馬 芮 劉文義 余紅仕 周立峰 胡加付

(浙江農(nóng)林大學(xué) 杭州 311300)

擬松材線蟲(Bursaphelenchusmucronatus)是一種松樹寄生線蟲，與外來物種松材線蟲(B.xylophilus)同屬于松材線蟲病害系統(tǒng)，已在國內(nèi)外造成嚴(yán)重的生態(tài)損失及經(jīng)濟(jì)損失(湯勤等， 1989； 張治宇等， 2004； 湯堅(jiān)等， 2008； Sultanaetal., 2013)。過去對擬松材線蟲病害沒有引起足夠的重視，但近年來越來越多的研究報告顯示擬松材線蟲也具有較高的致病性(陳鳳毛等， 2010； 周立峰， 2017； 薛美靜等， 2019)。高效頻繁的交配行為是擬松材線蟲和松材線蟲快速繁殖及病蟲害發(fā)生的基礎(chǔ)，研究其交配繁殖機(jī)制有著深遠(yuǎn)的意義(徐紅梅等， 2017； Liuetal., 2019)。迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于擬松材線蟲的研究多側(cè)重于與松材線蟲的比較鑒定，而關(guān)于擬松材線蟲交配繁殖學(xué)的研究較少，特別是關(guān)于擬松材線蟲交配繁殖分子機(jī)制的研究。本課題組前期對擬松材線蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，在擬松材線蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到了21個與線蟲交配繁殖有關(guān)的G蛋白α亞基(Gα)家族成員，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示Bmu-gpa-1基因在擬松材線蟲交配前后表達(dá)差異顯著，且表達(dá)模式具有雌、雄蟲差異性，這為筆者探究擬松材線蟲的交配繁殖分子機(jī)制提供了依據(jù)。

G蛋白，即鳥苷酸結(jié)合蛋白，由α、β和γ這3個亞基構(gòu)成，是一類重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，普遍存在于真核生物細(xì)胞中(周寶宏，1989)。G蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)聯(lián)系胞內(nèi)信號通路的關(guān)鍵蛋白，在線蟲的生長發(fā)育、運(yùn)動取食、交配繁殖等方面發(fā)揮著重要作用( Tall, 2002； Reynoldsetal., 2004)。模式生物秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中共有21個Gα、2個Gβ及2個Gγ(Cuppenetal., 2003； Jansenetal., 1999)，其中Gα是激活G蛋白信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵亞基，是主要的受體接觸位點(diǎn)及GTP結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)化學(xué)信號激活GPCRs后，GPCRs會誘導(dǎo)G蛋白的α亞基與β、γ亞基，導(dǎo)致GDP解離，最終結(jié)合GTP并激活下游效應(yīng)蛋白，參與線蟲的各種生理活動(Mendeletal., 1996； Yoshidaetal., 2012)。

在秀麗隱桿線蟲中，整個gpa基因家族均參與線蟲的化學(xué)感應(yīng)系統(tǒng)，除gpa-12外其余的gpa基因都在化學(xué)感應(yīng)神經(jīng)元上集中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，多個gpa基因可以在同一個神經(jīng)元中共表達(dá)，比如gpa-2、gpa-3、gpa-5、gpa-6、gpa-13及odr-3基因在AWC神經(jīng)元中表達(dá)，可以負(fù)向調(diào)控線蟲的感知系統(tǒng)。另外，同一個基因也可在多個神經(jīng)元上表達(dá)，比如gpa-3基因可以在ASE、AWA神經(jīng)元和ADL神經(jīng)元上表達(dá)；gpa-1基因可以在ADL、ASH、ASI、ASJ、PHA、PHB神經(jīng)元及雄蟲尾部的特定p.c.s.神經(jīng)元中表達(dá)，調(diào)節(jié)線蟲對于氯化鈉、異戊醇和乙醇等化學(xué)物質(zhì)的趨向躲避行為以及雄性線蟲的交配行為(Afsharetal., 2004)。研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)雄性秀麗隱桿線蟲的gpa-1基因，其性功能急劇下降，出現(xiàn)尾部翻轉(zhuǎn)異常、交合刺插入困難等現(xiàn)象，但干擾沉默該基因卻未發(fā)現(xiàn)異常(Jansenetal., 1999； Lansetal., 2004)。

