鄭雅君，李美秀，姜澤東，2，3，4，朱艷冰，2，3，4，倪 輝，2，3，4，5，鄭明靜，2，3，4，5*

（1 集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院 福建廈門(mén) 361021 2 福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門(mén) 361021 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 大連工業(yè)大學(xué) 遼寧大連 116034 4 廈門(mén)市食品與生物工程技術(shù)研究中心 福建廈門(mén) 361021 5 水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 福建廈門(mén) 361021）

炎癥反應(yīng)（Inflammatory response）是由病原體入侵、細(xì)胞損傷或者有毒化合物引起免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一種防御性反應(yīng)。過(guò)度或慢性的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致機(jī)體心臟、肝臟、腦、腸道等組織損失或疾病，如感染性心內(nèi)膜炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸?。肆_恩病和潰瘍性結(jié)腸炎）[1]。炎癥影響多種疾病的發(fā)病機(jī)制涉及常見(jiàn)的炎癥介質(zhì)和調(diào)節(jié)通路。微生物產(chǎn)物和細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α），與機(jī)體TLRs 受體、TNF 受體相互作用介導(dǎo)炎癥；受體激活觸發(fā)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、核因子-κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）和Janus 激酶（Janus kinase，JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（activator of transcription，STAT）通路[1-2]。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS） 是典型的炎癥刺激劑，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分及Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的配體，能夠無(wú)限度地啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)，導(dǎo)致器官衰竭甚至死亡[3]。在LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型中，巨噬細(xì)胞通過(guò)其細(xì)胞膜表面表達(dá)的TLR4 等模式識(shí)別細(xì)菌LPS 等病原，引起刺激性信號(hào)傳導(dǎo)，激活MAPK 等信號(hào)通路，進(jìn)而引發(fā)炎癥性疾病[4-5]。近年來(lái)，在膳食預(yù)防和輔助治療炎癥反應(yīng)的研究方面，殼寡糖、褐藻膠寡糖、巖藻聚糖寡糖等海洋活性寡糖在抗炎方面有著很好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

我國(guó)的海藻資源豐富，2019年我國(guó)海藻產(chǎn)量255.6 萬(wàn)t，其中福建省海藻產(chǎn)量為118.9 萬(wàn)t，占比達(dá)46.51%，居全國(guó)首位（數(shù)據(jù)來(lái)源：中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒）[6]。多糖（如卡拉膠、瓊膠、巖藻聚糖等）是海藻的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)和膳食營(yíng)養(yǎng)元素之一，經(jīng)降解后低分子質(zhì)量多糖或寡糖會(huì)保留原有的活性或產(chǎn)生新的活性，同時(shí)更易于被機(jī)體吸收，提高生物利用度[7]。瓊膠是由海洋紅藻中提取的多糖，是目前世界上用途較廣泛的海藻膠之一。瓊膠寡糖是由瓊膠降解得到的一種低聚合度寡糖分子。目前，關(guān)于瓊膠寡糖的生物活性研究集中于其益生元效應(yīng)和調(diào)控腸道菌群[8-10]、調(diào)節(jié)血糖[11]、抗氧化[12-13]等作用，而關(guān)于瓊膠寡糖的抗炎作用及機(jī)制[14-15]鮮有報(bào)道。本研究采用LPS 誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 建立炎癥反應(yīng)模型，探討瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎癥反應(yīng)的影響，為瓊脂寡糖作為功能性食品的開(kāi)發(fā)及其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸法制備的瓊膠寡糖（平均分子質(zhì)量1～3 ku） 青島博智匯力生物科技有限公司；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（National Collection of Authenticated Cell cultures）；胎牛血清，美國(guó)Gibco 公司；雙抗（鏈、青霉素），西格瑪奧德里奇（上海）有限公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone 公司；四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磺胺酸、N-1-（萘基）乙二胺二鹽酸鹽、冰醋酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；capture antibody（MM350C）、conjugater antibody（MM350DB），美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；細(xì)胞裂解液和BCA 試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒，碧云天生物科技公司。

