全基因組DNA，提取的基因組DNA 用超微量蛋白核酸分析儀檢測，其質(zhì)量濃度在40 ng/μL，可用于后續(xù)試驗，同時用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，提取結(jié)果如圖1所示。

圖1 植物乳桿菌WU14 基因組的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis of L.plantarum WU14 genome

2.2 克隆8 個β-葡萄糖苷酶編碼基因

通過基因組測序結(jié)果分析，經(jīng)CAZy 數(shù)據(jù)庫（http：//www.cazy.org/）注釋分析發(fā)現(xiàn)基因組上具有8 個GH1 家族6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因。利用植物乳桿菌WU14 基因組為模板，以目的基因的特異性引物為擴增引物進行PCR 擴增，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果如圖2所示，目的條帶大小為1 500 bp 左右，結(jié)果顯示擴增條帶大小正確，條帶單一濃度較高，可用于后續(xù)試驗。

圖2 BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14 和BglHW14 基因PCR 擴增凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14、BglHW14 gene PCR amplification

2.3 SDS-PAGE 分析重組蛋白

利用生物信息學(xué)軟件SnapGene 分析目的基因序列，8 個基因的理論蛋白大小均為55 ku 左右。8 個蛋白結(jié)果如圖3到圖6所示，以未加IPTG 誘導(dǎo)的菌液作為對照組，可以看出8 個蛋白都誘導(dǎo)表達成功，蛋白BglAW14、BglCW14 和BglFW14 的破碎上清液表達條帶明顯且與誘導(dǎo)成功的條帶一致，都在55 ku 左右，其余的5 個蛋白的菌體破碎上清未檢測到表達蛋白，而菌體破碎沉淀都有大量表達，故5 個蛋白都為包涵體表達。蛋白BglAW14、BglCW14 和BglFW14 為部分可溶性表達。

圖3 SDS-PAGE 分析Fnr 蛋白Fig.3 SDS-PAGE analysis of Fnr protein

圖4 SDS-PAGE 分析BglDW14 和BglEW14 蛋白Fig.4 SDS-PAGE analysis of BglDW14 and BglEW14 protein

圖5 SDS-PAGE 分析BglDW14 和BglEW14 蛋白Fig.5 SDS-PAGE analysis of BglFW14 and BglGW14 protein

圖6 SDS-PAGE 分析BglHW14 和BglAW14 蛋白Fig.6 SDS-PAGE analysis of BglHW14 and BglAW14 protein

純化蛋白BglAW14、BglCW14 和BglFW14 的SDS-PAGE 結(jié)果如圖7所示，3 個蛋白用不同濃度的咪唑溶液洗脫后，得到的純化蛋白的條帶與對應(yīng)的已誘導(dǎo)的菌體破碎液上清條帶一致，表達量高且條帶單一，用pNPG 法處理樣品10 min 沒有檢測到β-葡萄糖苷酶酶活。劉晴等[16]研究的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶TteBg1B 具有較強的底物特異性，對β-D-葡萄糖苷鍵和β-D-半乳糖苷鍵僅有微弱的水解作用。尹捷等[15]研究的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶PbgL 具有底物專一性，對pNP 衍生物中的α-半乳糖苷鍵，6-磷酸-α-葡萄糖苷鍵，6-磷酸-α-半乳糖苷鍵及6-磷酸-α-甘露糖苷鍵均無水解作用，本研究中的這3 個純化酶與已報道的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶具有特異降解6-磷酸底物，而不能水解pNPG 的酶學(xué)特性相一致。

圖7 SDS-PAGE 分析BglAW14、BglCW14和BglFW14 純化蛋白Fig.7 SDS-PAGE analysis of BglAW14，BglCW14 and BglFW14 purified protein

2.4 目的基因BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14 和Bgl-HW14 的生物信息學(xué)分析