為了探究擬松材線蟲種內(nèi)交配繁殖機(jī)制，本文對擬松材線蟲Bmu-gpa-1基因進(jìn)行了功能分析。通過生物信息學(xué)分析，概括其與其他種屬線蟲的親緣關(guān)系，明確進(jìn)化地位； 利用原位雜交、轉(zhuǎn)錄組測序分析及實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)研究該基因的表達(dá)特性，確定其在線蟲交配前后及不同性別上的表達(dá)差異性； 采用RNA干擾技術(shù)對Bmu-gpa-1的生物學(xué)功能進(jìn)行研究，明確其在線蟲交配行為及繁殖力上的作用，這即可為進(jìn)一步探究G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在線蟲中的功能提供參考，也可為揭示2種線蟲的種間競爭機(jī)理提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲培養(yǎng)

供試擬松材線蟲由安徽省南陵市罹病馬尾松中分離獲得，25 ℃避光條件下在灰葡萄孢(Botrytiscinerea)菌苔上培養(yǎng)。用貝爾曼漏斗法收集大量懷卵雌蟲，使其避光產(chǎn)卵1 h，可獲得同步胚胎，孵育29 h后可獲得同步2齡(J2)幼蟲。將同步J2幼蟲接入灰葡萄孢中，25 ℃培養(yǎng)35、62、82 h，即可獲得同步生長的3齡(J3)幼蟲、4齡(J4)幼蟲及成蟲。收集同步J4蟲，根據(jù)性別形態(tài)差異挑選雌、雄蟲，分別飼養(yǎng)至成蟲，即可獲得未交配的雌、雄成蟲。

1.2 Bmu-gpa-1基因克隆與序列分析

使用TRIZOL法提取擬松材線蟲總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara)將擬松材線蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增引物為Bmu-gpa-1-NF: 5′-GGCGTATCA ATGACTCTA-3′，Bmu-gpa-1-NR:5′-TTGTATCCATG ACCGAAT-3′，擴(kuò)增體系及條件參照Zhou等(2020)前期報道。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆在pGEM?-TEasy載體上，送往北京擎科生物有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果利用NCBI保守域數(shù)據(jù)庫確定其保守結(jié)構(gòu)域，使用DNAMAN8軟件進(jìn)行氨基酸序列比對，通過 MEGA 7.0鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。在SWISS MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org)網(wǎng)站上預(yù)測編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)，并利用ExPASy(https:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白質(zhì)分子量、親水性及穩(wěn)定性。

1.3 Bmu-gpa-1表達(dá)模式研究

利用熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)分析Bmu-gpa-1基因在擬松材線蟲不同發(fā)育時期的表達(dá)水平，利用原位雜交技術(shù)在mRNA水平上研究該基因在線蟲不同發(fā)育時期的表達(dá)部位，明確其時空表達(dá)特性。RT-qPCR引物為Bmu-gpa-1-qF:5′-TAAAAC GGCCAAAAAGCGCA-3′，Bmu-gpa-1-qR:5′-TCTCTT TATTGCGACGGGCA-3′，內(nèi)參基因選擇18S及TUB(周立峰， 2017)，具體步驟參照Zhou等(2020)前期報道。

1.4 Bmu-gpa-1生物學(xué)功能分析

1.4.1 dsRNA合成及RNAi浸泡試驗(yàn) 使用MEGAscript ?試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成dsRNA。引物為Bmu-gpa-1-iF： 5′-TAATACGACTC ACTATAGGGAGAGGCGTATCAATGACTCTA-3′，Bmu-gpa-1-iR： 5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGATTGT ATCCATGACCGAAT-3′。將5 μL的擬松材線蟲混懸液放入15 μL的Bmu-gpa-1-dsRNA干擾液中黑暗浸泡處理30 h，再將2批等量的線蟲分別轉(zhuǎn)移至15 μL的gfp-dsRNA干擾液和15 μL不含有dsRNA的緩沖液中黑暗浸泡處理30 h，作為對照組。每組均含有3 μL的M9 Buffer，干擾液中的dsRNA終濃度為0.5 μg·μL-1，最后用ddH20定容(陳莎妮等， 2021)。

1.4.2Bmu-gpa-1干擾效率檢測 提取對照組、處理組線蟲的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測各個發(fā)育階段擬松材線蟲的RNAi效率，每次重復(fù)4組，共3次。