1.2 設(shè)備與儀器

HERAcell VIOS 160I CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司；Avanti J26XP 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)貝克曼公司；BioTek Cytation-5 酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；Nikon TS100 倒置顯微鏡、Nikon 50i 熒光顯微鏡，日本尼康（Nikon）公司；AI600 凝膠成像儀，美國(guó)通用電氣公司（General Electric）。

1.3 方法

1.3.1 紅外光譜測(cè)試 將瓊膠寡糖粉末烘干，取5 mg 瓊膠寡糖樣品與溴化鉀按1∶100 比例混合均勻，充分研磨后壓片，后采用is50 FT-IR 型紅外光譜儀檢測(cè)樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)，掃描的波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.2 核磁共振測(cè)試 按照陳巖君[16]報(bào)道的方法進(jìn)行優(yōu)化，稱(chēng)取凍干的樣品10 mg，溶于1 mL D2O中，凍干并重復(fù)3 次使樣品中的氫完全被氘置換；最后用500 μL D2O 溶解，轉(zhuǎn)移至核磁管中進(jìn)行檢測(cè)。磁場(chǎng)頻率為500 MHz。

1.3.3 瓊膠寡糖分子質(zhì)量的測(cè)定 精確稱(chēng)取瓊膠寡糖5 mg，溶于1 mL 超純水中，充分混勻后，使用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，再利用配備有TSK gel G2500 PWXL 柱（7.8 mm I.D.×30 cm）和ELSD-LT Ⅱ蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的高效液相色譜系統(tǒng)來(lái)測(cè)定寡糖的分子質(zhì)量[17]。以葡萄糖（Mw：180.16）、昆布二糖（laminaribiose，Mw：342.3）、昆布四糖（laminaritetraose，Mw：666.58）、昆布五糖（laminaripentaose，Mw：828.72）、葡聚糖1.0×103u 和5.0×103u 作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活力分析 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 采用含有10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至75%左右時(shí)，移除舊培養(yǎng)基，用1×PBS 清洗2 次后加入新培養(yǎng)基，并用刮刀將貼壁細(xì)胞刮下，吹打均勻，按1∶2 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

采用MTT 法來(lái)測(cè)定瓊膠寡糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性的影響[17]。將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的RAW264.7 細(xì)胞以3×104細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至85%后，用100 μL 含有不同濃度的瓊膠寡糖的培養(yǎng)基（0，7.8125，15.625，31.25，62.5，125 和250 μg/mL）處理細(xì)胞24 h。孵育結(jié)束后除去上清，每孔加入50 μL 的MTT 溶液，繼續(xù)孵育30 min。移除上清，每孔用1×PBS 清洗2 次 后加 入100 μL DMSO，振蕩20 min 至甲瓚完全溶解，用CytationTM5 細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)570 nm 處吸光值（OD570）。為探究瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞損傷的抑制作用，以不同濃度的LPS 處理RAW264.7 細(xì)胞構(gòu)建炎癥模型，最終確定以10 ng/mL LPS 作為誘導(dǎo)條件。試驗(yàn)在使用LPS（終質(zhì)量濃度為10 ng/mL）誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞前，用含有瓊膠寡糖的培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞24 h（試驗(yàn)組）。以只用生長(zhǎng)培養(yǎng)基處理的細(xì)胞為空白組（Blank）；對(duì)照組為用生長(zhǎng)培養(yǎng)基預(yù)處理，再用LPS 進(jìn)行誘導(dǎo)12 h 的細(xì)胞。采用相同的方法進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定，并根據(jù)公式1 計(jì)算細(xì)胞活力。

式中：A1——試驗(yàn)組或?qū)φ战M在570 nm 處的吸光值；A2——空白組在570 nm 處的吸光值；T1——同體積DMSO 在570 nm 處的吸光值。

