陽(yáng)建超，程兆瑞，喻 超，張 艾，劉興貴

(貴州醫(yī)科大學(xué)a.臨床醫(yī)學(xué)院; b.附屬醫(yī)院肝膽外科，貴陽(yáng) 550004)

肝細(xì)胞癌(HCC)是全世界發(fā)病較高的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已成為全球第三大惡性腫瘤疾病[1]，與肝細(xì)胞癌相關(guān)的死亡率有逐年上升趨勢(shì)[2]，這主要因?yàn)楦伟┗颊叽蠖嘣谕砥诓疟淮_診，現(xiàn)有的治療措施有限且治療效果較差[3]。目前HCC的主要發(fā)病因素包括病毒性肝炎、攝入黃曲霉素等有毒物質(zhì)、非酒精性脂肪性肝炎、酒精相關(guān)性肝病等[4-5]。近年來(lái)，雖然根治性手術(shù)(如肝切除術(shù)和肝移植)和姑息治療(分子靶向治療和免疫治療)是治療HCC患者的常用方法，但HCC發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的概率極高并最終導(dǎo)致預(yù)后不良[6]。因此，尋找一種有效的特異性標(biāo)志物來(lái)確定肝癌患者的預(yù)后具有重要意義。

DNA聚合酶α亞基B(POLA2)是DNA聚合酶(pols)α、δ和ε家族成員之一，主要參與DNA聚合酶α引物酶復(fù)合物與細(xì)胞復(fù)制機(jī)制相偶聯(lián)的活動(dòng)，在染色體DNA復(fù)制、修復(fù)、重組及調(diào)控細(xì)胞周期發(fā)揮了重要作用[7-8]。WILLIS等[9]研究發(fā)現(xiàn)，POLA2可作為卵巢癌發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素并與患者不良預(yù)后相關(guān)。KOH等[10]發(fā)現(xiàn)POLA2是厄洛替尼的一種新型互補(bǔ)靶蛋白，在臨床上可以作為評(píng)估非小細(xì)胞肺癌患者耐藥性的標(biāo)志物,并且敲低POLA2可抑制厄洛替尼耐藥株H1299的增殖能力。本研究擬基于腫瘤基因組圖譜(TCGA)和腫瘤免疫評(píng)估資源(TIMER)數(shù)據(jù)庫(kù)探討POLA2在肝癌中的潛在作用及機(jī)制，并為肝癌提供新的標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人正常肝細(xì)胞LO2和人肝癌細(xì)胞株Hep3B、Huh-7細(xì)胞均購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司，胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司。POLA2基因和內(nèi)參GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)完成，POLA2基因上游序列：5′-AGTTGGGTGGGAAAGGAG-3′、下游序列：5′-GCATGGACTGAGAAGCAAG-3′，GAPDH基因上游序列：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游序列：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常肝細(xì)胞LO2和人肝癌細(xì)胞株Hep3B、Huh-7細(xì)胞均用含15%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)人正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞中POLA2基因的表達(dá)水平

收集人肝癌細(xì)胞Hep3B和Huh-7細(xì)胞及正常肝細(xì)胞LO2，分別加入1 mL Trizol，吹打靜止10 min。先后加入氯仿、異丙醇，并于12 000 r·min-1離心15 min，棄去上清液。RNA沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌后，加入25 mL無(wú)酶水稀釋，測(cè)量RNA濃度，根據(jù)TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)POLA2基因的表達(dá)量。POLA2基因以GAPDH為內(nèi)參，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔct值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)POLA2表達(dá)水平和臨床數(shù)據(jù)收集

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cancergenome.nih.gov/)下載HCC患者POLA2 mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料信息，用R軟件(v3.6.3)和Perl語(yǔ)言處理并整合數(shù)據(jù)，共得到374例肝癌和50例正常肝組織的數(shù)據(jù)。將374例肝癌以POLA2 mRNA表達(dá)量中位值為界,分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.5 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估POLA2對(duì)HCC免疫浸潤(rùn)的影響

通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cistrome.shinyapps.io/timer)，評(píng)估腫瘤-免疫相互作用的分子特征，計(jì)算在HCC中POLA2表達(dá)水平與六種腫瘤浸潤(rùn)性免疫亞群(CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)豐度的相關(guān)性。

1.6 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析POLA2蛋白的表達(dá)

選取人類蛋白表達(dá)圖譜(HPA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/)中免疫組織化學(xué)抗體(HPA037570)，分析肝癌組織和正常肝組織中POLA2蛋白的表達(dá)及染色程度。