1.4.3 交配行為測定 收集未交配的同步雌、雄蟲，按照對照組(1條正常雌蟲+1條正常雄蟲)、雌蟲組(1條干擾后雌蟲+1條正常雄蟲)、雄蟲組(1條正常雌蟲+1條干擾后雄蟲)設(shè)置不同試驗(yàn)組，每次試驗(yàn)重復(fù)8組，共3次。觀察記錄每組線蟲在交配高峰期(8 h)內(nèi)的交配時長及交配次數(shù)，24 h后進(jìn)行胚胎計數(shù)。計算每組線蟲的交配率(交配組數(shù)/試驗(yàn)總組數(shù))、平均交配次數(shù)(交配總次數(shù)/交配組數(shù))、平均交配時長(交配總時長/交配組數(shù))、有效交配率(產(chǎn)卵組數(shù)/交配組數(shù))、平均產(chǎn)卵量(產(chǎn)卵總量/有效交配組數(shù))等參數(shù)，用以評估每組線蟲的交配能力及繁殖能力(趙雙修， 2016； 徐紅梅等， 2017)。本研究中，正確交配行為定義為： 雄蟲的交合刺準(zhǔn)確插入雌蟲的陰戶，持續(xù)時長不低于1 min。有效交配行為定義為： 擬松材線蟲正確交配，并產(chǎn)下后代(趙雙修， 2016)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bmu-gpa-1基因的克隆與序列

擬松材線蟲Bmu-gpa-1全長1 780 bp，其中CDS為1 065 bp，編碼354個氨基酸。ExPASy-ProtParam tool預(yù)測基因編碼蛋白的分子式為C1822H2918N492O536S17，具有親水性，不穩(wěn)定指數(shù)(instability index,Ⅱ)為47.4，是一類不穩(wěn)定蛋白。NCBI Conserved Domains預(yù)測其主要功能區(qū)為G1-5box、SwitchⅠ-Ⅱregions，它們是GTP結(jié)合位點(diǎn)、Gβγ和下游效應(yīng)器的結(jié)合位點(diǎn)，在各種生理活動中起調(diào)節(jié)的作用，如圖1A所示。在SWISS MODEL上預(yù)測其編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)圖如圖1中D1、D2所示。結(jié)果顯示該基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)與典型的異三聚體G蛋白晶體結(jié)構(gòu)1got.1最為相似，GMQE為0.74，QMEAN為0.70±0.05，蛋白序列一致性為44.06%，這表明預(yù)測結(jié)果可信度較高，蛋白模型匹配度較好，該基因編碼蛋白屬于G蛋白家族(Lambrightetal., 1996)。利用 DNAMAN軟件將Bmu-gpa-1基因所編碼的氨基酸序列與Bursaphelenchusxylophilus(CAD5232120.1)、Caenorhabditiselegans(NP_505840.1)、Caenorhabditisbriggsae(XP_002636462.1)、Strongyloidesstercoralis(AAK54043.1)、Strongyloidesratti(XP_024503395.1)、Loaloa(XP_003135770.1)、Brugiamalayi(CDP98783.1)及Brugiatimori(VDO30356.1)的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對。結(jié)果如圖1B所示，Bmu-gpa-1基因的氨基酸序列與不同物種的gpa-1基因的氨基酸序列具有較高的保守性。利用MEGA軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。該進(jìn)化樹包含Bursaphelenchus、Strongyloides、Brugia等屬，涉及了13個物種。結(jié)果如圖1C所示： 擬松材線蟲Bmu-gpa-1與其他線蟲的gpa-1氨基酸序列聚類在一起，與另一個Gα基因egl-30氨基酸序列區(qū)別開來，表明Bmu-gpa-1基因與其他物種的gpa-1基因歸屬于同一個基因家族，區(qū)別于其他Gα基因。其中，Bmu-gpa-1基因與松材線蟲gpa-1基因、秀麗隱桿線蟲gpa-1基因親緣關(guān)系較近，這為Bmu-gpa-1基因的生物學(xué)研究提供了參考。

2.2 Bmu-gpa-1基因的時空表達(dá)特性

擬松材線蟲轉(zhuǎn)錄組測序分析及RT-qPCR結(jié)果如圖2A、2B所示： 2組結(jié)果相一致，均表明Bmu-gpa-1基因在擬松材線蟲J2及J3的表達(dá)量最高，與其他齡期相比差異顯著(P<0.05)，J4及成蟲期表達(dá)量最低，且雄蟲的基因表達(dá)水平顯著高于雌蟲，基因表達(dá)模式具有雌、雄蟲差異性。這說明Bmu-gpa-1基因可能在擬松材線蟲J2、J3時期發(fā)揮著重要的作用； 在時間上，隨著線蟲的發(fā)育，基因表達(dá)水平由低到高再到低變化。