1.3.5 RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)一氧化氮（Nitric oxide，NO）的產(chǎn)生測(cè)定 采用Griess 法[17]測(cè)定RAW264.7細(xì)胞釋放NO。參照1.3.4 節(jié)方法將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，分別向貼壁的RAW264.7 細(xì)胞中加入100 μL 含瓊膠寡糖（終質(zhì)量濃度分別為7.8125，15.625，31.25，62.5，125 和250 μg/mL）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，空白組和對(duì)照組加入100 μL 生長(zhǎng)培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，移除培養(yǎng)基，再向寡糖處理組和對(duì)照組加入LPS 處理12 h。每孔取出50 μL 培養(yǎng)上清液置于新的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，之后向上清液中加入100 μL 的Griess 試劑（含3 mol/L 磺胺酸，30 mg/L N-1-（萘基）乙二胺二鹽酸鹽，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%冰醋酸），室溫避光孵育20 min，檢測(cè)540 nm 下的吸光值（OD540）。同時(shí)，用不同濃度的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算培養(yǎng)上清液中NO 濃度。

1.3.6 RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子（tumor

necrosis factor-α，TNF-α） 的含量測(cè)定 采用ELISA 法測(cè)定RAW264.7 細(xì)胞分泌的TNF-α。一抗capture antibody（MM350C）稀釋1 000 倍，按照100 μL/孔將其加入ELISA 板，置于4 ℃冰箱反應(yīng)12 h 后洗板5 次。繼續(xù)加入4%牛血清蛋白的PBS進(jìn)行蛋白包被，室溫反應(yīng)2 h 后振蕩洗板5 次。然后將樣品稀釋50 倍，按100 μL/孔加入ELISA 板中，室溫反應(yīng)2 h，振蕩洗板5 次。之后加入相同體積稀釋1 000 倍后的二抗conjugater antibody（MM350DB），室溫反應(yīng)2 h，振蕩洗板5 次。接著加入100 μL 稀釋1 000 倍的三抗avidin-HRP，室溫反應(yīng)30 min 后洗板，加入100 μL 顯色劑反應(yīng)30 min。最后加入終止液終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定吸光值。

1.3.7 RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生測(cè)定 通過(guò)二氯熒光乙酰乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針測(cè)定RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS 含量[18]。參照1.3.4 節(jié)方法將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，按1.3.5 節(jié)中的方法處理細(xì)胞后，移除各孔中的培養(yǎng)基，加入100 μL 含有10 μmol/L DCFH-DA 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結(jié)束后，移去各孔中的培養(yǎng)基，用1×PBS 洗滌3 次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA 探針，然后加入100 μL 生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm 的條件下用細(xì)胞成像多模式檢測(cè)儀檢測(cè)各孔的熒光強(qiáng)度，根據(jù)公式2 計(jì)算相對(duì)ROS 水平，并用Nikon 50i 熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。

式中：B1——試驗(yàn)組或?qū)φ战M的熒光強(qiáng)度；B2——空白組的熒光強(qiáng)度。

1.3.8 Western blotting 分析MAPK 信號(hào)通路中的目的蛋白[19]將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞按照4×106cell/mL 的濃度接種到內(nèi)徑為3.5 cm 的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿加入2 mL 細(xì)胞懸液。按1.3.5 節(jié)中的方法處理各組細(xì)胞，孵育結(jié)束后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法步驟提取胞漿蛋白，置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用BCA Protein Assay Kit 測(cè)定蛋白質(zhì)含量，牛血清蛋白BSA 為標(biāo)準(zhǔn)品。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法步驟測(cè)定所提取的胞漿蛋白溶液的蛋白濃度。

SDS-PAGE 電泳：配制厚度為1 mm 的10%凝膠。樣品細(xì)胞裂解液稀釋至同一蛋白濃度后按照4∶1 的比例與Loading Buffer 充分混勻。沸水浴5 min 后，冷卻至室溫，按照每孔28 μg 蛋白加樣。加樣結(jié)束后，先將電壓調(diào)至80 V 進(jìn)行電泳。當(dāng)樣品電泳至分離膠與濃縮膠交界處，將電壓調(diào)節(jié)為120 V 至電泳結(jié)束。轉(zhuǎn)膜：將膠從電泳槽中取出，裁剪與膠大小相同的PVDF 膜，按照正確的順序?qū)⒛z和膜放置轉(zhuǎn)膜器中，定電流250 mA，轉(zhuǎn)膜150 min。免疫印跡：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF 膜，置于封閉液中封閉1 h，封閉結(jié)束后，用TBST 振蕩清洗3 次，每次10 min。孵育一抗（p44/42 p-p44/42 MAPK Rabbit mAb、p-p38 p38 MAPK Rabbit mAb 和JNK p-JNK MAPK Rabbit mAb） 放置4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。孵育結(jié)束后清洗3 次，再于室溫孵育二抗Anti-rabbit IgG（HRP-linked Antibody）1 h。顯影：二抗孵育結(jié)束后，清洗3 次。將配置好的顯影液均勻地涂抹在PVDF 膜上，室溫避光孵育2 min，放置于凝膠成像儀中進(jìn)行目的蛋白顯影。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