1.7 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌中POLA2共表達(dá)基因及富集分析

利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，以|cor|>0.4和P<0.05為閾值，用R軟件“stat”包分析肝癌中POLA2的共表達(dá)基因，以FDR<0.2和P<0.05為閾值，“cluster Profiler”包進(jìn)行基因本體(GO)生物功能及京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析，“ggplot2”包可視化結(jié)果。用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)構(gòu)建與POLA2蛋白互相作用的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R(v3.6.3)和IBM SPSS Sta-tistics 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。ROC曲線由“pROC”包生成，POLA2基因在肝癌組織與正常肝組織間的表達(dá)差異采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，計(jì)量資料配對(duì)樣本間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，POLA2 mRNA表達(dá)水平與病理參數(shù)之間的相關(guān)性采用Logistic回歸分析，生存分析采用Kaplan-Meier法、單及多因素Cox回歸模型分析。通過(guò)Spearman相關(guān)分析在TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基因表達(dá)校正。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織、癌旁正常組織及肝癌細(xì)胞中POLA2基因表達(dá)水平

Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析顯示，肝癌中POLA2的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織及配對(duì)的肝組織(P<0.001，圖1A—B)；同時(shí)qRT-PCR檢測(cè)顯示，POLA2在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平均顯著高于正常肝細(xì)胞(P<0.05，圖1C)；T分期中T3+T4期患者POLA2的表達(dá)水平顯著高于T1+T2期患者(P<0.05，圖1D)；臨床分期中Ⅲ+Ⅳ期患者POLA2的表達(dá)水平顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05，圖1E)；POLA2診斷肝癌的ROC曲線下面積為0.954(圖1F)。

A：POLA2在正常肝組織與肝癌組織中的表達(dá);B：POLA2在肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)；C：POLA2在正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞中的表達(dá)；*P<0.05，**P<0.001。

2.2 POLA2蛋白在肝癌組織中呈高表達(dá)

根據(jù)HPA(https://www.proteinatlas.org/ENSG00000014138-POLA2/pathology/liver+cancer#img)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示POLA2主要在肝癌細(xì)胞核表達(dá)，肝癌組織中POLA2蛋白表達(dá)水平顯著高于正常肝組織。見(jiàn)圖2。

A：POLA2在正常肝組織中的表達(dá)；B：POLA2在肝癌組織中的表達(dá)。

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中POLA2表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Logistic回歸分析顯示，POLA2高表達(dá)與臨床分期、T分期、組織學(xué)分級(jí)、患者年齡、甲胎蛋白(AFP)水平及是否伴血管侵犯密切相關(guān)(P<0.05或P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 POLA2表達(dá)水平與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

2.4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中POLA2高表達(dá)與肝癌患者不良預(yù)后有關(guān)

Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)POLA2基因高表達(dá)的總生存率(OS)(P=0.005)、特異性生存率(DSS)(P=0.016)和無(wú)進(jìn)展生存率(PFI)(P=0.041)均顯著降低(圖3A—C)。單因素Cox回歸顯示，臨床分期、T分期以及POLA2表達(dá)水平可有效地預(yù)測(cè)肝癌患者的生存狀態(tài)(P<0.01)；多因素Cox回歸顯示，POLA2表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)(P<0.01)，可成為預(yù)測(cè)肝癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子，見(jiàn)表2。

t/個(gè)月 t/個(gè)月 t/個(gè)月

表2 肝癌預(yù)后影響因素單、多因素Cox回歸分析

2.5 肝癌POLA2共表達(dá)基因功能富集分析

為了探究肝癌中POLA2基因的潛在分子機(jī)制，本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了共表達(dá)基因功能富集分析，以Pearson相關(guān)系數(shù)>0.4且P<0.05作為篩選條件，結(jié)果顯示與POLA2正相關(guān)的基因有5143個(gè)，熱圖展示了前50個(gè)與POLA2正相關(guān)的共表達(dá)基因(圖4A)；選取前400個(gè)共表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示共表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和范可尼貧血通路，其主要的分子功能是保持DNA解旋酶的活性和DNA依賴的ATP酶的活性(圖4B)。

A：POLA2共表達(dá)基因熱圖；B：POLA2生物學(xué)功能富集分析。

2.6 POLA2表達(dá)水平與肝癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平相關(guān)

本研究先基于Spearman相關(guān)分析POLA2的表達(dá)水平(TPM)與免疫細(xì)胞富集水平(由ssGSEA產(chǎn)生)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)與POLA2正相關(guān)系數(shù)最高的是Th2細(xì)胞(r=0.632、P<0.01，圖5A—B)。然后利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析了POLA2表達(dá)水平與HCC免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明POLA2的表達(dá)與腫瘤純度、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和B細(xì)胞呈顯著正相關(guān)(均P<0.05，圖5C)。本研究進(jìn)一步分析了HCC組織中POLA2表達(dá)與免疫細(xì)胞表面標(biāo)記物之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，POLA2表達(dá)與B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、Th2細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)顯著相關(guān)(均P<0.05，表3)。

A—B：POLA2表達(dá)水平與TH2細(xì)胞富集程度的相關(guān)性；C.POLA2與肝癌免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性。