原位雜交結(jié)果如圖3所示，具體表達(dá)特性為： 隨著胚胎發(fā)育，表達(dá)部位由散點(diǎn)至全胚胎變化(圖A-D)，J2時期全身表達(dá)(圖E)、在J3時期的腸道、體壁肌肉及生殖原基處表達(dá)(圖F)、在J4雌、雄蟲的性腺表達(dá)(圖G、H)。在成蟲期，雌、雄差異表達(dá)： 雌蟲只在陰戶部位表達(dá)(圖I)，雄蟲在交合刺及尾部表達(dá)(圖J)。這說明Bmu-gpa-1在擬松材線蟲各個發(fā)育階段均有表達(dá)，且隨著線蟲的發(fā)育，基因表達(dá)部位從局部到全身再到局部變化，在成蟲期雌、雄差異表達(dá)。由此筆者推測，在線蟲的發(fā)育初期多部位表達(dá)的Bmu-gpa-1可能與線蟲早期的生長發(fā)育有關(guān)，而在線蟲的發(fā)育后期集中于性腺及尾部表達(dá)的Bmu-gpa-1可能與線蟲后期的生殖發(fā)育有關(guān)，參與調(diào)控擬松材線蟲的交配繁殖行為。

圖1 Bmu-gpa-1生物信息學(xué)分析Fig. 1 Bioinformatics analysis of Bmu-gpa-1A: Bmu-gpa-1保守結(jié)構(gòu)域； B： Bmu-gpa-1基因序列比對； C： Bmu-gpa-1系統(tǒng)發(fā)育分析。采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自檢次數(shù)為1 000次，分支數(shù)字表示支持率； D1、D2： Bmu-gpa-1蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)。A： The conservative domain of Bmu-gpa-1 B: The sequence alignment of Bmu-gpa-1; C: Phylogenetic analysis of Bmu-gpa-1. The phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining method with 1 000 self-checks, and the branch number indicated the support rate; D1，D2: The protein structure of Bmu-gpa-1.

圖2 Bmu-gpa-1基因在擬松材線蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)水平Fig. 2 Expression level of Bmu-gpa-1 in different stages of B. mucronatusA： 轉(zhuǎn)錄組分析； B： 實(shí)時熒光定量PCR測量； Embryo： 胚胎期； J2： 2齡時期； J3： 3齡時期； F-J4： 雌蟲4齡時期； M-J4： 雄蟲4齡時期； V-F-A： 未交配雌蟲成蟲期； V-M-A： 未交配雄蟲成蟲期； M-F-A： 已交配雌蟲成蟲期； M-M-A： 已交配雄蟲成蟲期。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。A: Transcriptome analysis; B: RT-qPCR; Embryo: Embryonic stage; J2: The second stage of juvenile; J3: The third stage of juvenile; F-J4: The fourth stage of female juvenile; M-J4: The fourth stage of male juvenile; V-F-A: The adult stage of virgin female; V-M-A: The adult stage of virgin male; M-F-A: The adult stage of mated female; M-M-A: The adult stage of mated male. Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level. The same below.

2.3 Bmu-gpa-1生物學(xué)功能

2.3.1Bmu-gpa-1基因的RNA干擾效率分析 與對照組擬松材線蟲(試驗(yàn)體系不含有dsRNA)相比，另一對照組(試驗(yàn)體系含有g(shù)fpdsRNA)線蟲的Bmu-gpa-1基因表達(dá)略有下降，但差異不顯著，而處理組(試驗(yàn)體系含有Bmu-gpa-1dsRNA)的擬松材線蟲各齡期Bmu-gpa-1基因表達(dá)量均顯著降低，表達(dá)水平均減少50%以上(圖4)，表明經(jīng)RNAi處理后，擬松材線蟲各齡期的Bmu-gpa-1基因表達(dá)水平受到顯著抑制。