設(shè)置3 個(gè)平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Graphpad prism 5軟件分析處理后繪圖，利用SPSS 19.0 軟件單因素方差分析檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊膠寡糖的分子結(jié)構(gòu)鑒定

圖1為瓊膠寡糖的紅外光譜圖。與現(xiàn)有報(bào)道類(lèi)似，瓊膠的分子結(jié)構(gòu)特征主要由（l→3）-β-D-半乳糖和（1→4）-3，6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖交替連接構(gòu)成，由瓊膠降解制備的寡糖樣品在3 416，2 916，2 900，1 639，1 376，1 154，1 074，933 cm-1波長(zhǎng)處出現(xiàn)典型的特征吸收峰[20]。3 416 cm-1處的吸收寬峰為瓊膠寡糖-OH 的伸縮振動(dòng)峰，2 916 和2 900 cm-1為糖環(huán)的-CH2的伸縮振動(dòng)峰。1 639 cm-1處的振動(dòng)峰由糖環(huán)的-C-C-的伸縮振動(dòng)引起，933 cm-1和1 074 cm-1處吸收峰則為C-O 鍵的伸縮振動(dòng)峰，表明瓊膠寡糖含有3，6-內(nèi)醚半乳糖糖環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖1 瓊膠寡糖的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of agaro-oligosaccharide

圖2為瓊脂寡糖的核磁共振氫譜，1H NMR（500 MHz，D2O） δ 5.04（s，1H），4.90（d，J=6.3 Hz，1H），4.50（d，J=47.4 Hz，5H），4.29（s，1H），4.13（d，J=10.3 Hz，1H），4.03（s，2H），3.92（d，J=10.6 Hz，1H），3.82（s，1H），3.66（ddd，J=11.4，7.2，3.0 Hz，6H），3.56～3.46（m，3H），3.38（d，J=9.4 Hz，1H），3.31（s，1H）。圖3為瓊膠寡糖的核磁共振碳譜，13C NMR（126 MHz，D2O） δ 101.98（d，J=30.6 Hz），97.96（s），89.83（s），81.69（s），79.56（s），76.87（s），75.44～74.71（m），73.02（s），72.58（s），70.46（s），69.71（s），69.23（s），68.89（s），68.57（s），68.24（s），60.92（s）。氫譜中δ 5.04（s，1H）與4.50（d，J=47.4 Hz，5H）表明瓊膠寡糖含有端基3，6 內(nèi)醚-α-L-半乳糖的H1與端基β-D-半乳糖的分子結(jié)構(gòu)，以及碳譜中δ 97.00 出現(xiàn)信號(hào)位移而δ 93.00 和δ 90.72沒(méi)有出現(xiàn)信號(hào)峰，表明所制備的瓊膠寡糖具有β構(gòu)型半乳糖殘基而無(wú)α構(gòu)型半乳糖殘基。因此，推測(cè)該瓊膠寡糖主要由β-D-半乳糖和3，6 內(nèi)醚-α-L－半乳糖殘基構(gòu)成，符合酸法降解產(chǎn)生的寡糖產(chǎn)物的特征結(jié)構(gòu)[20-22]。

圖2 瓊膠寡糖的核磁共振氫譜圖Fig.2 1H NMR spectrum of agaro-oligosaccharide

圖3 瓊膠寡糖的核磁共振碳譜圖Fig.3 Nuclear magnetic resonance carbon spectrum of agar-oligosaccharides