表3 HCC組織中POLA2表達(dá)與免疫細(xì)胞表面標(biāo)記物之間的相關(guān)性

3 討論

肝癌與全世界高死亡率有關(guān)。盡管醫(yī)學(xué)技術(shù)高速發(fā)展，肝癌的高復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍無(wú)法解決。預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物在癌癥診斷和治療中表現(xiàn)出光明前景，他們可以幫助預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后，以改善臨床治療決策并篩選出對(duì)特定治療最有效的患者。因此，尋找可靠的預(yù)后標(biāo)志物對(duì)肝癌的診斷和治療具有重要意義[11]。近年來(lái)，生物信息學(xué)技術(shù)為腫瘤的診斷和治療提供重要的生物標(biāo)志物，可以幫助分析肝癌基因?qū)用娴淖兓?探究肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制,并為其治療提供理論參考。

POLA2是POLα其中的一個(gè)亞基，在參與DNA復(fù)制的起始、DNA修復(fù)、同源重組中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。有研究[12-13]表明，POLA2的缺失會(huì)影響DNA延伸能力，從而導(dǎo)致DNA雙鍵斷裂形成外源性DNA損傷。同時(shí)，NHEJ(非同源末端連接)和HR(同源重組)修復(fù)途徑在調(diào)控細(xì)胞周期具有重要作用，POLA2的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞HR或NHEJ修復(fù)功能缺陷，從而DNA解旋后因無(wú)法延伸而引發(fā)基因組的毒性應(yīng)激。因此，POLA2在維持基因組完整性和調(diào)控細(xì)胞周期方面都發(fā)揮了重要作用,POLA2表達(dá)失調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞增殖以及腫瘤發(fā)生。

研究顯示POLA2參與了多種腫瘤(膀胱癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、胃腸道間質(zhì)瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程并作為患者預(yù)后標(biāo)志物。DANG等[12]的研究表明，POLA2在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)顯著上調(diào)并且與患者較差的生存率有關(guān)；CAO等[14]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，POLA2可作為膀胱癌的致癌因子促進(jìn)腫瘤的血管新生和細(xì)胞分裂導(dǎo)致患者不良預(yù)后；ALBOGAMI等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中下調(diào)POLA2可在體外抑制乳腺癌細(xì)胞DNA的復(fù)制能力。目前POLA2基因已被證實(shí)對(duì)各種癌癥的預(yù)后有顯著的影響，本研究結(jié)合多種生物信息學(xué)方法，證實(shí)了POLA2在肝癌組織中的表達(dá)水平高于正常肝組織及配對(duì)的癌旁組織，在蛋白水平上同樣驗(yàn)證了POLA2在肝癌組織中高表達(dá)。利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了POLA2在肝癌細(xì)胞株Hep3B、Huh-7中表達(dá)水平同樣高于人正常肝細(xì)胞株LO2。ROC曲線分析顯示POLA2對(duì)肝癌具有較高的診斷價(jià)值，這些結(jié)果表明POLA2是一個(gè)診斷肝癌的潛在分子靶標(biāo)。進(jìn)一步探究POLA2與肝癌患者臨床特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，POLA2的高表達(dá)與患者OS、DSS、PFI相關(guān)，單、多因素Cox回歸和Logistic回歸結(jié)果顯示POLA2表達(dá)水平與肝癌患者臨床分期、組織學(xué)分級(jí)以及T分期密切相關(guān)，這些結(jié)果均表明POLA2可能是HCC的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。為了尋找POLA2在肝癌中可能發(fā)揮的作用機(jī)制，本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行POLA2共表達(dá)基因篩選，篩選前400個(gè)共表達(dá)基因進(jìn)行了GO/KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)其可能的機(jī)制是通過(guò)影響細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和范可尼貧血通路而導(dǎo)致了肝癌的發(fā)生發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)POLA2表達(dá)水平與HCC中多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)，其中與Th2具有顯著正相關(guān)，Th1/Th2漂移一直與HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)并導(dǎo)致患者預(yù)后不良[16]，因此POLA2可能通過(guò)上調(diào)Th2細(xì)胞浸潤(rùn)水平促使肝癌的惡性進(jìn)展。更重要的是POLA2與腫瘤純度、B細(xì)胞浸潤(rùn)、CD4+和CD8+、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞也呈顯著正相關(guān)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)POLA2表達(dá)水平與B細(xì)胞標(biāo)志物、Th2細(xì)胞標(biāo)志物、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞標(biāo)志、中性粒細(xì)胞標(biāo)志物、巨噬細(xì)胞標(biāo)志物、耗竭T細(xì)胞標(biāo)志物等仍然具有顯著相關(guān)性，這表明POLA2可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平并幫助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸而影響HCC患者預(yù)后。

綜上所述，POLA2在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且其表達(dá)與患者臨床病理信息、預(yù)后以及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平具有相關(guān)性。因此，可以推測(cè)POLA2具有作為診斷肝癌并預(yù)測(cè)患者預(yù)后的分子標(biāo)記物的潛力，雖然本研究使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)POLA2基因在肝癌中的作用進(jìn)行探索，但未進(jìn)行臨床樣本收集及細(xì)胞水平驗(yàn)證，后期將在肝癌細(xì)胞系中進(jìn)行其生物學(xué)功能及機(jī)制的研究，為肝癌的診斷和預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物。