圖3 Bmu-gpa-1原位雜交Fig. 3 In-situ hybridization of Bmu-gpa-1處理組: A. 囊胚期胚胎； B. 原腸期胚胎； C. 蠕蟲期胚胎； D. 1齡幼蟲； E. 2齡幼蟲； F. 3齡幼蟲； G. 4齡雌蟲； H. 4齡雄蟲； I. 雌性成蟲； J. 雄性成蟲； K. 雄性成蟲交合部位。對照組. L. 原腸期胚胎； M. 雄性成蟲； m. 食道球； v. 陰戶； sp. 交合刺； an. 肛門。Treatment: A. Blastosphere; B. Gastrulae; C. Worm embryo; D. The first stage of juvenile; E. The second stage of juvenile; F. The third stage of juvenile; G. The fourth stage of female juvenile; H. The fourth stage of male juvenile; I. The female adult; J. The male adult; K. The copulative site of male adult. Control. L. Gastrulae; M. The male adult; m. Metacorpus; v. Vulva; sp. Spicules; an. Anus.

圖4 利用熒光定量PCR分析RNAi效率Fig. 4 The RNAi efficiency quantified by RT-qPCREmbryo： 胚胎期； J2： 2齡時期； J3： 3齡時期； J4： 4齡時期； Adult： 成蟲期。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Embryo: Embryo; J2: The second stage of juvenile; J3: The third stage of juvenile; J4: The fourth stage of juvenile; Adult: The adult stage. Different lowercase letters mean significant difference at 0. 05 level.

2.3.2Bmu-gpa-1基因?qū)M松材線蟲交配繁殖行為的影響 按照方法1.4.3進(jìn)行試驗(yàn)，交配行為測定結(jié)果如表1所示： 對照組中，68.75%的擬松材線蟲在8 h內(nèi)完成交配，每組平均交配1.05次，平均交配時長為22.14 min，其中83.45%的交配行為是有效交配行為，平均每組雌蟲產(chǎn)14.28顆卵。干擾雄蟲組中，82.29%的線蟲存在交配行為，每組平均交配1.47次，平均交配時長持續(xù)約15.19 min，但只有59.54%的交配行為屬于有效交配行為，且平均每組雌蟲產(chǎn)卵8.07顆。與對照組相比，干擾雄蟲組的線蟲交配次數(shù)顯著增加，交配時長顯著縮短，且繁殖力明顯下降，但干擾雌蟲組的線蟲卻無顯著變化。推測Bmu-gpa-1基因可以調(diào)控擬松材線蟲雄蟲的交配行為，干擾該基因可使雄蟲興奮程度提高，表現(xiàn)出頻繁快速低效的交配行為模式。

3 討論

通過對擬松材線蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，篩選出線蟲交配前后差異表達(dá)的Bmu-gpa-1基因，且該基因表達(dá)具有雌、雄蟲差異性。通過生物信息學(xué)分析，筆者明確了Bmu-gpa-1基因?qū)儆贕蛋白α亞基家族，與其他線蟲的Gα具有較高的同源性，且擁有相同的代表性結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示擬松材線蟲gpa-1基因與松材線蟲gpa-1基因位于同一分支，且與秀麗隱桿線蟲gpa-1基因關(guān)系較為緊密，這為筆者研究擬松材線蟲gpa-1基因提供了參考，也為后續(xù)研究擬松材線蟲和松材線蟲種間競爭分子機(jī)制提供了理論支持。

本研究中，擬松材線蟲Bmu-gpa-1基因的原位雜交結(jié)果與實(shí)時熒光定量PCR、轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相一致。結(jié)果顯示該基因在擬松材線蟲各發(fā)育階段均有表達(dá)，發(fā)育初期線蟲全身表達(dá)，表達(dá)量較高，發(fā)育后期則主要在雌蟲陰戶、雄蟲交合刺及尾部特異性表達(dá)，表達(dá)水平較低。筆者推測該基因可能與擬松材線蟲的生長、生殖發(fā)育有關(guān)： J2、J3是線蟲發(fā)育增長最快、形成生殖原基的時期(葉為民等， 1993)，線蟲大量取食以滿足生長發(fā)育需求，此階段的Bmu-gpa-1基因可能更多地在生長發(fā)育方面發(fā)揮作用，基因表達(dá)較高較廣； 而線蟲到了J4及成蟲時期，線蟲體內(nèi)含有較多顆粒營養(yǎng)物質(zhì)，足以維持正常的生長發(fā)育，雌、雄差異表達(dá)的Bmu-gpa-1基因則更多地在線蟲的生殖發(fā)育方面發(fā)揮作用，基因表達(dá)相對較少。研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲的gpa-1基因的表達(dá)水平也具有相似的特性，即各齡期廣泛表達(dá)，表達(dá)水平大致隨著線蟲的發(fā)育而下降，且雄蟲的基因表達(dá)水平顯著高于雌雄同體線蟲。在表達(dá)部位上，秀麗隱桿線蟲也主要在頭感器及尾感器上的ASI、ASJ、ADL、ASH、 PHA、PHB神經(jīng)元及雄蟲交配必需神經(jīng)元p.c.s.上表達(dá)。Jansen(1999)也發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲gpa-1、gpa-7、gpa-13、gpa-15基因也都在雄蟲尾部特定神經(jīng)元特異表達(dá)，這與筆者在擬松材線蟲上取得的研究結(jié)果極為相似。