圖4為瓊膠寡糖的高效液相色譜圖，本試驗(yàn)利用配備有TSK gel G2500 PWXL 柱（7.8 mm I.D.×30 cm） 和ELSD-LT Ⅱ蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的高效液相色譜來(lái)測(cè)定寡糖的分子質(zhì)量，以葡萄糖（Mw：180.16）、昆布二糖（Mw：342.3）、昆布四糖（Mw：666.58）、昆布五糖（Mw：828.72）、葡聚糖1.0×103u 和5.0×103u 作為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量（Mw）為縱坐標(biāo)繪制分子質(zhì)量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算樣品分子質(zhì)量分布情況，結(jié)果表明瓊膠寡糖的分子質(zhì)量范圍為1 065.5～1 308.2 u，根據(jù)上述結(jié)果推測(cè)其含有兩種聚合度的寡糖，為四糖和五糖。

圖4 瓊膠寡糖的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC of agar-oligosaccharides

2.2 瓊膠寡糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響

采用MTT 法分析瓊膠寡糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖5a 所示。在瓊膠寡糖質(zhì)量濃度為0～250 μg/mL 范圍內(nèi)，各組RAW264.7細(xì)胞活力均高于90%，與對(duì)照組（0 μg/mL 瓊膠寡糖）相比，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，瓊膠寡糖在測(cè)試質(zhì)量濃度（0～250 μg/mL） 范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7 的細(xì)胞活力無(wú)顯著影響。進(jìn)一步構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型如圖5b，使用不同濃度的LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞，當(dāng)LPS 質(zhì)量濃度為2 ng/mL 時(shí)細(xì)胞活力開(kāi)始顯著降低，隨著濃度的增加而降低；LPS 質(zhì)量濃度為50 ng/mL 和250 ng/mL 時(shí)細(xì)胞半數(shù)死亡且兩者兩者之間沒(méi)有顯著性差異，故試驗(yàn)選取10 ng/mL 作為誘導(dǎo)條件建立模型。為研究瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用，本文在LPS 刺激細(xì)胞前使用不同劑量瓊膠寡糖進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果如圖5c 所示，與空白組相比，對(duì)照組LPS 刺激后RAW264.7 細(xì)胞活力顯著降低，這是因?yàn)長(zhǎng)PS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖具有抑制作用，其細(xì)胞周期被阻滯在S 期，隨后發(fā)生凋亡[23]。添加瓊膠寡糖干預(yù)處理后，LPS 刺激后RAW264.7 的細(xì)胞活力明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），并且與空白組細(xì)胞活力相當(dāng)。Wang 等[24]發(fā)現(xiàn)LPS 處理引起RAW264.7 細(xì)胞活力降低，添加硫酸多糖能夠提高LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞的活力和降低NO的產(chǎn)生，具有抗炎作用。與該研究一致，本研究表明瓊膠寡糖對(duì)LPS 刺激引起RAW264.7 細(xì)胞活力降低的現(xiàn)象具有改善作用，具有潛在的炎癥調(diào)節(jié)作用。

圖5 瓊膠寡糖對(duì)RAW264.7（a）和LPS 刺激RAW264.7（b）以及瓊膠寡糖干預(yù)（c）對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.5 Effect of agar-oligosaccharides on cell viability of RAW264.7（a） and LPS-treated RAW264.7（b）and agar-oligosaccharides intervention（c） respetively