2.4.1 氨基酸序列分析、跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測用NCBI 比對氨基酸序列，結(jié)果如表2所示，8 個基因與對應(yīng)的蛋白注釋的一致性在100%。在線（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測8 個基因編碼蛋白的氨基酸長度、分子質(zhì)量和等電點如下表3所示。蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)能分析蛋白質(zhì)的定位，為后續(xù)的表達、純化有著重要影響，利用TMHMM 2.0 對8 個基因進行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如下表2所示，8 個蛋白均沒有跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測結(jié)果均為可溶性蛋白。信號肽能夠引導(dǎo)新合成的蛋白向分泌通路轉(zhuǎn)移，預(yù)測蛋白類型，利用SignalP4.0 對8 個基因進行信號肽預(yù)測，預(yù)測結(jié)果如下表2所示，8 個蛋白均沒有信號肽，預(yù)測結(jié)果均為非分泌蛋白。

表2 植物乳桿菌的GH1 家族葡萄糖苷酶的基因注釋和一致性分析Table 2 Gene annotation and consistency analysis of GH1 family glucosidase from L.plantarum

表3 氨基酸序列分析、跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測Table 3 Amino acid sequence analysis，transmembrane structure and signal peptide prediction

2.4.2 氨基酸序列比對分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析將8 個蛋白的氨基酸序列進行序列比對，結(jié)果如圖8所示，8 個序列都具有GH1 家族葡萄糖苷酶的兩個典型的谷氨酸（E）催化位點。N 端序列差異明顯，C 端序列具有較高的一致性。同時對8 個蛋白序列用MEGA 5 軟件的NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖9所示，8 個蛋白序列的一致性在32%～74%之間。從進化樹分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8 個蛋白形成3 個進化簇，其中BglBW14 和BglDW14 氨基酸一致性最高為74%，其次BglFW14、BglHW14和BglGW14 相互之間的一致性在66%以上。其它蛋白氨基酸一致性均在60%以下，尤其BglAW14與其它7 個蛋白氨基酸一致性在40%以下。

圖8 氨基酸序列比對結(jié)果Fig.8 Amino acid sequence alignment results

圖9 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree

2.4.3 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)的多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，主要包括α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，在線（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl）預(yù)測BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14 和BglHW14 的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如下表4所示，8 個蛋白均有最大占比的α-螺旋，中等占比的延伸鏈，大占比的無規(guī)則卷曲以及小占比的β-轉(zhuǎn)角。

表4 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Table 4 Protein secondary structure prediction

2.4.4 亞細(xì)胞定位 亞細(xì)胞定位能預(yù)測蛋白在細(xì)胞內(nèi)的位置，對于研究蛋白具有重要意義，在線（http：//www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs&subgroup=gfindb） 預(yù)測BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14 和BglHW14 編碼蛋白在細(xì)胞內(nèi)的位置如下表5所示，BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglFW14 和BglGW14 的預(yù)測結(jié)果顯示其位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，BglEW14 的預(yù)測結(jié)果顯示其位于分泌內(nèi)，BglHW14 的預(yù)測結(jié)果顯示其位于細(xì)胞膜。其中BglCW14 和BglFW14 在周質(zhì)空間內(nèi)有較多的占比，BglCW14 和BglFW14 具有部分可溶性可能與此相關(guān)。

表5 亞細(xì)胞定位Table 5 Subcellular localization

3 結(jié)論

1）本研究成功克隆到8 個來自植物乳桿菌WU14 的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶編碼基因。經(jīng)SDS-PAGE 驗證可知8 個酶蛋白在大腸桿菌中異源表達成功，但只有3 個蛋白BglAW14、BglCW14和BglFW14 為部分可溶性表達，其余5 個酶蛋白為包涵體。

2）對8 個基因的編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示：8 個基因都屬于GH1 家族，編碼6-磷酸-β-葡萄糖苷酶。編碼氨基酸具有GH1 家族6-磷酸-β-葡萄糖苷酶保守的兩個催化區(qū)域（NEP 和ENG）。編碼蛋白都無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)、疏水性較強。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)預(yù)測可知，除了BglEW14 主要存在于分泌結(jié)構(gòu)內(nèi)和BglHW14 主要存在于細(xì)胞膜，其余的6 個基因都存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

3）研究表明BglAW14、BglCW14 和BglFW14在大腸桿菌中異源表達為可溶性蛋白，并純化獲得了單一目的條帶，但上述3 個可溶性蛋白以pNPG 為底物未檢測到β-葡萄糖苷酶活性，這與6-磷酸-β-葡萄糖苷酶具有特異降解6-磷酸底物，而不能高效水解pNPG 的酶學(xué)特性相一致。