表1 交配行為測定結(jié)果①Tab.1 Results of mating test

借助于RNAi技術(shù)研究該基因的功能，發(fā)現(xiàn)擬松材線蟲干擾后的雄性成蟲表現(xiàn)出頻繁交配，交配時長縮短及后代數(shù)量減少等交配質(zhì)量下降特征，但對雌蟲影響較弱。這說明gpa-1基因影響雄蟲的交配行為及繁殖能力。在秀麗隱桿線蟲中，過量表達(dá)gpa-1基因可以導(dǎo)致雄蟲性功能急劇下降，雄蟲無法準(zhǔn)確定位雌蟲陰戶，交合刺插入困難，但干擾沉默該基因卻未發(fā)現(xiàn)異常的交配行為(Jansenetal., 1999； Lansetal., 2004)。研究發(fā)現(xiàn)，干擾沉默秀麗隱桿線蟲的另一個Gα基因goa-1出現(xiàn)類似情況，goa-1基因被沉默后，雄蟲的交配效率顯著下降，出現(xiàn)運(yùn)動亢奮、性功能下降、繁殖力降低等現(xiàn)象，Mendel等(1996)認(rèn)為這可能與該基因所表達(dá)的神經(jīng)元、肌肉有關(guān)，這些特定神經(jīng)元、肌肉可以影響線蟲的交配繁殖行為。結(jié)合該基因表達(dá)模式，推測在擬松材線蟲雄蟲交合刺及尾部特異表達(dá)的Bmu-gpa-1基因可以調(diào)節(jié)雄蟲的交配行為系統(tǒng)，維持正常的交配繁殖機(jī)制，保持種群穩(wěn)定。

目前，國內(nèi)外關(guān)于線蟲交配繁殖學(xué)的研究多集中于交配行為的研究，在其遺傳控制機(jī)制方面的研究鮮有報道。本研究通過對擬松材線蟲Bmu-gpa-1基因的表達(dá)特性及生物學(xué)功能研究，為線蟲Gα基因的研究提供方法參照及理論參考，也對揭示擬松材線蟲種內(nèi)交配機(jī)制具有重要意義。同時，國內(nèi)外關(guān)于擬松材線蟲與松材線蟲的種間競爭研究也多集中于繁殖差異性上，進(jìn)一步與姊妹種松材線蟲的比較，可為兩者種間競爭機(jī)制的研究提供依據(jù)，也可為闡明松材線蟲病害機(jī)理及調(diào)控基礎(chǔ)提供重要突破口。

4 結(jié)論

擬松材線蟲Bmu-gpa-1基因是G蛋白α亞基家族中的一員，在擬松材線蟲各發(fā)育階段均有表達(dá)，發(fā)育初期被廣泛表達(dá)，表達(dá)水平較高，發(fā)育后期出現(xiàn)雌、雄蟲差異表達(dá)，表達(dá)水平較低。同時，Bmu-gpa-1基因在功能上也具有雌、雄蟲差異性，對雌蟲影響較弱，但可以影響其交配繁殖行為，這為筆者研究線蟲的種內(nèi)交配分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)，也為擬松材線蟲的病害防治提供了新思路，后續(xù)將繼續(xù)探究Bmu-gpa-1與Bxy-gpa-1的異同及其在種間競爭中發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步揭示擬松材線蟲生態(tài)位喪失及松材線蟲入侵機(jī)制奠定基礎(chǔ)。