2.3 瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO 水平的影響

一氧化氮（NO）是LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的過(guò)程中重要的炎癥介質(zhì)，隨著炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)，細(xì)胞產(chǎn)生的NO 量不斷增加[25]。試驗(yàn)采用Griess 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的NO 水平，如圖6所示，與空白組相比，10 ng/mL LPS 刺激后RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)NO水平顯著增加（P＜0.05），表明10 ng/mL LPS 能夠誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；瓊膠寡糖（7.8125～250 μg/mL） 干預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)NO 水平明顯低于對(duì)照組，且細(xì)胞內(nèi)NO 產(chǎn)生量隨著瓊膠寡糖樣品濃度的增加而呈下降趨勢(shì)（P＜0.05）。結(jié)果表明，瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中NO 的產(chǎn)生具有明顯的抑制作用且呈濃度依賴(lài)，并且結(jié)合瓊膠寡糖能夠提高LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞活力的結(jié)果，表明其對(duì)NO 的抑制作用并非由對(duì)細(xì)胞的毒性作用而產(chǎn)生，而是來(lái)源于自身的活性作用，具有抑制細(xì)胞炎癥的作用。研究報(bào)道，新瓊脂糖寡糖單體，特別是新瓊脂糖四糖可以顯著降低LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NO 的產(chǎn)生和釋放[15]。該新瓊脂四糖表現(xiàn)出高抗炎活性IC50值為250 μg/mL，顯著抑制了LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β 和IL-6 促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，通過(guò)抑制MAPK 和NF-κB 通路抑制LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。而Zou 等[5]報(bào)道瓊膠寡糖混合物[包括寡糖單體347.0953 m/z（C12H20NaO10；324 u+23 u；AO2+Na）、653.1910 m/z（C24H38NaO19；630 u+23 u；AO4+Na） 以及959.2848 m/z（C36H56NaO28；936 u+23 u；AO6+Na）]相比于寡糖單體具有更高的抗炎作用，其對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞NO 產(chǎn)生抑制的IC50值為12.5 μg/mL。而本研究中采用的分子質(zhì)量分布為1 065.5～1 308.2 u 瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO 的抑制IC50值則為125 μg/mL。由此可見(jiàn)，瓊膠寡糖對(duì)細(xì)胞炎癥的作用受到結(jié)構(gòu)、組分等多種因素的影響。

圖6 瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)NO 產(chǎn)生的影響Fig.6 Effect of agar-oligosaccharide on LPS-induced NO production in RAW264.7 cells

2.4 瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)TNF-α 含量的影響

腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α），能夠以自分泌的方式作用于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，與機(jī)體TLRs 受體、TNF 受體相互作用介導(dǎo)炎癥。圖7表明與空白組相比，10 ng/mL LPS誘導(dǎo)后RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)TNF-α 水平顯著增加（P＜0.05）；瓊膠寡糖（7.8125～250 μg/mL）干預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)TNF-α 水平明顯低于對(duì)照組，且隨著瓊膠寡糖樣品濃度的增加而呈下降趨勢(shì)（P＜0.05）。結(jié)果表明，瓊膠寡糖對(duì)炎癥因子TNF-α 具有抑制作用，表現(xiàn)出潛在的抗炎作用。

圖7 瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)TNF-α 含量的影響Fig.7 Effect of agar-oligosaccharide on LPS-induced TNF-α production in RAW264.7 cells

2.5 瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的影響

細(xì)胞內(nèi)ROS 過(guò)量產(chǎn)生與炎癥等病理狀態(tài)密切相關(guān)，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)促炎信號(hào)如MAPKs 起作用[26-27]。本文利用二氯熒光乙酰乙酸鹽（DCFHDA）探針通過(guò)細(xì)胞熒光強(qiáng)弱測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的高低。瓊膠寡糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響如圖8a 所示。RAW264.7 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度隨著瓊膠寡糖的濃度升高而減弱，當(dāng)寡糖濃度達(dá)到250 μg/mL 時(shí)RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平達(dá)到最低，熒光強(qiáng)度相當(dāng)于空白組水平?；跓晒鈴?qiáng)弱換算各組的ROS 水平，如圖8b 所示，與空白組相比，LPS 處理能夠誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高（P＜0.05），而經(jīng)不同濃度瓊膠寡糖預(yù)處理后，LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生被顯著抑制，并隨著寡糖濃度升高而降低（P＜0.05）。Zhou 等[28]研究發(fā)現(xiàn)GOS-OD（古羅糖醛酸寡糖）在0.1～2 mg/mL 的質(zhì)量濃度下可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中ROS 的過(guò)量產(chǎn)生，從而減緩細(xì)胞炎癥反應(yīng)。與上述研究一致，結(jié)果表明，瓊膠寡糖能夠有效降低LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程中ROS 的過(guò)量產(chǎn)生，從而減緩細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

圖8 瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響Fig.8 Effect of agar-oligosaccharides on LPS-induced intracellular ROS production in RAW264.7 cells

2.6 瓊膠寡糖通過(guò)激活MAPKs 信號(hào)通路抑制LPS 誘導(dǎo)炎癥發(fā)生

MAPKs 是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，主要包括ERK/JNK/SAPK、p38/RK 以及ERK/5BMK1 4 個(gè)MAPKs 亞族，其中通過(guò)ERK、JNK 和p38 介導(dǎo)的MAPKs 信號(hào)激活被認(rèn)為與炎癥介質(zhì)釋放、炎癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[29-31]。本試驗(yàn)利用瓊膠寡糖（250 μg/mL） 預(yù)處理巨噬細(xì)胞系RAW264.7，再加入LPS 刺激細(xì)胞，提取全蛋白采用Western Blot 檢測(cè)瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)的MAPKs 信號(hào)通路活化的影響。結(jié)果如圖9所示，LPS 刺激后巨噬細(xì)胞RAW264.7 內(nèi)JNK、ERK 與p38 磷酸化水平明顯升高，提示LPS 通過(guò)巨噬細(xì)胞系RAW264.7 中MAPKs 家族激酶活化引起細(xì)胞炎癥反應(yīng)，這與前人的研究一致[29-31]。采用瓊膠寡糖預(yù)處理后，LPS 誘導(dǎo)的MAKP 家族激酶JNK、ERK 以及p38 的磷酸化水平均顯著降低。研究認(rèn)為，ERK、p38 與JNK 激活參與了LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的增加、TNF-α 基因的表達(dá)，阻斷這3 條MAPK 通路中的任何一條都足以抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，從而減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)[32]。大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，多糖或寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的抗炎作用與MAPK 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻斷密切相關(guān)。Lu 等[32]從茯苓多糖根莖中分離純化出SGP-1 和SGP-2 兩個(gè)組分，探討其是否通過(guò)MAPK 途徑抑制LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 的炎癥，結(jié)果表明，SGP-1 和SGP-2 對(duì)促炎介質(zhì)的抑制作用是通過(guò)ERK 和JNK 途徑實(shí)現(xiàn)的。Ma 等[33]研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖抑制了LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中p38、ERK、JNK 磷酸化，可能是殼寡糖抑制LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-6 和TNF-α 過(guò)度產(chǎn)生的原因。與此類(lèi)似，由本文上述的研究結(jié)果可知，瓊膠寡糖能夠降低LPS 誘導(dǎo)的JNK、ERK 以及p38/MAKP 家族激酶的磷酸化水平，其對(duì)這3條MAPK 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的阻斷作用可能是上述炎癥反應(yīng)減緩的原因所在。

圖9 瓊膠寡糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞中MAPKs 活化的影響Fig.9 Activation of MAPKs in LPS - simulated RAW264.7 via agar-oligosaccharides

3 結(jié)論

本文研究瓊膠寡糖對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 的炎癥反應(yīng)的抑制作用及機(jī)制。結(jié)果表明，瓊膠寡糖在測(cè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0～250 μg/mL） 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力無(wú)顯著影響，能夠提高LPS 刺激后RAW264.7 細(xì)胞活力，劑量依賴(lài)性地抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中NO、TNF-α 和ROS 的生成，減輕炎癥反應(yīng)，從而證實(shí)了其在預(yù)防治療炎癥性疾病中的可能性。同時(shí)，LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)主要通過(guò)MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起JNK、ERK、p38 等MAPK 家族激酶的磷酸化水平顯著升高。采用瓊膠寡糖預(yù)處理后，LPS 誘導(dǎo)的JNK、ERK、p38 等MAPK 家族激酶的磷酸化水平被明顯抑制，提示瓊膠寡糖可通過(guò)抑制LPS 介導(dǎo)的MAPKs 信號(hào)通路的激活發(fā)揮抗炎作用。本研究的結(jié)果可為豐富瓊膠寡糖的食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)理論基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)預(yù)防和輔助降低炎癥反應(yīng)的健康食品提供科學(xué)依據(jù)。未來(lái)仍需進(jìn)一步研究瓊膠寡糖發(fā)揮抗炎作用的特征結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞膜識(shí)別受體，定向設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)具有高活性抗炎作用的瓊膠寡糖產(chǎn)物。